杜宇鑫　程英曜

杜宇鑫，陳英曜，葉楓，俞超

摘要：柑桔黑斑病是一種真菌型致病菌引起的高發(fā)性病害，對柑桔產(chǎn)業(yè)的危害極大。本文綜述總結(jié)了黑斑病病原菌的發(fā)現(xiàn)、檢測方法，以及遺傳多樣性分析技術(shù)，以期為該病的預(yù)防診斷提供參考。

關(guān)鍵詞：柑桔；黑斑病；病原菌；研究進展

柑桔是全球重要的水果品種之一，我國也是柑桔的種植地，種植柑桔品種繁多。柑桔黑斑?。–itrus Black Spot，CBS）是一種針對柑桔發(fā)作的真菌型病害，主要危害果實和葉片產(chǎn)生褐色或黑色病斑，CBS是柑桔產(chǎn)地的高發(fā)性病害。近年來，隨著柑桔出口量的增長和感病品種的推廣，CBS問題日益突顯。但國內(nèi)，有關(guān)CBS的研究報導(dǎo)較少，本文就黑斑病病原菌的發(fā)現(xiàn)、檢測方法及遺傳分析進行歸納分析，希望對后續(xù)該病害的防治有所幫助。

1病原菌的發(fā)現(xiàn)

1895年，Benson初次在澳大利亞一柑桔園中發(fā)現(xiàn)CBS，并發(fā)表CBS病果的圖片。1948年，Kiely在澳大利亞東南部發(fā)現(xiàn)CBS病菌為柑桔球座菌并命名為Guignardia citdcarpa Kiely，該病菌屬子囊菌門、腔菌綱、座囊菌目、座囊菌科、球座菌屬。Mcalpine初次將該病害病原鑒定為柑桔莖點霉Phoma citricmpa McAlpine。1973年，Van der Aa經(jīng)過翻閱資料和從新檢測模式菌，將柑桔莖點霉歸到葉點霉屬，重新命名為柑桔葉點霉菌Phyllosticta citricarpa McAlpine VanderAa。因國外發(fā)現(xiàn)并研究較早，所以對國內(nèi)研究帶來諸多便利條件。

1919年日本學(xué)者澤田兼吉在臺灣澤田兼吉發(fā)現(xiàn)CBS，隨后Lee報導(dǎo)了我國南部地區(qū)CBS調(diào)研情況。Fawcett在1936年記錄CBS在我國福建、云南、浙江等主要產(chǎn)區(qū)出現(xiàn)。朱偉生和曾憲銘對引起CBS的病原菌先后做了全面報導(dǎo)。肖育貴、呂良瓊等對檸檬黑星病病原菌進行系統(tǒng)研究，認(rèn)為誘發(fā)檸檬黑斑病的病原是球殼孢目科莖點霉屬的真菌（Phoma catracarpa）。蒲占清等對浙江臺州地區(qū)CBS的發(fā)生情況進行了調(diào)查研究，發(fā)現(xiàn)臺州黃巖地區(qū)CBS染病比較普遍，其中當(dāng)?shù)卦缃?、慢桔和黃巖蜜柑染病較嚴(yán)重。

2病原菌的檢測

2.1形態(tài)鑒定

柑桔果皮病斑的分生孢子和孢子器的顯微形態(tài)可作為鑒定柑桔葉點霉的根據(jù)。如果病斑上有分生孢子器，可直接用顯微鏡檢查其分生孢子器和分生孢子特征；如無分生孢子器，則可誘導(dǎo)帶病斑的果皮形成分生孢子器。但誘導(dǎo)產(chǎn)生分生孢子器至少需要5d。鑒定柑桔葉點霉可從病灶組織中分離培養(yǎng)并在特定培養(yǎng)基上形成具有特征性的菌落和分生孢子。但是，病菌培養(yǎng)緩慢，生長出典型的菌落至少需要2～3d，分離過程中常常受生長較快的其余類真菌的污染。而且，果實上的內(nèi)生菌P.capitalensis也會干擾依據(jù)培養(yǎng)性狀和孢子形態(tài)的診斷。這些傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法不但需要熟練的技術(shù)人員操作，而且耗時耗力，操作相對隨機。許多植物病原菌在侵染后具有相似的癥狀，這給識別病原菌帶來困難，不夠準(zhǔn)確，需要多種方法來做同一檢測”。

產(chǎn)生類似CBS的病斑也有其他真菌或昆蟲的侵害的可能性。這些因素對依據(jù)癥狀診斷CBS帶來困難。故開發(fā)了一些較為準(zhǔn)確、高效的分子鑒定方法。

2.2分子檢測

2.2.1基于ITS序列的PCR檢測。基于種群特異性的ITS序列PCR檢測對于黑斑病已經(jīng)成為當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法。

Bonants等分析病原菌（P.citdcarpa）和非致病病原菌（P.capitalensis）的ITS區(qū)域，分別設(shè)計出特異性引物GCF3/GCR7和GCF2/GCR4。特異性引物GCF3/GCR7可以鑒定出60%～70%沒有分生孢子器的病斑，鑒定出90%具有分生孢子器的病斑。為了更快地區(qū)分這2個種，Meyer等發(fā)明了一天快速區(qū)分2個種的方法，通過分析ITS區(qū)域設(shè)計了針對于致病病原菌的特異性引物CITRIC1/ITS4 580bp，針對于非致病病原菌的特異性引物CAMEL2/ITS4 430bp，利用設(shè)計好針對不同種的特異性引物可以在短時間內(nèi)快速鑒定病原菌。為提高鑒定病原菌的效率，Peres等在對比之前設(shè)計的種特異性引物發(fā)現(xiàn)P.citricarpa特異性引物CITRIC1/ITS4不能擴增出單個病斑提取的病原菌DNA，即檢測靈敏度較低。因此在ITS區(qū)域設(shè)計了靈敏度高、特異性好的特異性引物GCN/GCMR，該引物可以擴增單個病斑提取的病原菌DNA，該靈敏度分別是引物GCF3/GCR7和CITRIC1/ITS4的10倍、100倍。

基于ITS序列的PCR檢測方法無法準(zhǔn)確無誤地鑒定該菌。故出現(xiàn)基于RAPD的檢測方法。

2.2.2 qPCR檢測方法。定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）是當(dāng)今世界用于最先進核酸分子診斷技術(shù)之一，具有操作簡單、檢測時間短、精度高等特點，已被廣泛用于定量化檢測真菌病原菌。

Brouwershaven等用PCR和qPCR檢測技術(shù)對采用不同方法提取的病源菌DNA進行ITS序列的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)qPCR的檢測精確度最高，可以檢測較低濃度的柑桔黑斑病病原菌DNA。為了得到致病菌和非致病菌準(zhǔn)確且快速高效檢測，van GENT-PELZER等在ITS區(qū)域設(shè)計探針，利用qPCR的方法區(qū)分P.cilri-carpa和P.Capitalensis，特異性和靈敏度都優(yōu)于普通PCR方法。Stringari等在隨機擴增多態(tài)性DNA標(biāo)記技術(shù)（RAPD）的基礎(chǔ)上設(shè)計出針對P.citricarpa的特異性引物。

由于基于qPCR的檢測技術(shù)精度較高而被專家學(xué)者采用，但其依然存在對儀器設(shè)備要求高、需要采用熒光染料和對引物要求高等弊端。

3病原菌遺傳多樣性分析

3.1 RAPD分子標(biāo)記技術(shù)

柑桔葉點霉會導(dǎo)致果皮呈現(xiàn)黑色病斑。因病斑與柑桔球座菌誘發(fā)的病斑類似，所以Danyelle等對收集的樣本進行擴增DNA（RAPD）和序列的擴增區(qū)域特征分析（SCARS），結(jié)果表明這2種方式都能有效地區(qū)別致病菌和非致病菌在形態(tài)學(xué)上十分相似的病菌。

Possiede等用RAPD技術(shù)對已具有苯菌靈（Benomyl）抗性的柑桔球座菌進行檢測，猜想可能由于菌株擁有復(fù)雜的基因從而使該菌株對苯菌靈產(chǎn)生抗性。此外，Chirlei和Tedford等通過RAPD分析研究柑桔球座菌發(fā)現(xiàn)病菌的基因相似程度與寄主不相關(guān)，Ricardo等用熒光素標(biāo)記的選擇性擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（Fluorescent Amplified Fragment Length Poly-morphism，fAFLP）對疑似CBS樣本進行分析，發(fā)現(xiàn)CBS致病病菌和非致病病菌發(fā)源于共同的祖先，但環(huán)境等因素會引發(fā)其進化。

基于RAPD檢測雖然有操作方便、不需要基因克隆、靈敏度好，能表現(xiàn)出豐富的多態(tài)位點等優(yōu)點，但也有諸多弊端，例如模板濃度、PCR的循環(huán)次數(shù)等都會因RAPD的檢測重復(fù)性差而導(dǎo)致失敗。

3.2 AFLP分子標(biāo)記技術(shù)

擴增片段長度多態(tài)性技術(shù)（AFLP）并連系限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記技術(shù)（RFLP）和PCR技術(shù)優(yōu)點，同時兼?zhèn)淞烁咝?、可靠性、可重?fù)性和所需DNA微量性的優(yōu)點。Baayen等利用限制性內(nèi)切酶Mspl和EcoRI用AFLP技術(shù)對樣本進行分析得出與ITS序列的結(jié)果相同并確定出柑桔球座菌。

AFLP分子標(biāo)記技術(shù)雖然具有RAPD和RFLP穩(wěn)定性高的優(yōu)點，但也需要較高的純度和反應(yīng)條件。所以也可采取第2代ISSR標(biāo)記技術(shù)。

3.3 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)

Zietkeiwitcz等建立一種在微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)（ISSR）。為得到柑桔葉點霉菌種遺傳多樣性分析的ISSR反應(yīng)的合適體系，王興紅等針對一系列影響較大的因素對ISSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化。

與之前方法相比，不需了解物種遺傳背景、操作便捷、引物設(shè)計簡單以及成本低廉都是ISSR分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)勢。但該技術(shù)缺點則是易受許多因素的干擾，在不適宜的條件下會導(dǎo)致圖譜拖帶、擴增條帶彌散甚至消失，嚴(yán)重影響后期的鑒定和分析。因此在ISSR技術(shù)進行分析之前，需要找到適合的條件，以確保試驗的準(zhǔn)確性。盡管此標(biāo)記方法弊端較多但也在諸多方面體現(xiàn)出其優(yōu)于其他技術(shù)標(biāo)記手段的方面，并且為今后采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對遺傳多樣性的分析打下堅實理論和技術(shù)的基礎(chǔ)。

4展望

早期的形態(tài)學(xué)鑒定雖具有直觀便捷的優(yōu)勢，但在準(zhǔn)確分析判定和區(qū)分方面依然存在很大弊端，雖然分子檢測技術(shù)的推廣鑒定CBS上升了一個臺階，但由于各種檢測技術(shù)都存在其自身的利弊，所以今后在研究和鑒定CBS時應(yīng)選取適合的技術(shù)。

目前大多數(shù)柑桔產(chǎn)區(qū)在病害暴發(fā)時噴灑化學(xué)農(nóng)藥。化學(xué)農(nóng)藥有無法在自然界中降解毒性并損害人們身體的弊端。在未來應(yīng)更深入地開展研究，尤其是在抑菌方向可篩選一些天然提取物制成更科學(xué)更綠色更健康的生物農(nóng)藥，并在一定程度上能夠抑制CBS的生長，不但為農(nóng)民的經(jīng)濟收益帶來保障，而且為保護環(huán)境作出重要貢獻(xiàn)，也對黑斑病的研究和防治提供更多參考和幫助。