隗黎麗，劉 毅，王自蕊，阮記明，周 穎，熊六鳳，鐘其旺

MC－LR急性脅迫對草魚脾臟、頭腎顯微結(jié)構(gòu)及BAFF和APRIL基因表達(dá)的影響

隗黎麗1，劉 毅2，王自蕊1，阮記明1，周 穎1，熊六鳳1，鐘其旺3*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045；2.江西師范大學(xué)生命學(xué)院，南昌 330022；3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，南昌 330045）

為探討微囊藻毒素－LR（microcystin－LR,MC－LR）對魚類的免疫毒性，采用急性毒性實(shí)驗(yàn)方法，分別對草魚經(jīng)腹腔注射不同劑量的MC－LR并于24、48、72 h和96 h后取免疫器官脾臟和頭腎進(jìn)行組織顯微結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，隨著MC－LR劑量的增加和時間的延長，脾臟組織呈現(xiàn)出細(xì)胞空泡化并伴隨著黑色素巨噬細(xì)胞先增多后減少的現(xiàn)象，尤其在75 μg MC－LR·kg－1BW和100 μg MC－LR·kg－1BW劑量組染毒48 h后，黑色素巨噬細(xì)胞中心體積顯著增大；頭腎組織顯微結(jié)構(gòu)變化主要表現(xiàn)為血竇、血管擴(kuò)張，在75 μg MC－LR·kg－1BW 和 100 μg MC－LR·kg－1BW 劑量組中的草魚染毒 72 h和 96 h后，淋巴組織松散、排列混亂，淋巴細(xì)胞空泡化甚至細(xì)胞裂解。此外，采用熒光定量PCR分析了草魚經(jīng)不同劑量MC－LR處理96 h后脾臟和頭腎中BAFF和APRIL基因表達(dá)的變化。結(jié)果顯示BAFF和APRIL的表達(dá)均被不同程度地抑制，其中脾臟組織中BAFF基因在75 μg MC－LR·kg－1BW劑量組中被顯著抑制（P＜0.05），頭腎組織 BAFF 基因在 75、100 μg MC－LR·kg－1BW 劑量組中均被顯著抑制（P＜0.05），而 APRIL 除了在 25 μg MC－LR·kg－1BW劑量組的脾臟組織中表達(dá)下調(diào)不顯著外，在其他處理組均被顯著抑制（P＜0.05）。以上研究結(jié)果表明，MC－LR可導(dǎo)致草魚免疫器官一系列的病理變化，并有時間和劑量效應(yīng)，此外，MC－LR還可抑制B淋巴細(xì)胞分裂相關(guān)基因的表達(dá)。

微囊藻毒素－LR；草魚；脾臟；頭腎；組織病理；BAFF；APRIL

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是由富營養(yǎng)化水體中的藻類產(chǎn)生的一類有毒物質(zhì)，結(jié)構(gòu)變體多達(dá)100余種，其中微囊藻毒素－LR（Microcystin－LR，MC－LR）是目前已知的毒性最強(qiáng)、危害最嚴(yán)重的一種毒素，并具有高度的肝毒性[1]。然而大量的資料表明，MCs除了具有高度肝毒性之外，還具有免疫毒性[2]等其他毒性。盡管魚類是低等脊椎動物，但已具備免疫防御系統(tǒng)，其中，脾臟和頭腎是魚類最主要的免疫器官。在絕大多數(shù)的真骨魚中，脾臟是紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞產(chǎn)生、貯存和成熟的主要場所，同時具有造血和免疫功能[3]。在魚類腎臟的發(fā)育過程中，頭腎失去排泄功能而成為免疫器官和造血器官，兼具免疫細(xì)胞的生產(chǎn)、分化和增殖以及捕獲抗原和產(chǎn)生抗體的功能[4]。魚體受到污染物的脅迫，組織和器官的結(jié)構(gòu)或形態(tài)變化被認(rèn)為是病理損傷的最初表現(xiàn)，因此魚類的組織病理變化可被用作檢測環(huán)境脅迫的有效生物標(biāo)記。之前的研究多集中在MCs對動物和魚類肝臟組織病理的影響，而關(guān)于魚類脾臟、頭腎等免疫器官在MC－LR作用下的病理變化鮮有報道。

由于細(xì)胞因子對環(huán)境毒素較為敏感[5]，常常作為監(jiān)測污染物等的生物標(biāo)志物。B細(xì)胞活化因子（B lymphocyte stimulator，BAFF）是一種新型的腫瘤壞死因子家族的配體，屬于腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）家族成員[6]，有報道表明環(huán)境污染物可以刺激BAFF的產(chǎn)生[7]。目前的研究結(jié)果表明：BAFF與B淋巴細(xì)胞的發(fā)育、T細(xì)胞活化及體液免疫直接相關(guān)，而BAFF的過度表達(dá)又有可能參與自身反應(yīng)性B細(xì)胞的產(chǎn)生和自身免疫耐受的破壞，影響免疫應(yīng)答，導(dǎo)致各種自身免疫性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生[8]。增殖誘導(dǎo)配體（A proliferation－induction ligand，APRIL）是TNF家族的新成員，又名腫瘤壞死因子配體超家族成員 13（Tumor necrosis factor ligand superfamily member 13，TNFSF13α）。已有研究證實(shí)APRIL可與BAFF形成異源三聚體而刺激B淋巴細(xì)胞增殖[9]，還能夠上調(diào)B細(xì)胞表面一些重要的共刺激分子的表達(dá)，明顯增強(qiáng)在抗原呈遞過程中B細(xì)胞的功能[10]。APRIL作為TNF超家族的成員之一，在促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖的過程中起到重要的作用，而且是重要的腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)因子，在腫瘤發(fā)生的早期對APRIL的檢測來實(shí)現(xiàn)早期診斷治療。此外，APRIL與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，其可通過促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的增殖來調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

鑒于脾臟和頭腎以及BAFF和APRIL在魚類免疫中的重要作用，本研究以我國淡水主養(yǎng)品種草魚（Ctenopharyngodon idella）為試驗(yàn)對象，通過腹腔注射不同劑量的MC－LR，探討MC－LR對這兩個重要免疫器官的免疫毒性以及這兩個免疫組織中B淋巴細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期更好地了解MC－LR對魚類免疫系統(tǒng)造成的影響，為MC－LR風(fēng)險評估提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用草魚購自江西省南昌神龍漁業(yè)公司養(yǎng)殖基地，平均體重為22.13±2.17 g，平均體長為12.09±1.33 cm。MC－LR為Taiwan Algal Science Inc公司產(chǎn)品，間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽（MS－222）為Sigma公司產(chǎn)品，乙醇、二甲苯、甲醇、甲醛等試劑為國產(chǎn)分析純。RNA提取試劑盒TRIzol reagent購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（DL2000）、SYBR Green Real－time PCR Master Mix購自Promega公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚的處理

實(shí)驗(yàn)魚在室內(nèi)水族箱（85 cm×60 cm×60 cm）暫養(yǎng)2 周，水溫為 20±0.2 ℃，溶氧保持在 6.0～7.0 mg·L－1。暫養(yǎng)期間每日按照魚體重的2.0%投喂飼料，試驗(yàn)前48 h停止投喂并將草魚隨機(jī)分組，即對照組和三個濃度組，每組設(shè)置三個重復(fù)。實(shí)驗(yàn)前，將商品MC-LR（純度≥95%）粉末用甲醇溶解成 1 μg·μL-1的溶液，隨后用0.8%生理鹽水稀釋成所需濃度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)以及參考文獻(xiàn)[11]確定注射劑量為 25、75 μg MC-LR·kg-1BW（體重）和 100 μg MC-LR·kg-1BW，每尾魚注射0.1 mL，對照組則注射等量的0.8%的生理鹽水。草魚染毒采用腹腔注射，即沿腹鰭基部注射入腹腔，為避免傷及魚體內(nèi)臟，注射角度小于30°。

1.3 取樣

在染毒24、48、72 h和96 h，實(shí)驗(yàn)組和對照組各取6尾魚。解剖前，先用100 μg·mL-1的間氨基苯甲酸乙酯甲烷磺酸鹽（MS-222）將魚麻醉，然后迅速分離新鮮的脾臟和頭腎，一部分立即放入10%中性甲醛中固定，24 h后更換一次固定液；另一部分置于液氮中提取RNA。

1.4 光鏡樣品的制備與觀察

取出經(jīng)10%中性甲醛固定的樣品，沖洗，常規(guī)梯度酒精脫水處理、石蠟包埋、切片（厚約5 μm），二甲苯脫蠟、蘇木精和伊紅（H.E）染色，二甲苯透明，中性樹膠封片，采用BM2000型顯微系統(tǒng)觀察并拍照分析。

1.5 核酸的提取和cDNA模板的合成

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA，操作過程（包括組織總RNA提取以及應(yīng)用RNA的一切相關(guān)實(shí)驗(yàn)）所用離心管和槍頭等需經(jīng)0.1%焦碳酸二乙酯（diethylpryocarbonate，DEPC）水處理過夜，玻璃器皿及金屬器械需經(jīng)180℃高溫烘烤6 h以上使RNase徹底失活。RNA的具體提取方法參考試劑盒的說明書進(jìn)行。cDNA合成按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit操作手冊進(jìn)行。

1.6 qRT-PCR檢測MC-LR對草魚脾臟和頭腎組織中BAFF和APRIL基因的表達(dá)的影響

Real-time quantitative PCR反應(yīng)在伯樂公司CFX96 TouchTMReal-Time PCR Detection System上完成。BAFF、APRIL和內(nèi)參glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）引物見表1。反應(yīng)體系是：20 μL PCR反應(yīng)液中包括5.0 μL 50倍稀釋的cDNA模板，10 μL SYBR Green Real-time PCR Master Mix，上下游引物各 0.5 μL、4.0 μL ddH2O。反應(yīng)條件：94℃變性 5 min，94 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 20 s進(jìn)行 45 個循環(huán)后，72℃延伸5 min。熒光定量PCR的數(shù)據(jù)采用2－△△CT法進(jìn)行計算，用 SPSS 軟件 （16.0）One-wayANOVA進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 BAFF，APRIL和GAPDH引物Table 1 Primer of BAFF，APRIL and GAPDH

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 中毒癥狀的觀察

100 μg MC-LR·kg-1BW劑量組草魚在注射MCLR后即表現(xiàn)出急躁不安，狂游、魚體抽搐等現(xiàn)象，然后沉于水底，在較短時間內(nèi)穩(wěn)定下來，隨后又呈失衡狀態(tài)，75 μg MC-LR·kg-1BW組草魚在注射24 h后出現(xiàn)游動異常，隨后這種現(xiàn)象緩解，而25 μg MC-LR·kg-1BW劑量組在注射毒素后沒有明顯的異常行為。此外，75 μg MC-LR·kg-1BW 和 100 μg MC-LR·kg-1BW在染毒24 h后可見腹部腫脹，解剖后均可見大量積水，肝臟出現(xiàn)大面積充血、出血現(xiàn)象，且100 μg MC-LR·kg-1BW組草魚的這種現(xiàn)象更嚴(yán)重。

2.2 對照組草魚脾臟和腎臟的顯微結(jié)構(gòu)

對照組草魚脾臟表面光滑呈暗紅色，顯微觀察顯示草魚脾臟沒有明顯的白髓和紅髓之分，主要由淋巴組織構(gòu)成，淋巴組織由網(wǎng)狀細(xì)胞彼此連接構(gòu)成支架，網(wǎng)眼內(nèi)充填著淋巴細(xì)胞（三角形示）、巨噬細(xì)胞（菱形箭頭示）、粒細(xì)胞（雙箭頭示）、血細(xì)胞（箭頭）等（圖1A）。草魚頭腎實(shí)質(zhì)內(nèi)未見腎單位結(jié)構(gòu)，主要由淋巴組織、造血組織和血竇構(gòu)成，包括淋巴細(xì)胞（三角形示）、紅細(xì)胞（箭頭示）、粒細(xì)胞（雙箭頭示）、巨噬細(xì)胞（菱形箭頭示）等（圖1B）。

2.3 微囊藻毒素-LR對草魚脾臟顯微結(jié)構(gòu)的影響

圖1 對照組草魚脾臟和頭腎的顯微結(jié)構(gòu)Figure 1 The microstructure of spleen and head kidney in control grass carp

25 μg MC-LR·kg-1BW組草魚在染毒24 h后，相對于對照組草魚，脾臟變化不明顯，偶可見黑色素巨噬細(xì)胞（圖2A）；染毒48 h后，可見黑色素-巨噬細(xì)胞較24 h的脾臟的黑色素巨噬細(xì)胞增多，同時可見脾索血細(xì)胞堆積（圖2B）；染毒72 h和96 h后，脾索之間可見大量血細(xì)胞堆積（圖2C和圖2D）。75 μg MCLR·kg-1BW組草魚在注射MC-LR 24 h后，與對照組相比，黑色素巨噬細(xì)胞增多（圖2E）；而染毒48 h后，相對于同濃度24 h脾臟中黑色素巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯聚集增多，可見體積比較大的黑色素巨噬中心（圖2F）；染毒72 h后，脾索之間有大量的血細(xì)胞浸潤擁擠其中，并有局部性出血（圖2G）；染毒96 h后，可見血竇和血管擴(kuò)張更明顯且淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化并伴隨個別細(xì)胞壞死溶解（圖 2H）。100 μg MC－LR·kg－1BW組草魚在染毒24 h后，與對照組和其他兩個劑量組相比，可見黑色素巨噬細(xì)胞增多（圖2I）；染毒48 h后，相對于24 h的脾臟的顯微結(jié)構(gòu)，黑色素巨噬細(xì)胞繼續(xù)增多，并伴隨著黑色素巨噬細(xì)胞中心體積增大，脾索之間血細(xì)胞明顯增多（圖2J）；染毒72 h后，細(xì)胞排列雜亂，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，局部出現(xiàn)充血（圖2K）；染毒96 h后，相對于72 h時間段草魚的淋巴細(xì)胞排列，其表現(xiàn)更加無序，并伴隨著大量淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)空泡化、壞死溶解（圖2L）。

2.4 微囊藻毒素－LR對草魚頭腎顯微結(jié)構(gòu)的影響

25 μg MC－LR·kg－1BW 組草魚在染毒 24 h 后，與對照組相比，頭腎無明顯變化（圖3A）；48 h后，與對照組相比，可見血竇擴(kuò)張（圖3B），在染毒72 h后，可見血管明顯擴(kuò)張，黑色素巨噬細(xì)胞增多（圖3C）；而96 h后的樣品相對于72 h的樣品，血竇擴(kuò)張更明顯，個別淋巴細(xì)胞出現(xiàn)壞死（圖 3D）。75 μg MC－LR·kg－1BW組草魚在染毒24 h后，與對照組相比，血竇擴(kuò)張，并可見較多黑色素巨噬細(xì)胞（圖3E）；染毒48 h后，可見黑色素巨噬細(xì)胞比24 h時間段的樣品中的黑色素細(xì)胞數(shù)量明顯增多（圖3F）；染毒72 h和96 h后，可見淋巴細(xì)胞空泡化、個別細(xì)胞壞死溶解，相對于前一時間段的樣品，血竇和血管擴(kuò)張更明顯，黑色素巨噬細(xì)胞數(shù)量減少（圖 3G 和圖 3H）。100 μg MC－LR·kg－1BW 組草魚在染毒 24 h 后，相對于 75 μg MC－LR·kg－1BW組草魚染毒24 h的樣品來說，可見黑色素巨噬細(xì)胞增多，血管擴(kuò)張（圖3I）；染毒48 h后，淋巴細(xì)胞出現(xiàn)空泡化（圖3J）；染毒72 h后，淋巴細(xì)胞空泡化比染毒48 h后的樣品更嚴(yán)重，細(xì)胞排列雜亂（圖3K）；染毒96 h后，頭腎組織疏松，淋巴細(xì)胞排列相對于染毒72 h的頭腎淋巴細(xì)胞空泡化更加無序，退化區(qū)更明顯，大量淋巴細(xì)胞壞死溶解，黑色素巨噬細(xì)胞明顯減少（圖3L）。

2.5 MC－LR對草魚脾臟和頭腎組織中BAFF基因表達(dá)的影響

草魚經(jīng)不同劑量MC－LR處理96 h后，脾臟中BAFF基因的表達(dá)均被抑制，經(jīng)單因素方差分析，注射劑量為 75 μg MC－LR·kg－1BW 可顯著抑制 BAFF基因在脾臟中的表達(dá)水平（P＜0.05），與對照組相比，相對表達(dá)抑制比為41%±6.6%，劑量為25、100 μg MC－LR·kg－1BW時，對BAFF 的表達(dá)水平無顯著影響（P＞0.05）（圖 4A）。在MC－LR 的脅迫下，頭腎中BAFF基因的表達(dá)均下調(diào)，劑量為25、75μg MC－LR·kg－1BW 時，BAFF 基因的表達(dá)顯著下降（P＜0.05），相對于對照組表達(dá)的抑制百分比分別為42%±17.6%和21%±3.8%（圖 4B）。

2.6 MC－LR對草魚脾臟和頭腎組織中APRIL基因表達(dá)的影響

草魚經(jīng)不同劑量MC－LR處理96 h后，APRIL基因在脾臟組織中表達(dá)呈現(xiàn)抑制趨勢，并且APRIL基因表達(dá)量隨MC－LR劑量的升高而逐漸降低，除25 μg MC－LR·kg－1BW 劑量組外，其他兩組中 APRIL 基因的表達(dá)均顯著被抑制（P＜0.05），100 μg MC－LR·kg－1BW處理組中APRIL基因抑制程度最高，與對照組相比，相對表達(dá)抑制百分比為13%±4.7%（圖5A）。在頭腎組織中，APRIL基因的表達(dá)下降更明顯，APRIL基因在三個劑量組中的表達(dá)均顯著下降（P＜0.05），同樣在 100 μg MC－LR·kg－1BW 處理組中 APRIL 基因抑制最強(qiáng)，相對表達(dá)抑制百分比為7%±1%（圖5B）。

3 討論

圖2 不同劑量MC-LR對草魚脾臟顯微結(jié)構(gòu)的影響Figure 2 The effects of different dose of MC-LR on the histopathology of spleen from grass carp

免疫器官是免疫系統(tǒng)中重要的組成部分，對于維持機(jī)體發(fā)揮正常的免疫功能具有極其重要的地位。不僅如此，免疫系統(tǒng)也是對外源性化合物最為敏感的系統(tǒng)之一。目前已有大量的研究報道了MCs對魚類免疫器官的毒性，如Trinchet等[12]發(fā)現(xiàn)青鱂（Oryzias latipes）暴露于 5 μg MC-LR·L-1溶液中即可引起脾臟細(xì)胞密度降低、淋巴細(xì)胞空泡化，且有大面積的壞死。為了系統(tǒng)地從組織學(xué)方面提供MC-LR對魚類免疫毒性的有力證據(jù)，本試驗(yàn)通過組織切片的方法檢測了不同濃度的MC-LR對草魚脾臟和頭腎的病理影響。脾臟和頭腎都是魚類重要的免疫器官和造血器官，對污染物敏感，容易受到損傷。Carbis等[13]曾報道鯉魚（Cyprinus carpio） 經(jīng)腹腔注射 50 μg MC-LR·kg-1BW時，脾臟組織結(jié)構(gòu)無明顯病理改變。然而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，草魚在注射MC-LR后，即使25 μg MC-LR·kg-1BW劑量組對草魚脾臟也有明顯的病理改變，且呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，高濃度染毒組（100 μg MC-LR·kg-1BW）草魚脾臟在染毒96 h后大量淋巴細(xì)胞空泡化，這與Trinchet等[14]的結(jié)果一致。隨著染毒時間的延長和濃度的增加，頭腎中的部分淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐漸變得不清晰，細(xì)胞空泡化甚至裂解。Wei等[11]報道用劑量為50 μg MC-LR·kg-1BW 的MC-LR處理草魚，可見草魚脾臟和頭腎淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡、線粒體水腫和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。因此，這些研究結(jié)果均表明，MC-LR可對魚類脾臟和頭腎這兩種重要的免疫器官產(chǎn)生毒性。

圖3 不同劑量MC-LR對草魚頭腎顯微結(jié)構(gòu)的影響Figure 3 The effects of different dose of MC-LR on the histopathology of head kidney from grass carp

圖4 MC-LR對脾臟和頭腎組織中BAFF mRNA表達(dá)水平的影響Figure 4 The effect of MC-LR on BAFF mRNA expression in spleen and head kidney of grass carp

此外，本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在染毒48 h后，脾臟和頭腎中都可見黑色素-巨噬細(xì)胞增多、體積增大的現(xiàn)象，但在染毒96 h后，黑色素巨噬細(xì)胞數(shù)量減少。黑色素-巨噬細(xì)胞中心是黑色素巨噬細(xì)胞在脾臟、頭腎等其他器官中累積而成的。黑色素-巨噬細(xì)胞中心的增多與以下因素有關(guān)：正常的衰老、饑餓、感染疾病、毒物作用等[15]。因此，本試驗(yàn)中出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是MC-LR引起魚類免疫毒性，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能紊亂，誘導(dǎo)黑色素-巨噬細(xì)胞中心增多，從而有效地保護(hù)組織免受破壞。但當(dāng)高濃度、長時間的MC-LR作用時，巨噬細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞且吞噬功能也受到抑制，阻斷了黑色素巨噬細(xì)胞的集結(jié)發(fā)育，導(dǎo)致黑色素-巨噬細(xì)胞中心的大小變小，數(shù)量又減少。這些也說明隨著MC-LR濃度增大、作用時間延長，魚類的非特異免疫機(jī)能受到抑制，從而對魚類產(chǎn)生免疫毒性。

圖5 MC-LR對脾臟和頭腎組織中APRIL mRNA表達(dá)水平的影響Figure 5 The effect of MC-LR on APRIL mRNA expression in spleen and head kidney of grass carp

魚類免疫系統(tǒng)中有大量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子不僅在非特異性免疫和特異性免疫防御中發(fā)揮功能，而且在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定方面也發(fā)揮著重要作用[16]。當(dāng)機(jī)體暴露在外來抗原或有毒化學(xué)物質(zhì)中，細(xì)胞因子會隨著免疫系統(tǒng)的變化而發(fā)生改變[17]。Wei等[18]采用基因芯片研究了MC-LR對斑馬魚肝臟基因表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)MC-LR可抑制斑馬魚肝臟中大量免疫基因的表達(dá)，此外，Wei等[19]分別對草魚白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等六個免疫基因的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MC-LR可抑制這些免疫基因表達(dá)。這些研究均從分子水平上揭示了MC-LR可對魚類的細(xì)胞因子有抑制作用。BAFF作為腫瘤壞死因子超家族（Tumor necrosis factor superfamily，TNFSF）成員，主要由單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及T細(xì)胞產(chǎn)生，可促進(jìn)B細(xì)胞成熟和分化，在免疫應(yīng)答中起重要作用，并與自身免疫密切相關(guān)[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示頭腎中BAFF基因的表達(dá)水平相比脾臟中BAFF的表達(dá)水平更易受到MC-LR的影響。郭瓊林和盧全章[21]對草魚各發(fā)育階段腎臟和脾臟進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)脾臟中紅細(xì)胞較多，占總細(xì)胞的94.6%，相比頭腎，草魚脾臟是機(jī)體內(nèi)主要的造血器官，但頭腎是粒細(xì)胞系、單核細(xì)胞系的主要發(fā)育場所。正是由于脾臟和頭腎細(xì)胞組成的差異性，可能導(dǎo)致了細(xì)胞因子分泌的差異性。BAFF基因作為一種細(xì)胞因子，因主要由單核細(xì)胞產(chǎn)生，可能在頭腎中的表達(dá)量更多，也可能粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞對MC-LR更為敏感，從而導(dǎo)致了頭腎中BAFF基因的表達(dá)水平相比脾臟中BAFF的表達(dá)水平更易受到MC-LR的影響。

有文獻(xiàn)表明，APRIL與BAFF關(guān)系很密切[22]。其在TNF結(jié)構(gòu)域有大約30%的同源性[23]，并且B細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）和跨膜蛋白活化物（Transmembrane activator and cyclophilin ligand interactor TACI，TNFRSF-13B）是它們的共同受體，APRIL和BAFF以及它們的受體組成了“APRIL/BAFF系統(tǒng)”，這個系統(tǒng)在免疫方面起著非常重要的作用[24]。本研究中，經(jīng)不同劑量的MC-LR處理，APRIL在頭腎中的表達(dá)均被抑制，尤其在100 μg MC-LR·kg-1BW處理組中APRIL基因抑制最強(qiáng)，相對表達(dá)抑制百分比為7%；在脾臟組織中，APRIL盡管在25 μg MC-LR·kg-1BW低劑量中的表達(dá)沒有顯著變化，但相對于對照組來說，相對抑制百分比也達(dá)到了63%，因此根據(jù)脾臟和頭腎中APRIL基因表達(dá)變化來看，MC-LR可明顯影響這些B淋巴細(xì)胞相關(guān)的表達(dá)因子，從而影響魚類的免疫系統(tǒng)。當(dāng)然，僅通過檢測BAFF和APRIL這兩個B淋巴細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子的表達(dá)，還是難以全面評價MC-LR對魚類細(xì)胞因子的影響，故在今后的研究中，將從多基因角度檢測MC-LR對魚類細(xì)胞因子的影響。

4 結(jié)論

本研究從免疫器官和免疫基因兩方面檢測了不同濃度MC-LR對草魚免疫系統(tǒng)的影響，隨著MC-LR劑量的增加和時間的延長，脾臟和頭腎的病理變化更明顯，并呈現(xiàn)劑量和時間效應(yīng)。從基因水平發(fā)現(xiàn)MCLR可明顯抑制B淋巴細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子BAFF和APRIL的表達(dá)，這些結(jié)果均說明MC-LR對草魚免疫功能有明顯的抑制作用。當(dāng)生物體被有毒物質(zhì)等脅迫后，會有一系列的基因產(chǎn)生變化，這些基因可以作為生物化學(xué)標(biāo)記以檢測有機(jī)體是否處于不利環(huán)境。從本研究結(jié)果中BAFF和APRIL的表達(dá)來看，MC-LR對這兩個基因的影響沒有時間和劑量效應(yīng)，盡管這兩個基因?qū)C-LR比較敏感，但并不能作為預(yù)警MC-LR的基因標(biāo)記物。因此，在今后的研究中將著重從更多細(xì)胞因子中篩選一些基因標(biāo)記物預(yù)警MC-LR對生態(tài)環(huán)境的影響，為MC-LR的風(fēng)險評估奠定基礎(chǔ)。

[1]Puddick J,Prinsep M R,Wood S A,et al.High levels of structural diversity observed in microcystins from Microcystis CAWBG11 and characterization of six new microcystin congeners[J].Marine Drugs,2014,12（11）：5372-5395.

[2]Rymuszka A.Microcystin-LR induces cytotoxicity and affects carp immune cells by impairment of their phagocytosis and the organization of the cytoskeleton[J].Journal of Applied Toxicology,2013,33（11）：1294-1302.

[3]Manning M J.Immunology：A comparative approach[C]//Turner R J（Eds.）,Chichester：John Wiley and Sons Press,1994：66-99.

[4]RijkersGT,Frederix-WoltersEM,VanMuiswinkelWB.Thehaemolytic plaque assay in carp（Cyprinus carpio）[J].Journal of Immunological Methods,1980,33（1）：79-86.

[5]Pathak N,Khandelwal S.Impact of cadmium in T lymphocyte subsets and cytokine expression：Differential regulation by oxidative stress and apoptosis[J].Biometals,2008,21（2）：179-187.

[6]Moore P A,Belvedere O,Orr A,et al．BLyS：Member of the tumor necrosis factor family and B lymphocyte stimulator[J].Science,1999,285（5425）：260-263．

[7]Woo S J,Im J,Jeon J H,et al.Induction of BAFF expression by IFN-γ via JAK/STAT signaling pathways in human intestinal epithelial cells[J].Journal of Leukocyte Biology,2013,93（3）：363-368.

[8]Pieper K,Grimbacher B,Eibel H.B-cell biology and development[J].Journal of Allergy and Clinical Immunology,2013,131（4）：959-971．

[9]Pradet-Balade B,Medema J P,López-Fraga M,et al.An endogenous hybrid mRNA encodes TWE-PRIL,a functional cell surface TWEAKAPRIL fusion protein[J].EMBO Journal,2002,21：5711-5720.

[10]Dillon S R,Gross J A,Ansell S M,et al.An APRIL to remember：novel TNF ligands as therapeutic targets[J].Nature Reviews Drug Discovery,2006,5（3）：235-246.

[11]Wei L L,Sun BaoJian,Nie Pin.Ultrastructural alteration of lymphocytes in spleen and pronephros of grass carp（Ctenopharyngodon idella）experimentally exposed to microcystin-LR[J].Aquaculture,2008,280（1-4）：270-275.

[12]Trinchet I,Djediat C,Huet H,et al.Pathological modifications followings sub-chronic exposure of medaka fish（Oryzias latipes）to microcystin-LR[J].Reproductive Toxicology,2011,32（3）：329-340.

[13]Carbis C R,Rawlin G T,Mitchell G F,et al.The histopathology of carp,Cyprinus carpio L.,exposed to microcystins by gavage,immersion and intraperitoneal administration[J].Journal of Fish Diseases,1996,19（3）：199-207.

[14]Trinchet I,Djediat C,Huet H,et al.Pathological modifications followings sub-chronic exposure of medaka fish（Oryzias latipes）to microcystin-LR[J].Reproductive Toxicology,2011,32（3）：329-340.

[15]Couillard C M,Williams P J,Courtenay S C,et al.Histopathological evaluation of Atlantic tomcod（Microgadus tomcod）collected at estuarine sites receiving pulp and paper mill effluent[J].Aquatic Toxicology,1999,44：263-278.

[16]Secombes C J,Wang T,Bird S.The interleukins of fish[J].Developmental&Comparative Immunology,2011,35：1336-1345.

[17]Ryffel B.Role of proinflammatory cytokines in a toxic response：Application of cytokine knockout mice in toxicological research[J].Toxicology Letters,1995,82-83：477-482.

[18]Wei L L,Sun B J,Song L R,et al.Gene expression profiles in liver of zebrafish treated with microcystin-LR[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2008,26（1）：6-12.

[19]Wei L L,Sun B J,Chang M X,et al.Effects of cyanobacterial toxin microcystin-LR on the transcription levels of immune-related genes in grass carp Ctenopharyngodon idella[J].Environmental Biology of Fishes,2009,85（3）：231-238.

[20]Schneider P.The role of APRIL and BAFF in lymphocyte activation[J].Current Opinion in Immunology,2005,17：282-289.

[21]郭瓊林,盧全章.草魚腎臟和脾臟血細(xì)胞發(fā)育過程的觀察[J].水生生物學(xué)報,1993,17（1）：40-45.

GUO Qiong-lin,LU Quan-zhang.Observation on the development of blood cells in kidney and spleen of grass carp[J].Acta Hydrobiologica Sinica,1993,17（1）：40-45.

[22]Hahne M,Kataoka T,Schr?te M,et al.APRIL,a new ligand of the tumor necrosis factor family,stimulates tumor cell growth[J].Journal of Experimental Medicine,1998,188（6）：1185-1190.

[23]Rennert P,Schneider P,Cachero T G,et al.A soluble form of B cell maturation antigen,a receptor for the tumor necrosis factor family member APRIL,inhibits tumor cell growth[J].Journal of Experimental Medicine,2000,192（11）：1677-1684.

[24]Wu Y,Bressette D,Carrell J A,et al.Tumor necrosis factor（TNF）receptor superfamily member TACI is a high affinity receptor for TNF family members APRIL and BLys[J].Journal of Biological Chemistry,2000,275（45）：35478-35485.

Acute effects of microcystin-LR on the microstructure of spleen and head kidney and the expression of BAFF and APRIL genes in grass carp

WEI Li－li1,LIU Yi2,WANG Zi－rui1,RUAN Ji－ming1,ZHOU Ying1,XIONG Liu－feng1,ZHONG Qi－wang3*
（1.College of animal science and technology,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.College of Life Sciences,Jiangxi Normal University,Nanchang 330022,China;3.College of Bioscience and Bioengineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China）

In order to investigate the immunotoxicity of microcystin－LR（MC－LR）in grass carp,an acute toxicity test was used.The grass carp individuals were injected intraperitoneally with different doses of MC－LR,and the histopathologies of their spleens and head kidneys were evaluated after 24,48,72,and 96 h.The results showed that cell vacuolization occurred and the number of melano－macrophages first increased and then decreased,especially in the 75－ and 100－μg MC－LR·kg－1groups at 48 h,and the volume of melano－macrophage center was significantly increased.The sinusoid broadening,lymphocyte disordering,and angiectasis were mainly observed in the head kidney.Inthe 75－ and 100－μg MC－LR·kg－1groups,the lymphoid tissues were loosely and disorderly arranged,showing the vacuolization and even dissolution of some lymphocytes.Furthermore,a quantitative RT－PCR was applied to detect the expression of the BAFF and APRIL genes in the spleen and head kidney of the grass carp individuals exposed to MC－LR for 96 h.The expressions of both BAFF and APRIL genes were downregulated to different extents.The BAFF gene was significantly inhibited in the spleen of the 75－μg MC－LR·kg－1group individuals（P＜0.05）,and it was significantly inhibited in the head kidney of the 75－ and 100－μg MC－LR·kg－1group individuals.Moreover,the APRIL gene was significantly inhibited in the spleen and head kidney of all groups,except for the spleen of the 25－μg MC－LR·kg－1group individuals（P＜0.05）.This study suggested that MC－LR could damage the immune organs and inhibit the genes related to B－lymphocyte proliferation in a time－ and dose－dependent manner.The above－mentioned histological damage and gene expression changes indicate that MC－LR reduces the immune function of fish.

microcystin－LR;grass carp;spleen;head kidney;histopathology;BAFF;APRIL

X503.225

A

1672－2043（2017）12－2379－09

10.11654/jaes.2017－0764

隗黎麗，劉 毅，王自蕊，等.MC－LR急性脅迫對草魚脾臟、頭腎顯微結(jié)構(gòu)及BAFF和APRIL基因表達(dá)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（12）：2379－2387.

WEI Li－li,LIU Yi,WANG Zi－rui,et al.Acute effects of microcystin－LR on the microstructure of spleen and head kidney and the expression of BAFF and APRIL genes in grass carp[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（12）：2379－2387.

2017－05－28 錄用日期：2017－08－09

隗黎麗（1976—），女，副教授，博士，主要從事魚類免疫學(xué)研究。E－mail：hbliliwei@163.com

*通信作者：鐘其旺 zhongqw2000@163.com

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460146，31260643，31760764）

Project supported：The National Natural Science Foundation of China（31460146，31260643，31760764）