趙倩倩 周曉今 陳茹梅
(中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所,北京 100081)
玉米籽粒酵母雙雜交cDNA文庫的構建及ZmSCL1互作因子篩選
趙倩倩 周曉今 陳茹梅
(中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所,北京 100081)
ZmSCL1屬于GRAS家族基因,在玉米籽粒,尤其是胚乳中高表達,而這個時期是玉米灌漿的關鍵時期,鑒于ZmSCL1的分子功能以及其與玉米籽粒發(fā)育的關系尚不明確。利用SMART同源重組交換技術,在酵母菌株AH109中構建了玉米自交系B73授粉后不同時期籽粒的cDNA文庫,利用此文庫篩選了ZmSCL1的互作因子。文庫質量評定結果顯示:cDNA文庫的滴度為1.10×105CFU/mL,文庫的庫容量為1.32×106,文庫的重組率為81.90%,插入片段所編碼的蛋白質長度在133-500個氨基酸之間。最終,獲得了190個陽性克隆。對這些克隆進行測序,利用GO注釋對所篩選的互作因子進行初步分類,并進行功能富集分析。結果顯示ZmSCL1可能參與結合、催化以及營養(yǎng)儲備相關生物過程的調控。
GRAS家族基因;SMART技術;cDNA文庫;ZmSCL1基因
玉米是重要的糧飼兼用作物,我國玉米年均種植面積超約3.3×107hm2,產(chǎn)量超2×108t,是世界第二大玉米生產(chǎn)國。玉米籽粒在授粉后開始發(fā)育,葉片中光合作用產(chǎn)生的淀粉、蛋白質和有機物質儲存在籽粒里的生物學過程,稱為灌漿期。在這一階段,源、庫關系調控植株光合作用產(chǎn)生的碳水化合物從營養(yǎng)器官向籽粒轉移,葉片光合產(chǎn)物的90%運往籽粒,通過一系列蛋白間的相互作用進而調控一系列酶催化,將蔗糖轉化為淀粉。因此,灌漿對于決定玉米籽粒發(fā)育的成敗和產(chǎn)量至關重要[1-2]。
玉米籽粒灌漿速率的研究一直是玉米育種領域的重要科學問題,延長籽粒灌漿持續(xù)時間和加快灌漿速率有利于籽粒中干物質的積累,從而提高籽粒產(chǎn)量[3-6]。提高灌漿速率既可以使玉米利用生長期的有效積溫和水肥營養(yǎng)獲得經(jīng)濟的籽粒產(chǎn)量[7],也可以使籽粒含水量迅速降低避免秋季霜凍帶來的危害。研究發(fā)現(xiàn)植物的糖通過轉運體和輸出載體從母體組織持續(xù)的運出和運入過程中,任何一個環(huán)節(jié)發(fā)生變化都會影響蔗糖的轉運和利用[8-10];并且糖和淀粉代謝酶的活躍程度及相關基因的表達水平的調節(jié)直接影響籽粒庫器官的活力,進而影響籽粒灌漿速率[11-14]。
研究參與和調控籽粒灌漿期生化過程的關鍵基因和調控因子,解析調控籽粒灌漿速率的分子機制,一方面有助于我們了解這一生物學過程的重要信息;另一方面可以為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中培育適應機械化收獲的快速灌漿和快速脫水的玉米品種提供理論指導和技術支撐。
本實驗室根據(jù)B73玉米基因組信息和生物信息學分析預測了在玉米灌漿期籽粒中特異表達的轉錄因子GRAS家族基因,ZmSCL1是其中之一。該基因在玉米籽粒中,尤其是胚乳中高表達,進化樹分析表明其和DELLA亞家族的成員的序列同源性最高[15]。鑒于蛋白質是基因功能的體現(xiàn)者和執(zhí)行者,其表達的時空特異性,及與上下游互作因子的關聯(lián)性是決定其在生命過程中發(fā)揮作用的基礎。為深入研究了解ZmSCL1在灌漿過程中的功能,本研究在分析其基因序列和轉錄水平信息的基礎上,采用SMART cDNA合成技術,通過同源重組方法構建了玉米籽粒灌漿期的酵母雙雜交cDNA文庫,并利用ZmSCL1作為誘餌進行文庫篩選,以期獲得在玉米籽粒灌漿期與ZmSCL1互作的蛋白,為闡明ZmSCL1及其互作相關因子調控籽粒灌漿的分子機制奠定基礎。
玉米自交系B73由本實驗室保存,B73種植在中國農(nóng)業(yè)科學院廊坊基地,取材授粉后12 d、20 d的籽粒材料;pGADT7和pGBKT7空載質粒由本實
驗室保存;RNA提取試劑RNAiso Plus購自TaKaRa公司;Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System User Manual購自 Clontech公司;DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司;酵母菌株AH109,載體pGADT7-Rec購自Clontech公司;YPD Agar Medium購自生工生物;Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids購自BD公司;SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp購自Clontech公司;BactoTMAgar購自BD公司;瓊脂糖購自Amresco公司;引物合成及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.2.1 總RNA的提取 用液氮研磨不同授粉時間12 DAP(Days after pollination)和20 DAP的籽粒,采用RNAiso Plus(TaKaRa公司)提取籽粒總RNA,每1 mL RNAiso Plus試劑提取30 mg樣品;最終將RNA溶解到30 μL 無RNase的水中。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質量。
1.2.2 誘餌載體的構建 將12 DAP和20 DAP的總RNA分別逆轉錄成cDNA,依據(jù)MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中ZmSCL1基因的序列信息設計引物ZmSCL1-BDF/R(ZmSCL1-BDF:5'-CATATGATGGATGCTCACACCAC TCACATTG-3';ZmSCL1-BDR:5'-GGATCCCTACTCC ATGGGTCCATTACGGTTTTC-3')進行PCR擴增,這樣基因的兩端分別帶有BamH I和Xba I兩個限制性內切酶位點,將PCR產(chǎn)物切膠回收,使用BamH I和Xba I雙酶切,回收酶切產(chǎn)物,與經(jīng)相同方式酶切的pGBKT7空載的酶切回收產(chǎn)物進行連接反應,轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α),經(jīng)酶切鑒定和測序分析,獲得pGBKT7-ZmSCL1構建。
1.2.3 AH109菌株感受態(tài)細胞的制備 用YPDA培養(yǎng)基活化和培養(yǎng)酵母AH109菌株,使用美國伯樂公司的分光光度計測定菌液濃度OD600。在YPDA培養(yǎng)基中搖菌,至OD600達到0.15-0.3,700 ×g離心5 min,棄上清,加入新鮮的100 mL YPDA培養(yǎng)基重懸菌液并繼續(xù)培養(yǎng),至OD600達到0.4-0.5,700×g離心收集菌體,并用滅菌水重懸菌體,離心收集,用1.1×TE/LiAc溶液重懸菌體,再次離心收集菌體,最后,制備好的感受態(tài)細胞重懸在1.1×TE/LiAc溶液中。
1.2.4 誘餌融合蛋白的自激活活性鑒定 按照Clontech YeastmakerTMYeast Transformation System 2說明書中的轉化方法,參照趙慧等[16]的轉錄自激活檢測方法,將構建好的誘餌載體質粒pGBKT7-ZmSCL1 0.2 μg 和空載質粒 pGADT7 0.1 μg共轉化酵母感受態(tài)細胞,同時將空載對照pGADT7+pGBKT7、陽性對照pGADT7+pGBKT7-53均按以上質量比進行共轉化。最后將轉化菌體吸取150 μL涂布SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板,30℃溫箱中倒置培養(yǎng)3-5 d觀察結果。
1.2.5 雙鏈cDNA的合成 以0.1-2.0 μg總RNA為模版,以CDS Ⅲ(Oligo-dT)為引物反轉錄合成第一鏈cDNA;以第一鏈cDNA為模版,使用Long distance PCR(LD PCR)擴增合成ds cDNA(擴增程序為95℃ 30 s;95℃ 10 s,68℃ 6 min,20個循環(huán);68℃ 5 min);在1.2%的瓊脂糖凝膠上對PCR產(chǎn)物進行分析(參照Make Your Own “Mate & PlateTM”Library System User Manual使用說明書)。
1.2.6 酵母雙雜交cDNA文庫的構建和篩選 使用制備好的酵母感受態(tài)細胞,參照崔紅軍等[17]的文庫構建方法和楊莎等[18]的酵母共轉化篩選方法,在 600 μL 感受態(tài)細胞中加入 20 μL ds cDNA(5 μg),6 μL pGADT7-Rec(3 μg)質粒載體,5 μL pGBKT7-ZmSCL1(5 μg),20 μL Herring Tests Carrier DNA,輕柔混勻。加入2.5 mL PEG/LiAc溶液,輕柔混勻。30℃孵育45 min且每15 min混勻一次,然后加入160 μL DMSO(用DMSO增強細胞通透性),42℃孵育20 min,且中間每10 min混勻一次,即采用熱激法將誘餌、質粒載體和ds cDNA導入感受態(tài)細胞中,然后700×g離心5 min收集菌體,棄上清,加入3 mL YPD Plus(試劑盒提供)30℃搖床培養(yǎng)90 min,再離心收集菌體,最后用6 mL 0.9% NaCl溶液重懸菌體。轉化后的酵母細胞液,吸取10 μL,按比例1∶100,1∶1 000稀釋,分別涂SD/-Leu平板各兩個,500 μL/板;吸取 100 μL,按比例 1∶10,1∶100,1∶1 000稀釋,分別涂SD/-Leu/-Trp平板各兩個,500 μL/板;將剩下的細胞液涂SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp,500 μL/板。30℃倒置培養(yǎng) 3-5 d。詳見 Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System User Manual使用說明書VⅢ-A。
1.2.7 文庫滴度、重組率和多態(tài)性分析 待上述涂SD/-Leu平板(按比例1∶100,1∶1 000稀釋)上長出單克隆后,統(tǒng)計平板上的菌落計數(shù),參照楊君等[19]的文庫滴度計算方法,計算文庫滴度(文庫滴度(CFU/mL)=每板平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù))。挑SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上的單克隆搖菌培養(yǎng),2-3 d,使用天根酵母質粒提取試劑盒提取酵母質粒DNA,使用pGADT7-Rec載體引物(pGADT7-F:5'-TAATACGACTCACTATAGGGC-3'和pGADT7-R:5'-AGATGGTGCACGATGCACAG-3')進行菌落PCR,根據(jù)擴增結果計算文庫重組率(%)=陽性克隆數(shù)/檢測菌落數(shù)×100%,并分析文庫多態(tài)性。詳見Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System User Manual使用說明書。
1.2.8 ZmSCL1互作因子的篩選和生物信息學分析 參照酵母建庫試劑盒,構建ZmSCL1誘餌載體,并在上述的cDNA文庫中篩選ZmSCL1的互作因子。所篩選的克隆進行測序,除去載體序列,測序長度大于400 bp的DNA片段通過Blast2GO和玉米轉錄本進行同源比對,獲得基因的全長,對這些基因所編碼的蛋白質進行功能注釋和富集分析。Blast2GO的參數(shù)按照軟件說明設置。
基因的時空表達特異性與其參與的功能直接相關。根據(jù)B73玉米基因組信息和生物信息學分析預測了在玉米灌漿期籽粒中特異表達的轉錄因子GRAS家族基因,最終獲得了在胚乳中特異性表達的ZmSCL1。ZmSCL1從授粉后12-24 d持續(xù)高表達(圖1)。這說明ZmSCL1可能參與玉米籽粒,尤其是胚乳的發(fā)育調控。
以玉米籽粒灌漿期ZmSCL1表達量較高的12 DAP和20 DAP籽粒為材料,使用Takara公司的RNAiso Plus試劑,提取籽??俁NA,使用1%瓊脂糖凝膠檢測提取的總RNA質量,如圖2所示,28S和18S rRNA條帶清晰,表明RNA完整性較好;經(jīng)Nano drop測定分析,A260/A280在1.9-2.1之間,濃度約為1-2 μg/μL,這表明RNA無DNA、蛋白質和小分子物質的污染,濃度較高,可用于下一步實驗。
圖1 B73中ZmSCL1的表達譜
圖2 玉米籽??俁NA電泳檢測
將實驗組pGADT7+pGBKT7-ZmSCL1共轉化酵母感受態(tài)細胞,同時設置空載對照組pGADT7+pGBKT7、陽性對照組pGADT7+pGBKT7-53。結果(圖3)顯示,實驗組在SD/-Leu/-Trp平板上有菌落生長,但在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上沒有菌落生長,與空載對照相同。這說明該誘餌基因的融合蛋白沒有自激活活性,可以進行下一步酵母雙雜交互作蛋白的篩選。
以2 μL RNA為模板,反轉錄合成第一鏈cDNA,然后經(jīng)20次LD-PCR合成雙鏈cDNA(ds cDNA),合成的ds cDNA經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,如圖4所示,12 DAP和20 DAP的ds cDNA呈彌散狀,大小集中分布在600-1 500 bp范圍內。
依據(jù)SMART同源重組原理,將12 DAP和20 DAP的ds cDNA使用Nano drop進行定量,然后等量混合。將混合好的ds cDNA、pGADT7-Rec載體和誘餌pGBKT7-ZmSCL1質粒共轉化酵母AH109感受態(tài)細胞,涂布SD/-Leu、SD/-Leu/-Trp和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板進行篩選,3-5 d后長出單克隆。統(tǒng)計SD/-Leu上稀釋100倍和1 000倍后長出的單克隆數(shù)目(圖5),求平均值后計算文庫滴度,文庫滴度=每板平均克隆數(shù)/涂布體積×稀釋倍數(shù)=1.10×105CFU/mL,文庫庫容量為1.32×106。SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上共計232個單克隆,搖菌提質粒后進行PCR檢測,部分結果如圖6所示,顯示插入片段的大小集中在400-1 500 bp之間,陽性菌落數(shù)為190個,重組率為81.90%。
圖3 誘餌融合蛋白的轉錄激活活性鑒定
圖4 ds cDNA電泳檢測cDNA片段大小范圍
圖5 文庫滴度測定
圖6 PCR檢測文庫插入片段瓊脂糖膠檢測
將插入的cDNA進行測序,除去載體序列,測序長度大于400 bp為有效克隆。將有效測序結果的序列用Blast2GO進行同源比對,最終獲得164個基因的全長(表1)。GO功能富集分析對這些互作蛋白進行了初步分類(圖7):生物過程(Biological Process)注釋顯示,參與細胞生理過程和代謝過程分別有79和73個肽段,即候選蛋白注釋信息主要富集于參與細胞生理過程和代謝過程;分子功能(Molecular Function)注釋顯示,結合、催化和營養(yǎng)儲備的分別有61、57和56個肽段,即候選蛋白注釋信息主要富集于結合、催化和營養(yǎng)儲備相關功能。因此,本結果顯示ZmSCL1可能參與結合、催化和營養(yǎng)儲備相關生命活動。
cDNA文庫的完整性和代表性是評價cDNA文庫質量的重要指標??俁NA樣本的完整性和高純度是構建高質量cDNA文庫的前提,并直接決定cDNA文庫的好壞。本實驗中的12 DAP和20 DAP樣本總RNA條帶清晰,未發(fā)生降解,并且沒有多聚糖、蛋白質和其他小分子物質的污染,因而具備了構建高質量籽粒cDNA文庫的前提條件。
本研究利用SMART(Switching Mechanism at 5’End of the RNA Transcript)技術合成ds cDNA,不需要對樣本總RNA中mRNA進行分離純化,避免了純化過程中產(chǎn)生的mRNA降解;合成的cDNA片段集中在600-1 500 bp之間,具有較好的多態(tài)性,適合進行下一步酵母雙雜交篩選互作蛋白;利用了同源重組的方法,把外源ds cDNA定向重組到pGADT7-Rec載體上,有效的避免了繁瑣的酶切連接等步驟,也解決了低效率的連接和克隆的嵌合問題,從而保證了cDNA文庫整合外源ds cDNA時的方向性和完整性[20]。
本研究采用將ds cDNA和誘餌質粒同時轉化酵母感受態(tài)細胞的方法[18],直接獲得了籽粒灌漿期與ZmSCL1互作的候選蛋白,當實驗不需要進行多次篩選文庫時,該方法不產(chǎn)生凍存的文庫,可作為一個非常快速的互作蛋白篩選過程。
本研究以玉米籽粒灌漿期12 DAP和20 DAP的籽粒為材料構建cDNA文庫,使用玉米胚乳特異高表達基因ZmSCL1作為誘餌基因,進行互作蛋白篩選,初步篩選到了一些在籽粒灌漿期可能與ZmSCL1互作的候選蛋白,GO功能富集分析顯示候選蛋白注釋信息主要富集于結合、催化和營養(yǎng)儲備相關功能,而淀粉的合成和營養(yǎng)積累是玉米籽粒灌漿期胚乳的主要生命活動[21]。值得注意的是,酵母雙雜交的結果顯示,候選蛋白中也篩選到了蔗糖合酶1
(Sucrose synthase 1,SUS1)和UDP-葡萄糖基轉移酶(UDP-glycosyltransferase 76E12,UGT76E12)。因此,ZmSCL1可能參與結合、催化和營養(yǎng)儲備相關的生命活動。接下來的互作驗證以及ZmSCL1功能驗證的開展將為解析玉米籽粒灌漿期的蛋白互作網(wǎng)絡和闡明玉米灌漿期的分子機制奠定必備的研究基礎。
表1 酵母雙雜交陽性克隆基因比對結果
續(xù)表
續(xù)表
圖7 候選互作蛋白的GO分析
本研究使用玉米胚乳特異高表達基因ZmSCL1作為誘餌,在構建的酵母雙雜交cDNA文庫中初步篩選到了玉米籽粒灌漿期可能與ZmSCL1互作的蛋白。文庫滴度為1.10×105CFU/mL,文庫庫容量為1.32×106,插入片段大小集中在400-1 500 bp之間,重組率為81.9%。GO分類結果顯示ZmSCL1可能參與結合、催化和營養(yǎng)儲備相關生物過程的調控。
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Screening Interacted Factors of ZmSCL1 in Yeast Two-hybrid cDNA Libraries of Developing Maize Seeds
ZHAO Qian-qian ZHOU Xiao-jin CHEN Ru-mei
(Biotechnology Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081)
ZmSCL1 is a member of GRAS gene family. Although highly expressed in maize seeds in the key period for the filling period of maize,especially in the endosperm,the molecular function of ZmSCL1 for maize seeds development remains unclear. Therefore,to screen interaction factors for ZmSCL1,yeast two-hybrid cDNA libraries of maize inbred line(B73)developing seeds(12 and 20 days after pollination)were constructed in yeast strain AH109 using homologous recombination-mediated SMART technology. The qualities of the cDNA libraries were evaluated as the followings:the titers were 1.10×105CFU/mL,the capacity of cDNA library was 1.32×106,the recombinant rate was 81.90%,and the protein length encoded by the inserted cDNA ranged from 133 aa to 500 aa. Finally,109 clones were obtained for sequencing. GO enrichment analysis showed that,ZmSCL1 may be involved in the regulation of starch and nutrition accumulation.
GRAS gene family;SMART technology;cDNA library;ZmSCL1 gene
10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0408
2017-05-30
國家重點基礎研究發(fā)展計劃“973”項目(2014CB138200)
趙倩倩,女,碩士研究生,研究方向:植物分子生物學與基因工程;E-mail:zhaoqianqian@yeah.net
陳茹梅,女,研究員,研究方向:植物分子生物學與基因工程;E-mail:chenrumei@caas.cn
(責任編輯 朱琳峰)