劉婷姣

(大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院 口腔病理學教研室，遼寧 大連 116044)

專家述評

微流控芯片在腫瘤仿生模型構建中的應用

劉婷姣

(大連醫(yī)科大學 口腔醫(yī)學院 口腔病理學教研室，遼寧 大連 116044)

微流控芯片是一種在微米尺度下對流體進行精確操控的新技術，已被證明是對哺乳動物細胞及其微環(huán)境進行操控的理想平臺。本文擬圍繞腫瘤轉移過程中的一些關鍵環(huán)節(jié)，對微流控芯片在腫瘤仿生模型構建中的應用作一綜述。目前，基于微流控芯片技術構建的腫瘤仿生模型主要包括：腫瘤原發(fā)灶模型、腫瘤細胞誘導血管新生模型、腫瘤細胞內滲模型、腫瘤細胞外滲模型、腫瘤多器官轉移模型等。相對于傳統的體外研究方法，這些仿生模型很大程度上再現了體內的腫瘤微環(huán)境，逐漸成為腫瘤研究極重要的平臺。

微流控芯片；腫瘤；仿生模型

微流控芯片(microfluidic chip)又稱芯片實驗室(lab on a chip)，是一種可在微米尺度下精確操控流體的新技術，具有微型化和高通量的特點，并兼具可單元組合和功能集成的優(yōu)勢[1-4]。微流控技術可以同時處置分子、細胞、組織、器官，顯示物理量、化學量和生物量，已經被證明是對哺乳動物細胞及其微環(huán)境進行操控的理想平臺，它消耗低、通量高、仿生性強。得益于現代化的微加工技術和微通道內精準的流體控制，研究者已經可以在微流控芯片上構建微米量級且相對封閉的細胞培養(yǎng)、刺激、分選、裂解、分析等操作單元，并把這種成功延伸到組織和器官的仿生模擬[4]。目前，微流控芯片仿生肺、仿生肝、仿生腎、仿生心臟、仿生腸等已見諸報道，這些研究從學術角度證明，在一塊僅有幾平方厘米的薄片上模擬人體生理結構，實現所謂芯片器官(organ on a chip)已經可行[5-9]。

腫瘤是全球性疾病，在導致人類死亡的疾病中位居第二，僅次于心血管疾病，遠處轉移是導致患者死亡的最主要原因。腫瘤轉移是個復雜的過程，以血行轉移為例通常包括以下幾個步驟：(1)瘤細胞在原位增殖、侵襲；(2)原發(fā)灶瘤細胞進入血管，即內滲；(3)瘤細胞逃避免疫監(jiān)視在血液循環(huán)中存活下來，成為循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)；(4)CTC在遠處器官黏附于內皮細胞并穿出血管，即外滲；(5)進入遠處器官的瘤細胞克隆性增殖形成轉移灶[10-13]。本課題組是國內較早從事醫(yī)學與微流控芯片學科交叉研究的科研團隊，我們以微流控芯片為技術平臺成功構建了多個腫瘤模型。以下將圍繞腫瘤轉移過程中的一些關鍵環(huán)節(jié)對微流控芯片在腫瘤仿生模型構建中的應用做一簡單介紹。

1 腫瘤原發(fā)灶模型

腫瘤原發(fā)灶是一個復雜的包括多種細胞(如瘤細胞和腫瘤間質細胞)、細胞外基質(extracellular matrix, ECM)和細胞因子的組織微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境對瘤細胞的生長、侵襲和轉移等發(fā)揮重要的調控作用[14-15]?；谖⒘骺匦酒哪[瘤原發(fā)灶模型主要是將瘤細胞、間質細胞、ECM和細胞因子等集成于一塊芯片，模擬腫瘤微環(huán)境。

傳統細胞培養(yǎng)器材包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶和孔板等，常常對細胞進行貼壁培養(yǎng)，即二維(two dimentional, 2D)細胞培養(yǎng)。但是，越來越多的研究結果證實當細胞處于由ECM組成的三維(three dimentional, 3D)微環(huán)境中時，其生物學行為及所表達的基因更接近于體內狀況，由此導致體外3D細胞培養(yǎng)被越來越多的研究者所重視并采納[16-19]。目前常用的ECM替代物包括商品化的基底膜樣物質，例如BD公司的Matrigel TM和R&D公司的Cultrex PathClear Basement Membrane Extract(BME)。此外，I型膠原也常被用于細胞3D培養(yǎng)。在微流控芯片上進行的細胞3D培養(yǎng)，不但為細胞提供ECM支架，還可以利用微流控技術在ECM內形成生長因子的濃度梯度，考察癌細胞在生長因子誘導下的侵襲過程(圖1A)[20]。3D培養(yǎng)的腫瘤細胞還常常表現出對化療藥物的耐藥性增加[21-23]。因此，基于微流控芯片的細胞3D培養(yǎng)有可能成為篩選化療藥物的一個重要平臺[24-26]。

除ECM以外，腫瘤微環(huán)境中的間質細胞對腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的調控作用[27-29]。研究者利用微流控芯片的多維網絡結構為不同種類的細胞構建培養(yǎng)空間，在芯片上實現異種細胞的3D共培養(yǎng)，考察細胞間的相互作用。例如，本課題組在微流控芯片平臺上實現了癌相關成纖維細胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)與唾液腺癌細胞的非接觸式3D共培養(yǎng)(圖1B)，發(fā)現在CAFs的誘導下癌細胞的侵襲能力明顯增強，以細胞團的形式侵入鄰近基質內[30]。Jeong SY等[31]研究者將結直腸癌細胞與成纖維細胞共培養(yǎng)，結果發(fā)現癌細胞的增殖活性和基因表達與單獨3D培養(yǎng)的癌細胞比較均發(fā)生明顯的變化。Kobayashi A等[32]利用微流控芯片細胞圖案化功能將肝癌細胞和成纖維細胞排列成緊密相鄰的條帶，結果表明肝癌細胞分泌白蛋白的功能顯著增強。這些實驗結果均表明癌細胞與間質細胞的3D共培養(yǎng)為癌細胞提供了一個與體內接近的微環(huán)境，這些微流控芯片有望成為腫瘤研究的理想平臺。

A:細胞3D培養(yǎng)微流控芯片；B:細胞3D共培養(yǎng)微流控芯片圖1 細胞3D培養(yǎng)及3D共培養(yǎng)微流控芯片[20, 30]Fig 1 Tumor cells 3D culture and co-culture on microfluidic chips[20,30]

2 腫瘤細胞誘導血管新生模型

血管新生(angiogenesis)是指從原有血管通過“芽生”的方式形成新的腔狀毛細血管的過程，涉及ECM的降解及血管內皮細胞的增殖[33]。出芽的內皮細胞包括位于最前端的端細胞(tip cells)和緊隨其后的莖細胞(stalk cells)及方陣細胞(phalanx cells)。端細胞具有長的絲足，侵襲能力較強，能夠引導其他內皮細胞朝著有血管生成刺激因素的方向生長；莖細胞緊隨端細胞之后，具有較強的增殖能力，可以形成新的管腔；在發(fā)育成熟的血管中，內皮細胞增殖活力較弱，緊密排列成方陣樣，有利于血流的順利通過，此處的內皮細胞稱為方陣細胞。

腫瘤組織的微血管密度常常高于正常組織，這是由于腫瘤細胞具有活躍的誘導血管新生能力[34-35]。體外構建腫瘤誘導的血管新生模型至少需要包括腫瘤細胞、血管內皮細胞、ECM、血管新生誘導因子等要素，并為血管新生提供適當的空間。本課題組以微流控技術為主要手段構建了一個腫瘤細胞誘導的血管新生體外模型，在微流控芯片上模擬腫瘤原發(fā)灶和微血管，二者之間以血管新生通道相連。研究結果表明瘤細胞的分泌物在血管新生通道內擴散形成濃度梯度，誘導血管內皮細胞出芽生長，產生具有長絲足的端細胞，位于新生血管的前沿。為進一步驗證微流控模型的可靠性，我們比較了不同腫瘤細胞在微流控模型和裸鼠皮下移植瘤模型中的誘導血管新生能力，結果表明體外模型與體內模型的結果具有一致性，提示該微流控模型可以部分取代動物模型[36]。Shin Y等[37]詳細描述了一種微流控芯片的設計，以及如何在芯片上進行腫瘤細胞和內皮細胞的3D-2D聯合培養(yǎng)，進而誘導血管新生。Kim S等[38]研究者構建了一個具有5條平行通道的微流控芯片，通道間以微柱相隔，在不同的通道內分別接種血管內皮細胞、周細胞、成纖維細胞和癌細胞，培養(yǎng)一段時間后，內皮細胞向ECM通道出芽生長，形成了具有管腔的微血管，這些微血管表達VE-cadherin、CD31、ICAM-1等正常微血管的標志物，而且具有血管的屏障功能，并在一定時間內保持穩(wěn)定(圖2)。最近，該研究小組利用微流控技術精確控制生長因子的濃度和空間分布、內皮細胞-間質細胞相互作用、間隙流對淋巴管內皮細胞的機械刺激等多種化學和機械因素，在與上述研究結構相同的微流控芯片上成功再現了淋巴管新生。間隙流是指在ECM間隙內流動的液體，可以在毛細血管、淋巴管、ECM之間進行物質傳遞，這種緩慢流動的液體還對位于ECM內的細胞產生剪切力刺激，從而影響細胞的增殖和分化等。上述研究在微流控平臺上證明間隙流對淋巴管的出芽和生長具有重要的調控作用[39]。

Ⅰ：微流控芯片照片及示意圖；Ⅱ：新生血管免疫熒光照片圖2 基于微流控芯片的血管新生[38]Fig 2 Angiogenesis on a microfluidic chip[38]

3 腫瘤細胞內滲模型

腫瘤細胞從原發(fā)灶侵入血管的內滲過程是腫瘤轉移的一個重要環(huán)節(jié)，動物模型研究很難抓住到這一短暫的關鍵點。Zervantonakis IK等[40]研究人員構建了用于研究腫瘤細胞內滲的微流控芯片，該芯片由3條平行的通道組成，之間以微柱相隔，中間通道充滿ECM替代物，兩側分別用于模擬微血管和腫瘤組織。研究者在該芯片上實時考察了腫瘤細胞與內皮細胞相互作用、瘤細胞穿過內皮細胞進入血管的動態(tài)過程，進一步發(fā)現巨噬細胞分泌的腫瘤壞死因子可以損傷血管內皮細胞的屏障功能，導致內滲腫瘤細胞數目顯著增加。Lee H等[41]在微流控芯片上將血管內皮細胞、成纖維細胞、腫瘤細胞接種于不同的空間，模擬體內腫瘤微環(huán)境，改變腫瘤細胞的培養(yǎng)方式(2D培養(yǎng)或3D培養(yǎng))和生長空間，腫瘤細胞表現出不同的生物學行為。例如將癌細胞進行3D培養(yǎng)時可以誘發(fā)血管新生，而將癌細胞進行2D培養(yǎng)時，可有誘發(fā)腫瘤細胞的內滲。

4 腫瘤細胞外滲模型

CTC經血液循環(huán)到達遠處器官，黏附于血管內皮細胞，穿出血管壁的過程稱為外滲，是腫瘤轉移過程中的一個重要限速步驟。體外構建腫瘤細胞外滲模型至少需要集成CTC、血管、特異性血管周圍組織等單元。生物學研究已經證實肺、肝、骨等器官高表達趨化因子CXCL12，乳腺癌細胞高表達CXCL12的受體CXCR4，CXCL12/CXCR4生物軸在乳腺癌的血行轉移中發(fā)揮重要作用[42-43]。本課題組在微流控芯片上構建了內襯血管內皮細胞的微血管、具有CXCL12濃度梯度的管周基質，然后將高表達CXCR4的腫瘤細胞團加入微血管單元，實時考察了腫瘤細胞團在趨化因子誘導下穿過血管內皮細胞進入管周組織的內滲過程及其影響因素[44]。Bersini S等[45]在微流控芯片上誘導骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞，用于模擬骨髓微環(huán)境，然后在鄰近骨髓微環(huán)境的微血管通道內加入乳腺癌細胞，考察癌細胞穿過血管內皮細胞屏障進入骨髓微環(huán)境的外滲過程(圖3)。

A：微流控芯片上細胞分布示意圖；B：芯片上面觀；C：芯片前面觀；D：茜素紅染色顯示成骨細胞分化；E：成骨細胞分泌骨鈣蛋白(綠色)圖3 基于微流控芯片的腫瘤細胞外滲研究[45]Fig 3 Tumor extravasation on a microfluidic chip[45]

5 腫瘤多器官轉移模型

腫瘤晚期可以發(fā)生多器官轉移，體外構建腫瘤多器官轉移模型有助于明確影響腫瘤轉移的相關因素，以及篩選抗腫瘤轉移藥物。本課題組以微流控芯片為平臺構建了腫瘤肺、肝、骨等多器官轉移模型。該模型包括兩個主要功能模塊，上層模塊包含4條分枝狀的微通道，用于模擬血管；下層模塊包括4個培養(yǎng)池，可以接種不同的細胞或組織，用于模擬不同的器官。我們在芯片模型上考察了肺、肝、骨、骨骼肌等原代細胞誘導的腫瘤轉移，結果表明腫瘤細胞趨向于轉移至仿生肺、肝、骨等單元，而很少轉移至仿生骨骼肌單元。通過與肺轉移動物模型相比較，腫瘤細胞在芯片模型上的轉移能力與在動物模型上基本一致，提示該芯片模型有望在某種程度上取代動物模型[46]。

6 展 望

實驗動物一直是腫瘤臨床前研究的重要模型，但是動物模型價格昂貴，實驗周期長，而且與人類存在種屬差異性，極大地限制了腫瘤基礎研究的發(fā)展和抗腫瘤藥物的研發(fā)。隨著材料學和微加工技術的不斷發(fā)展，微流控技術在仿生模型上的應用越來越廣泛，腫瘤仿生模型已逐漸克服以往細胞種類單一、功能簡單等缺陷，逐步發(fā)展成為多器官和多功能的系統模型。我們期待微流控腫瘤仿生模型在將來能夠逐漸替代實驗動物，推動腫瘤研究的發(fā)展。

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Biomimetictumormodelsbasedonmicrofluidicchips

LIU Tingjiao

(DepartmentofOralPathology，CollegeofStomatology，DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China)

Microfluidic chips, a new technology for precisely manipulating fluids at the micron scale, have proven to be ideal platforms for manipulating mammalian cells and their microenvironments. This article aims to review the application of microfluidic chips in the construction of tumor biomimetic models around some key parts of tumor metastasis. Currently, tumor biomimetic models based on microfluidic chip technology mainly include tumor primary tumor model, tumor cell induced angiogenesis model, tumor cell infiltration model, tumor cell extravasation model and tumor multi-organ metastasis model. Compared with the traditional in vitro research methods, these bionic models reproduce the in vivo tumor microenvironment to a large extent and gradually become an important platform for tumor research.

microfluidic chip; tumor; biomimetic model

國家自然科學基金項目(30700955, 30872897, 81171425, 81571767)；遼寧省教育廳項目(LR201013)；遼寧省科技廳項目(20071080)；中國博士后科學基金項目(20080441105)；大連市優(yōu)秀青年科技人才基金項目(2008J23JH037)

劉婷姣，教授，博士生導師。研究方向：基于微流控芯片的腫瘤仿生模型的構建和應用。E-mail: tingjiao@dmu.edu.cn

10.11724/jdmu.2017.06.01

R737. 33

A

1671-7295(2017)06-0521-06

劉婷姣.微流控芯片在腫瘤仿生模型構建中的應用[J].大連醫(yī)科大學學報，2017,39(6)：521-526.

2017-10-08；

2017-11-10)