張海艷 周贊虎 胡元慶 劉 斌

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 福建漳州 363000；2.漳州出入境檢驗檢疫局；3.閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)）

1 前言

沙門菌是一種常見的食源性致病菌，據(jù)統(tǒng)計在世界上很多地方的細(xì)菌性食物中毒中，沙門菌引起的食物中毒常列首位。國家衛(wèi)生計生委辦公廳關(guān)于2015年全國食物中毒事件情況的通報[1]中顯示：我國2015年的食品安全事件中，生物性食物中毒事件的中毒人數(shù)最多，占全年食物中毒總?cè)藬?shù)的53.7%；主要致病因子為沙門菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌等，其中沙門菌位列第一位。

沙門菌屬于革蘭陰性腸道桿菌，已發(fā)現(xiàn)近2 000多種血清型，其中與人體疾病有關(guān)的主要血清型有腸炎沙門菌、鼠傷寒沙門菌、豬霍亂沙門菌等。而根據(jù)Mellory[2]統(tǒng)計研究顯示，日、美等發(fā)達(dá)國家發(fā)生的食物中毒事件中，40%～80%由禽沙門菌引起，其中主要病原為腸炎沙門菌。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是 Notomi等[3]建立的一種新的核酸擴(kuò)增方法，該方法具有特異、高效、快速等優(yōu)點，可在恒溫條件下60 min內(nèi)擴(kuò)增目的DNA，特別適用于大量樣品的快速檢測和篩選。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確檢測食品中腸炎沙門菌的方法并進(jìn)行實際應(yīng)用，以滿足食品安全對致病菌的快速檢測要求。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

腸炎沙門菌 （Salmonella Enteritidis CMCC 50335）、腸炎沙門菌 （Salmonella Enteritidis ATCC 13076）、腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis CNF56）、腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis CNF73）、腸炎沙門菌（Salmonella Enteritidis CNF75）、阿博尼沙門菌（Salmonella Abony NCTC 6017）、甲型副傷寒沙門菌（Salmonella Paratyphi A CMCC 50093）、乙型副傷寒沙門菌（Salmonella Paratyphi B CMCC 50094）、丙型副傷寒沙門菌 （Salmonella Paratyphi C CMCC 50017）、浦那沙門菌（Salmonella Poona NCTC 4840）、鼠傷寒沙門菌 （Salmonella Typhimurium ATCC 14028）、塔拉哈西沙門菌 （Salmonella Tallahassee ATCC 12002）、維洛爾沙門菌 （Salmonella Vellore ATCC 15611）、鴨沙門菌（Salmonella Anatum ATCC 9270）、亞利桑那沙門菌 （Salmonella arizonae ATCC 13314）、 嬰兒沙門菌 （Salmonella Infant ATCC 51741）、豬霍亂沙門菌 （Salmonella Choleraesuis ATCC 10708）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis ATCC 6633）、弗氏擰檬酸桿菌 （Citrobacter freundii ATCC 8090）、 陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacaekk ATCC 13047）、阪崎腸桿菌 （Enterobacter sakazakii ATCC 50205）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC 11246）、大腸桿菌 （Escherichia coli ATCC 25922）、單核細(xì)胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ATCC 10890）、單核細(xì)胞增生李斯特菌 （Listeria monocytogenes ATCC 15313）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris ATCC 33425）、蠟樣芽孢桿菌 （Bacillus cereus CMCCCB76330）、痢疾志賀菌 （Shigella dysenteriae CMCC 51335）、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC6538）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus ATCC 33846）、 霍亂弧菌 （Vibrio cholerae ATCC 25871）共32個菌株：均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；

Bst DNA聚合酶大片段：NEB公司；甜菜堿：Sigma公司；dNTPs、SYBR Green I 染料：上海生工；其他試劑均為分析純級。

2.1.2 儀器設(shè)備

TGRADIENT 96梯度PCR儀：德國Biometra公司；FIREREADER凝膠成像儀：英國UVItec公司；XMTD-204水浴鍋：江蘇省金壇市江南儀器廠。

2.2 方法

2.2.1 DNA模板制備

取單菌落于100 μL無菌水，100℃水浴10 min，冰浴2 min，12 000 g離心2 min，上清液即為模板DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 引物設(shè)計與合成

將基因庫里腸炎沙門菌基因組中的基因序列，利用NCBI BLAST上的軟件，與其他血清型的沙門菌的基因組和非沙門菌的基因組進(jìn)行比較，選擇出只有腸炎沙門菌才有的基因序列，獲得腸炎沙門菌特異基因SEN1393。該基因序列只存在于腸炎沙門菌中，而沙門菌的其他血清型以及非沙門菌的菌株基因組中均未發(fā)現(xiàn)此基因。根據(jù)SEN1393基因設(shè)計腸炎沙門菌LAMP引物（表1），引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

表1LAMP引物

2.2.3 LAMP反應(yīng)體系初建

根據(jù)文獻(xiàn)[4]，LAMP 基本反應(yīng)體系為 25 μL，外引物：內(nèi)引物：環(huán)引物為1∶8∶8，F(xiàn)3和B3各0.2 μmol/L，F(xiàn)IP 和 BIP 各 1.6 μmol/L，LF 和 LB 各 1.6 μmol/L，dNTP Mixture 1.6 mmol/L，ThermoPol緩沖液 1×，甜菜堿 0.8 mol/L，MgSO48 mmol/L，DNA 模板2 μL，8 U Bst DNA 聚合酶 0.5 μL， 加雙蒸水至 25 μL。反應(yīng)混合物先在95℃ 加熱5 min使DNA解鏈，然后在63℃孵育60 min，最后在85℃、10 min終止反應(yīng)。

2.2.4 LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

反應(yīng)體系（25 μL）分別進(jìn)行反應(yīng)溫度和引物濃度比例優(yōu)化，每組反應(yīng)進(jìn)行3個重復(fù)。反應(yīng)溫度分別設(shè)為 58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；引物濃度設(shè)置引物配比（外引物：內(nèi)引物：環(huán)引物）分別為 1 ∶1 ∶1、1 ∶2 ∶2、1 ∶2 ∶4、1 ∶4 ∶2、1 ∶4 ∶4、1 ∶8 ∶2、1∶8∶4、1∶8∶8等 8組濃度比。

2.2.5 特異性實驗

用5株不同的腸炎沙門菌菌株、12株常見的非腸炎沙門菌菌株和15株食品中常見的污染菌菌株進(jìn)行特異性驗證；提取以上各種菌株基因組DNA，用2.2.4節(jié)優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測，驗證該方法檢測腸炎沙門菌的特異性。

2.2.6 敏感性實驗

將提取的腸炎沙門菌ATCC13076菌株的DNA模板稀釋10個梯度，進(jìn)行檢測；DNA濃度依次為9.4 ng/μL、940 pg/μL、94 pg/μL、9.4 pg/μL、940 fg/μL、94 fg/μL、9.4 fg/μL、0.94 fg/μL、0.094 fg/μL、0.0094 fg/μL和無菌ddH2O，依據(jù)2.2.4優(yōu)化后的方法進(jìn)行檢測，確定該方法的檢出限。

2.2.7 食品樣品檢測

將購買的液體牛乳樣品分為15份，每份樣品249 mL。過夜培養(yǎng)的腸炎沙門菌CMCC50335進(jìn)行10倍梯度稀釋，每個梯度取1mL，分別按照106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL以及100 CFU/mL接入牛乳樣品中，每個梯度重復(fù)1次。并且將 1 mL無菌水接入1份牛乳樣品中作為對照。在室溫下培養(yǎng)12 h后，每個樣品取1 mL提取DNA，并按2.2.4優(yōu)化后的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。

3 結(jié)果

3.1 擴(kuò)增體系及參數(shù)優(yōu)化

按照引物對不同濃度配比進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖1）顯示，引物配比（外引物：內(nèi)引物：環(huán)引物）為1∶8∶4時，擴(kuò)增結(jié)果最好。

按照不同反應(yīng)溫度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，此范圍內(nèi)溫度對擴(kuò)增的影響較小，擴(kuò)增結(jié)果差異不明顯，因此選擇LAMP常用溫度60℃作為反應(yīng)溫度。

圖1 引物濃度對LAMP的影響

圖2 反應(yīng)溫度對LAMP的影響

最終確定的檢測體系為：LAMP反應(yīng)體系（25 μL）：2×反應(yīng)緩沖液 12.5 μL，8 U/μL Bst DNA 聚合酶 1 μL，10 μmol/L 外引物（F、B3）各 0.25 μL，10 μmol/L 內(nèi)引物（FIP、BIP）各 2.0 μL，環(huán)引物 10 μmol/L（LF、LB）各 1.0 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 1 μL。 60℃ 60 min。

3.2 特異性

以建立的LAMP體系進(jìn)行特異性檢測，共檢測17株沙門菌和15株非沙門菌，結(jié)果見表2，只有腸炎沙門菌可以檢測出陽性擴(kuò)增。

表2 實驗用菌株

（續(xù)表 2）

3.3 靈敏度

敏感性實驗結(jié)果見圖3，引物的檢測靈敏度為94 fg/μL。

3.4 樣品檢測

圖3 靈敏度檢測結(jié)果

4 討論與結(jié)論

腸炎沙門菌作為細(xì)菌性食物中毒主要致病菌受到人們的廣泛關(guān)注，但目前對于腸炎沙門菌的檢測標(biāo)準(zhǔn)[4]仍停留在傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和后續(xù)的生理生化鑒定上，該方法不但操作繁瑣，血清學(xué)檢測也容易出現(xiàn)偏差，而且檢測周期很長，不能滿足現(xiàn)代社會對食品安全快速檢測要求；不少研究[5-7]采用PCR技術(shù)對

圖4 牛乳樣品檢測

以建立的LAMP體系檢測15份外購液體牛乳樣品，結(jié)果見圖4，除了接菌量為100CFU/mL濃度的樣品和對照樣品沒有擴(kuò)增外，其余樣品均檢測出陽性結(jié)果。腸炎沙門菌進(jìn)行快速檢測研究，但其檢測過程需要PCR儀等貴重儀器，且對操作人員技術(shù)水平要求較高，這樣造成PCR技術(shù)難以在基層推廣。而LAMP技術(shù)具有操作簡便，反應(yīng)速度快，設(shè)備要求低等優(yōu)點，目前已在很多食源致病菌檢測[8-15]中運用。

目前國內(nèi)用LAMP技術(shù)檢測腸炎沙門菌的報道較少，袁發(fā)滸[16]根據(jù)Agron[17]報道的lygD基因為特異性靶基因，設(shè)計優(yōu)化了一套LAMP引物來鑒定腸炎沙門菌，在鼠傷寒沙門菌和霍亂傷寒沙門菌等10種不同的干擾菌中特異性地檢出腸炎沙門菌；細(xì)菌培養(yǎng)液檢出限為23.3 CFU/mL。但lygD基因在腸炎沙門菌的研究很少，國內(nèi)未見其他研究者研究。本研究采用比較基因組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，獲得腸炎沙門菌的特異基因SEN1393，由此基因為檢測靶基因，建立的LAMP檢測體系具有高特異性和靈敏度，能夠快速識別腸炎沙門菌，而且操作簡單便捷，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)方法的不足。

本研究采用煮沸法提取模板DNA，并用其進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果均能檢測出目的菌，在保證方法特異性的前提下能達(dá)到方便、快速的目的。用該方法對食品中常見的致病菌做特異性檢驗，均未出現(xiàn)假陽性結(jié)果，顯示了良好的特異性。

5 結(jié)論

本研究建立的腸炎沙門菌LAMP檢測方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便、快捷、成本低等特點，適用于食品中腸炎沙門菌的快速檢測。

[1]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會.國家衛(wèi)生計生委辦公廳關(guān)于2015年全國食物中毒事件情況的通報 [A].國衛(wèi)辦應(yīng)急發(fā)〔2016〕5 號文，2016-04-01.

[2]MelloryS G，McCracken R M，S D Neill，eta1.Control，prevention and eradiction of Salmonella enteridis infection in broiler and broiler breader[J].Vet Rec，1989，（125）：545-548.

[3]NotomiT，OkayamaH，MasubuchiH，etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28 （12）：63-69.

[4]GB 4789.4-2010食品微生物學(xué)檢驗 沙門菌檢驗[S].

[5]李楠，趙思俊，王娟，等.肉雞生產(chǎn)鏈中腸炎沙門菌耐藥性分析及 ERIC-PCR 分型[J]. 食品科學(xué)，2016，37（3）：120-124.

[6]楊帆，王紅寧，張安云，等.多重PCR檢測病死雞中沙門菌方法的研究[J]. 四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，52（1）：163-169.

[7]榮策，孫銘英.建立Taqman探針實時熒光PCR檢測食品中腸炎沙門菌的方法[J]. 中國衛(wèi)生產(chǎn)業(yè)，2012，9（27）：7-9.

[8]邱宏，劉志杰，鄭瀚.快速檢測豬鏈球菌的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法（英文）[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2016，32（6）：539-545.

[9]孟雙，王毅.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在嗜水氣單胞菌檢測中的應(yīng)用[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2016，32（1）：1-6.

[10]梁華麗.海產(chǎn)品中霍亂弧菌實時濁度LAMP檢測方法的應(yīng)用[J]. 食品工程，2015，（4）：25-28.

[11]李月華，付博宇，馬曉燕.原料乳中志賀氏菌的實時熒光環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)研究[J]. 食品科技，2016，（1）：315-320.

[12]苑寧，梁磊，張?zhí)N哲.環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)快速檢測牛肉中的大腸桿菌 O157[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工（下），2015，（9）：49-52.

[13]程瀟，汪永信，劉娟娟，等.應(yīng)用LAMP檢測方法檢測乳制品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 [J].農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)：英文版，2015，16（8）：1584-1587.

[14]紀(jì)懿芳，胡文忠.海產(chǎn)品中副溶血弧菌的LAMP-HNB快速檢測技術(shù)[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（7）：142-148.

[15]時建立，彭喆，郭立輝.豬霍亂沙門菌LAMP檢測方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國動物檢疫，2015，32（8）：68-71.

[16]袁發(fā)滸，尹歡，李琦，等，腸炎沙門菌的LAMP檢測方法的建立[J]. 中國釀造，2013，32（4）：146-149.

[17]AGRON P，WALKER R，KINDE H，et a1.Identification by subtractive hybridization of sequences specific for Salmonella enterica serovar enteritidis[J].Appi Environ Mierob，2001，67（11）：4984-4991.