趙方東 李麟坤 何旭升 曾會明

（北京林業(yè)大學林學院，北京 100083）

關(guān)鍵基因和相關(guān)激素在植物胚胎發(fā)生前后期的作用

趙方東 李麟坤 何旭升 曾會明

（北京林業(yè)大學林學院，北京 100083）

雖然LEAFY COTYLEDON 1-LIKE與LEAFY COTYLEDON1同為LEAFY COTYLEDON1型的AHAP3亞基，但是與主要在胚胎發(fā)育晚期發(fā)揮重要作用的LEAFY COTYLEDON1不同，LEAFY COTYLEDON 1-LIKE在體細胞胚胎發(fā)育的早期具有把營養(yǎng)階段的細胞轉(zhuǎn)化為胚胎期細胞的能力。而與LEAFY COTYLEDON類基因同樣具有特異性B3結(jié)構(gòu)域的LEAFY COTYLEDON2轉(zhuǎn)錄因子，能夠通過IPA-YUC生長素合成途徑參與在體細胞組織中創(chuàng)造胚胎發(fā)生的環(huán)境。除此之外，LEAFY COTYLEDON2還通過調(diào)節(jié)ABA/GA的比例來促進胚胎的發(fā)生及其發(fā)育。胚胎晚期的WUSCHE和SHOOTMERISTEMLESS的表達相互獨立但又協(xié)調(diào)的維持SAM的功能，獨立于WUSCHE基因表達的KNOX途徑與激素的交互作用，能夠維持胚胎莖頂端分生組織中高濃度的CK和低濃度的GA環(huán)境，有利于WUSCHE-CLAVATA途徑響應(yīng)于CK持續(xù)產(chǎn)生干細胞。綜上所述能夠提高對胚胎發(fā)生分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識，在未來更深入的胚胎發(fā)生研究中奠定分子基礎(chǔ)。

LEAFY COTYLEDON類基因；體細胞胚；WUSCHE；SAM；植物激素

限于合子胚難以通過正常的手段來分離，進而影響研究生長發(fā)育過程，可通過被子植物中的體細胞胚的方式來繼續(xù)研究，因為被子植物的體細胞胚在形態(tài)發(fā)生階段與合子胚存在著對應(yīng)的相似性［1］，具有典型的胚胎器官，如胚根、下胚軸和子葉［2］，而且較一定階段的合子胚容易獲取。盡管對體細胞胚胎發(fā)生最早階段的發(fā)育特征不甚了解，但是隨后的體細胞胚胎發(fā)育過程與合子胚的前期和后期過程具有密切的聯(lián)系［3-4］，這與前人將擬南芥的不成熟合子胚進行體細胞胚誘導培養(yǎng)來分析影響胚胎發(fā)生發(fā)育的因素的研究一致。雖然在單子葉和雙子葉植物中胚胎的發(fā)育階段不同，但在早期和晚期相似，都具有合子期，球形胚期和成熟胚期。本文重點討論在植物胚胎發(fā)生前期和后期中關(guān)鍵基因的研究進展以及與相關(guān)激素的交互作用，有利于提高對胚胎發(fā)生分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認識，在未來更深入的胚胎發(fā)生研究中奠定分子基礎(chǔ)。

1 胚胎莖頂端分生組織（Shoot apical meristem，SAM）的細胞構(gòu)造

SAM分布于胚胎頂端分生組織的中心區(qū)，周圍有側(cè)分生組織和花葉原基起源的外圍區(qū)（圖1）。干細胞群主要集中在SAM的中心區(qū)（Central zone，CZ），其多層結(jié)構(gòu)主要由3個不同的克隆細胞層組成，L1和L2層為單層細胞，其平行于表面各自分開，而L3層的細胞能夠以隨機的方向展開形成肋分生組織（Rib meristem，RM）或組織中心（Organizing center，OC）的多層結(jié)構(gòu)［5］。干細胞分裂增殖的子細胞分別進入側(cè)分生組織分化為形成側(cè)部器官和進入外圍區(qū)分化為莖或葉原基等。SAM的主要功能是在CZ中維持未分化的多功能干細胞群和未分化的干細胞進入外周區(qū)（Peripheral zone，PZ）加快分裂速度分化為器官原基。

圖1 植物SAM的細胞構(gòu)造區(qū)域［6］

2 植物胚胎前后期關(guān)鍵基因

2.1 植物胚胎早期關(guān)鍵基因LEC類基因

LEAFY COTYLEDON（LEC）類基因包括LEAFY COTYLEDON1（LEC1）、LEAFY COTYLEDON 1-LIKE（L1L）、LEAFY COTYLEDON2（LEC2）、FUSCA3（FUS3），前兩者編碼一種HAP3亞基的CCAAT結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，后兩者編碼與B3結(jié)構(gòu)域相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。

2.1.1 L1L基因 在LEC1和FUS3基因方面蔣文婷［7］已順述其研究進展，揭示在胚胎發(fā)生早期和晚期的正常發(fā)育過程中LEC1基因是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)物，能夠足以誘導在營養(yǎng)細胞中的胚胎發(fā)育。與LEC1最密切相關(guān)的亞基L1L共同組成LEC1型的AHAP3亞基，除此之外的AHAP3亞基稱之為非LEC1型。雖然在L1L與LEC1同為LEC1型的AHAP3亞基，但有研究指出LIL和LEC1在胚胎發(fā)生中的功能又有明顯的區(qū)別。lec1突變體使得胚胎發(fā)生晚期停滯，能夠擁有完整的卻畸形的子葉和胚軸，而且在胚胎干燥之前可被拯救發(fā)育為正常幼苗［8］；通過RNAi技術(shù)來抑制L1L誘導的胚胎在早期球狀期受到阻礙，其早期胚胎不能被拯救來產(chǎn)生正常生長的植物。除此之外，在胚胎發(fā)生后的L1L RNA的累積量高于LEC1 RNA，類似于LEC1主要在發(fā)育中的種子中檢測到，并且即使在突變體種子中檢測L1L RNA，其也不能拯救lec1的表型［9］。因此在胚胎發(fā)育過程中LIL主要在早期發(fā)揮作用，具有從營養(yǎng)階段的細胞轉(zhuǎn)化為胚發(fā)生的能力［10］，能夠維持早期胚胎發(fā)展的進程，LEC1也在早期和LIL功能部分冗余，但是在種子發(fā)育晚期LEC1可能發(fā)揮重要的作用。L1L可能位于LEC1的上游來共同調(diào)節(jié)胚胎的發(fā)生發(fā)育，揭示了LEC1和L1L在胚胎發(fā)生中都發(fā)揮獨特的作用。2.1.2 LEC2基因 有關(guān)學者研究［11］與LEC1、L1L同樣具有特異性B3結(jié)構(gòu)域的LEC2轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)，它在合子胚和體細胞胚發(fā)生中起到核心作用，lec2表型在早期胚胎形成期間出現(xiàn)胚軸形態(tài)的缺陷，而且可以在種子成熟前拯救干燥不耐受的種子進而發(fā)育完整植株［12］；過表達LEC2能誘導體細胞胚的形成［13］，而在生長素處理下的培養(yǎng)外植體的胚胎發(fā)生受到損害［11］。有關(guān)研究揭示了LEC2的活性與施用外源IAA之間關(guān)系密切，指出在無IAA條件下培養(yǎng)的外植體中，由于LEC2基因的過表達使得IAA濃度增加滿足刺激體細胞胚發(fā)生的需要［14］。這就證明了LEC2基因可能通過內(nèi)生生長素的水平來影響胚胎發(fā)生的機制。Wójcikowska等［11］認為體細胞胚的形成與局部生長素的產(chǎn)生相關(guān)，LEC2在IPA-YUC生長素合成途徑中起到關(guān)鍵作用，其可能活化該途徑中YUC（YUC1，YUC2，YUC4，YUC10）來進行信號傳導［11，15］，YUCCA蛋白是一種依賴色氨酸的生長素合成的黃素單氧化酶，通過LEC2控制的機制能夠在體細胞組織中創(chuàng)造胚胎發(fā)生的環(huán)境［15］。除此之外，通過極性生長素轉(zhuǎn)運產(chǎn)生的生長素梯度可能也參與觸發(fā)體細胞胚胎的發(fā)生。

2.2 植物胚胎后期關(guān)鍵基因WUS基因

WUSCHE（WUS）編碼不同于KNOTTED1類的新類別的同源結(jié)構(gòu)域蛋白，產(chǎn)生于莖端分生組織的OC細胞中并調(diào)節(jié)參與分生組織和細胞分裂相關(guān)的許多基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子［16-17］，在RM/OC的細胞中表達［18］，并在SAM的干細胞下面的一組細胞中表達，以非自發(fā)細胞的方式影響干細胞命運而且在莖頂端分生組織、花序分生組織中起到關(guān)鍵作用［19］。當WUS功能受到抑制，SAM表現(xiàn)出嚴重缺陷［20］。由于啟動WUS的表達不依賴SHOOTMERISTEMLESS（STM）的活性，STM是一類KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX（KNOX1）基因，在該基因突變的背景下導致SAM不能完整的形成［21］，并且WUS基因的表達僅出現(xiàn)在SAM的小亞結(jié)構(gòu)中［22］，因此STM和WUS似乎在不同的水平上調(diào)節(jié)SAM的發(fā)育。盡管STM主要作用于中心分生組織細胞使其未分化，但這些細胞的正常功能正是WUS基因所需要的，也證實了STM作用于WUS的上游［23］。由于SAM幾乎在整個植物的生命周期中都存在著干細胞群［24］，因此莖端分生組織的穩(wěn)態(tài)主要通過控制分生組織中心中緩慢分裂的干細胞以及其移位到外周細胞進而經(jīng)歷細胞分化的平衡［8］。同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子WUS從組織中心到中心區(qū)的運動需要維持干細胞穩(wěn)態(tài)［25］，WUS和CLAVATA能夠以負反饋回路的組成部分來控制這種平衡［26］，在這種反饋機制中，最關(guān)鍵的是維持恒定數(shù)量的干細胞，WUS轉(zhuǎn)錄限制OC細胞自身的水平主要通過在CZ的相鄰細胞中激活負調(diào)節(jié)物CLAVATA3（CLV3），CLV3編碼在細胞外空間與CLAVATA1（CLV1）/CLV2結(jié)合起作用的小肽，能夠通過阻止圍繞CZ外周區(qū)細胞分化為CZ細胞限制整體SAM的大小，CLV1指的是在RM中一種受體激酶，其富含亮氨酸［27-29］，具體的過程是指在OC的細胞中合成的WUS蛋白遷移至CZ中，主要通過綁定至CLV3啟動子元件的方式能直接控制其轉(zhuǎn)錄激活［18］，是WUS蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運而非在其mRNA中被檢測到，以發(fā)揮其功能。與前人做過的研究類似，在玉米的SAM中能檢測KNOTTED1（KN1）mRNA，但在SAM的外周細胞和葉基上以及L1層無法積累KN1mRNA，而KN1蛋白存在于L1 中［30-31］，顯示了在mRNA和蛋白質(zhì)表達結(jié)構(gòu)域之間存在明顯差異。而WUS 的RNA在CZ下方的L3層細胞形成的RM/OC中的幾個細胞被發(fā)現(xiàn)［18，22］。有關(guān)研究提出一種模型能夠理解WUS-CLV3反饋機制的重要性，其主要包括WUS蛋白直接激活CLV3的轉(zhuǎn)錄和從CZ中發(fā)出的CLV3信號負反饋WUS來維持干細胞的數(shù)量［18］。

同時過表達WUS和STM能夠形成異位芽，而其中的單獨基因過表達不能產(chǎn)生上述效果［32-33］。由此可見，在胚胎器官發(fā)生過程中WUS和STM的組合是至關(guān)重要的。又因為PINFORMED（PIN）開始啟動之后，WUS和STM表達的時刻可能標志著器官和莖的發(fā)生。STM并不像WUS僅在小區(qū)域中表達，其分布于整個分生組織。STM在SAM的作用與WUS和CLV相互獨立又互補，其抑制干細胞分化來保持不確定的細胞命運［34］，而WUS在一定區(qū)域擴增干細胞［32，35］，有利于平衡干細胞生長和器官原基的生長。

3 關(guān)鍵基因與相關(guān)激素的相互調(diào)節(jié)作用

3.1 LEC轉(zhuǎn)錄因子與植物激素交互作用產(chǎn)生刺激體細胞胚發(fā)生的環(huán)境

有些單獨基因如YUC的過表達不能夠誘導體細胞胚的發(fā)生［36］，然而植物激素ABA/GA水平的高低對體細胞胚發(fā)生的能力有著至關(guān)重要的影響，與ABA信號轉(zhuǎn)導機制相關(guān)的重要基因的突變抑制體細胞胚的發(fā)生［37］，而抑制GA合成途徑的相關(guān)基因能夠促進形成體細胞胚胎［38］，由此可知ABA能夠促進體細胞胚的發(fā)生，GA可能對其具有拮抗作用，這可以在ABA/GA對胡蘿卜體細胞胚影響的研究中［39-40］得到進一步的證明。LEC2誘導體細胞胚發(fā)生常與GA的合成抑制相關(guān)，GA2ox6能夠編碼使GA生物活性失活的一種酶，常被AGAMOUSLIKE15（AGL15）激活，它是一種MADS盒轉(zhuǎn)錄因子，過表達該基因能夠增加體細胞胚發(fā)生的能力，而LEC2直接控制AGL15的活性［38］。然而GA生物合成酶基因的突變能夠減少體細胞胚的數(shù)量，可見在體細胞胚不同階段對GA的需求不同。與其類似，通過LEC2控制的編碼使ABA分解代謝的ABA8’-羥 化 酶（CYP707A1，CYP707A2，CYP707A3）［41］的激活來降低ABA水平進而誘導體細胞胚胎發(fā)生［42］，而在不成熟合子胚的子葉階段，通過LEC1或LEC2來激活FUS3進而引起ABA水平的增加［41］有利于胚的成熟，這暗示著ABA的水平與其發(fā)生胚的潛力具有正調(diào)控的關(guān)系［43］，在胚胎形成到胚胎成熟時ABA/GA的比例逐漸升高有利于胚胎發(fā)生及其發(fā)育，到器官發(fā)生時期其比例急劇下降來完成完整的生命周期。

除上述激素之外，過表達AGL15能夠響應(yīng)植物生長素（AUXIN）增強胚胎發(fā)生能力［41］，并且LEC2具有快速增強AUXIN啟動子活性的特性［42］，使得由LEC2控制表達的組織能夠響應(yīng)生長素信號進行體細胞胚的誘導。又或許是通過LEC2激活I(lǐng)AA30［41］，IAA30可以編碼一種生長素信號蛋白，來提高游離生長素的濃度或者刺激組織中細胞對生長素的反應(yīng)，在AUXIN信號轉(zhuǎn)導途徑中啟動體細胞胚的發(fā)生。

3.2 植物激素參與胚胎發(fā)育中SAM的調(diào)控

植物激素參與控制胚胎發(fā)生的研究表明，AUXIN和細胞分裂素（Cytokinin，CK）對植物胚胎SAM的形成和維持具有重要的調(diào)節(jié)作用。除了下調(diào)STM基因的表達之外，與其他信號與STM共同參與使得SAM外圍區(qū)域的AUXIN達到闕值的過程，并且能夠調(diào)節(jié)SAM中的外圍區(qū)域向器官發(fā)生的轉(zhuǎn)變［44-46］。前人［47］已經(jīng)探討出分裂和維持未分化的干細胞與在SAM中心區(qū)域高水平的CK的活性相關(guān)。CK在幼芽組織［48］和芽再生期間［49］誘導植物生長素的生物合成進而促進建立生長素梯度。相反，由于STM基因的表達能促進CK的生物合成，AUXIN通過抑制STM基因的表達來控制CK的水平［50-51］。這兩種激素相互抑制達到體內(nèi)平衡，防止任意一激素過多影響干細胞的維持發(fā)展及器官發(fā)生畸變。響應(yīng)于IAA的因子如（AUXIN RESPONSE FACTOR 3 / MONOPTEROS）ARF3、MP / ARF5 和 A 型 ARR ARR7 和 ARR15［49，52］，對于CK的分布范圍由AUXIN通過異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）來負反饋調(diào)節(jié)；然而，TOPLESS（TPL）［53］由CK誘導的WUS基因激活，通過與IAA12 /BODENLOS（IAA12 / BDL）和 MONOPTEROS /AUXIN RESPONSE FACTOR 5（MP / ARF5）的相互 作用減少AUXIN信號傳導［54-55］，在這生長素轉(zhuǎn)導途徑中TPL作為一種轉(zhuǎn)錄共抑制子來調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育。除此之外，KONX 轉(zhuǎn)錄因子與CK和赤霉素GA交聯(lián)并對器官的發(fā)生起到平衡的作用［56］，能夠刺激CK的積累維持干細胞的分裂，以及抑制SAM中的CK來阻止干細胞的分化［47］。CK的積累主要是由于在細胞分裂素合成中起重要作用的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT）基因被分生組織CZ中的KNOX直接激活，在KNOX發(fā)生突變的表型上CK信號受到嚴重阻礙［51，57］，而WUS直接抑制CK誘導的應(yīng)答調(diào)節(jié)劑 ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR（ARR）（ARR7，ARR15），其也可通過MP介導的AUXIN信號轉(zhuǎn)導途徑來受到抑制［52］，使得CK非常精確地刺激SAM中干細胞的分裂［58］。對于GA的控制是由KONXI基因直接抑制GA生物合成基因GA20氧化酶和刺激GA2氧化酶的表達，能夠在SAM的頂端抑制GA20的表達并且促進葉原基基部的GA20的表達使得GA轉(zhuǎn)化為無活性的GA，僅有限的GA發(fā)揮作用［47，59-60］。由此可見KNOXI轉(zhuǎn)錄因子對于分生組織功能來說是必需的，其可以通過誘導局部的CK合成發(fā)揮作用，作為一種中樞調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)分生組織中的激素水平［61］。

在參與有關(guān)SAM形成的基因中，如STM和CLV1基因的表達上調(diào)大約處于發(fā)芽期，而WUS稍早上調(diào)，響應(yīng)于細胞分裂素，其在SAM的中心區(qū)的組織中心表達［62］，繼而轉(zhuǎn)移至覆蓋的干細胞，通過WUS和CLAVATA的反饋機制維持組織和器官發(fā)展，在這其中WUS能夠直接誘導CLAVATA3（CLV3）表達，而CLV編碼一種信號肽能夠限制WUS到組織中心細胞表達，其誘導上調(diào)導致下調(diào)WUS和限制CZ結(jié)構(gòu)域的發(fā)展［63］。clv3突變體表現(xiàn)出過高的WUS表達量造成臃腫的SAM以及過表達CLV3導致SAM終止的現(xiàn)象［22，64-65］表明CLV3能夠抑制WUS的表達，并且能形成負反饋環(huán)［18］。

對于調(diào)節(jié)SAM的信號網(wǎng)絡(luò)是由許多調(diào)節(jié)子和信號轉(zhuǎn)導途徑組成，獨立于WUS基因表達的KNOX途徑與激素具有交互作用，能夠維持高濃度的CK和低濃度的GA的環(huán)境來確保正確的SAM功能，而響應(yīng)于CK的WUS-CLV途徑對于維護SAM是必要的的中心反饋回路，能夠持續(xù)產(chǎn)生干細胞進而促進側(cè)向器官生長，這兩種途徑對于維持SAM中的平衡器官原基的生長和干細胞持續(xù)產(chǎn)生是不可缺少的。對于其信號轉(zhuǎn)導途徑可歸納為圖2。

圖2 SAM中相關(guān)基因與激素之間的相互調(diào)控

4 結(jié)語

綜述以上植物胚胎發(fā)生前后期的機制，揭示了LEC類基因與植物激素在創(chuàng)造體細胞胚發(fā)生的環(huán)境中的重要作用，以及SAM的關(guān)鍵基因與植物激素相互作用共同維持和調(diào)節(jié)胚胎后期的發(fā)展，但是胚胎發(fā)生前期的一些基因及其功能還未得到驗證，其與植物激素的相互調(diào)節(jié)有待進一步的研究，啟動胚胎發(fā)生前期WUS和STM基因是否與LEC類基因交集還需考證。盡管在胚胎后期的研究較為詳細，但是激素與基因之間相互作用而發(fā)揮功能的方式還需要進一步解析。

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Roles of Key Genes and Relevant Plant Hormones in the Early and Late Stages of Plant Embryogenesis

ZHAO Fang-dong LI Lin-kun HE Xu-sheng ZENG Hui-ming
（College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

Both LEAFY COTYLEDON 1-LIKE and LEAFY COTYLEDON1 are AHAP3 subunit of the LEAFY COTYLEDON1 type，but LEAFY COTYLEDON 1-LIKE is capable of converting the cells of vegetable stage into the cells of embryo periods in the early stages of somatic embryogenesis，differing from the LEAFY COTYLEDON1 that plays an important role in the early stages of embryonic development. LEAFY COTYLEDON2，which has the same specific B3 domain as the LEAFY COTYLEDON gene，can participate in creating the environment of embryogenesis in somatic tissue by IPA-YUC auxin synthesis pathway. Besides，LEAFY COTYLEDON2 promotes the occurrence and development of embryos by regulating the ratio of ABA/GA. The expression of WUSCHE and SHOOTMERISTEMLESS is independent but coordinated to maintain the function of shoot apical meristem（SAM）. The KNOX pathway that is independent from the WUSCHE expression but interacts with plant hormone can maintain the environment of high-concentration CK and low-concentration GA for embryonic SAM，which is beneficial to the pathway of WUSCHE -CLAVATA responding to CK and continuously produce stem cells. In summary，it is feasible to improve the understanding of the molecular regulation network of embryogenesis，and to lay the molecular basis for further studying embryogenesis.

LEAFY COTYLEDON-like gene；somatic embryos；WUSCHE；SAM；plant hormone

2017-06-14

國家“863計劃”項目（2013AA102607）

趙方東，男，碩士研究生，研究方向：草地植物遺傳育種；E-mail：fangdongzhao2012@163.com

曾會明，男，博士，副教授，研究方向：草地植物遺傳育種；E-mail：sciinfo@bjfu.edu.cn

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0502

（責任編輯 狄艷紅）