郭崇勇，丁寶忠，李柏成，楊堯堯，周凌，賈宗師

(1濱州市人民醫(yī)院，山東濱州 256600；2上海市第四人民醫(yī)院)

三陰性乳腺癌組織中ALDH1、TGF-β1蛋白的表達(dá)變化及其對(duì)預(yù)后的影響

郭崇勇1，丁寶忠1，李柏成1，楊堯堯1，周凌2，賈宗師1

(1濱州市人民醫(yī)院，山東濱州 256600；2上海市第四人民醫(yī)院)

目的探討乳腺腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物乙醛脫氫酶1(ALDH1)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在三陰性乳腺癌中的表達(dá)變化及其對(duì)預(yù)后的影響。方法收集60例三陰性乳腺癌患者術(shù)中切取的乳腺癌組織，采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)乳腺癌組織中ALDH1與TGF-β1蛋白的表達(dá)。術(shù)后所有患者行化療，并隨訪6～60個(gè)月，采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)后影響因素。結(jié)果60例三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白陽性23例(38.33%)，TGF-β1蛋白陽性29例(48.33%)。ALDH1、TGF-β1蛋白陽性表達(dá)患者的5年總生存率均低于陰性患者(P均<0.05)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，ALDH1蛋白表達(dá)為三陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=4.70，P<0.05)。三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.506，P=0.001)。結(jié)論三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白表達(dá)增高，與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)，ALDH1為三陰性乳腺癌患者預(yù)后判斷的獨(dú)立影響因素。

乳腺腫瘤；腫瘤干細(xì)胞；乙酰脫氫酶1；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

三陰性乳腺癌好發(fā)于40歲以下的絕經(jīng)前女性，具有較高的侵襲性和異質(zhì)性，較其他亞型預(yù)后差，較早發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，無病生存期和總生存率較低。有效改善預(yù)后是目前治療的難點(diǎn)。腫瘤干細(xì)胞是一類具有自我更新、多向分化等特性的腫瘤細(xì)胞亞群，腫瘤干細(xì)胞學(xué)說的提出為乳腺癌的治療提供了全新的思路[1, 2]。近年研究證實(shí)，乙醛脫氫酶1(ALDH1)被認(rèn)為是乳腺腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[1]。本課題組前期研究證實(shí)，三陰性乳腺癌組織中ALDH1表達(dá)增高[3]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)通路是介導(dǎo)細(xì)胞上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的主體，而EMT是細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性的一種途徑[4]。因此，我們推測(cè)TGF-β1通路可能參與調(diào)控乳腺腫瘤干細(xì)胞。2010年2 月～2017年2月，我們觀察了60例三陰性乳腺癌患者腫瘤組織中ALDH1與TGF-β1蛋白的表達(dá)及其對(duì)預(yù)后的影響，探討ALDH1與TGF-β1蛋白在三陰性乳腺癌中的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010～2012年我院乳腺外科收治的三陰性乳腺癌患者60例，均為女性，年齡(51.32±11.70)歲。三陰性乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)：雌激素受體、孕激素受體表達(dá)陽性率<1%視為陰性；人類表皮生長(zhǎng)因子2表達(dá)為-或+為陰性；人類表皮生長(zhǎng)因子2表達(dá)為++，行熒光標(biāo)記的原位雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)果為陰性。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未接受化療、放療、內(nèi)分泌治療等抗腫瘤相關(guān)治療；患者均行乳腺癌改良根治術(shù)；術(shù)后按照美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南予以相應(yīng)的放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：Ⅳ期患者；隨訪資料不全者。

1.2 ALDHl、TGF-β1蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)辣根過氧化物酶(HRP)法。取術(shù)中切取的乳腺癌組織，制備3 μm厚度連續(xù)切片，切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)；滴加一抗，4 ℃過夜。滴加HRP試劑，DAB染色，蘇木素復(fù)染。具體操作按說明書進(jìn)行。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，以已知陽性標(biāo)本作為陽性對(duì)照。免疫組化結(jié)果判定由2名富有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)師對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行讀片判定。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取其均值。ALDH1、TGF-β1蛋白染色主要位于細(xì)胞質(zhì)。按切片中細(xì)胞有無顯色及顯色深淺進(jìn)行評(píng)分，無顯色為0分，淺棕色為1分，深棕色為2分。按顯色細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分：0%～10%為0分，11%～30%為1分，31%～70%為2分，>71%為3分。以上述2項(xiàng)評(píng)分之和作為積分，按積分高低判定表達(dá)水平，0分為陰性，1～2分為低表達(dá)，3～5分為高表達(dá)。

1.3 化療及隨訪方法 所有患者均術(shù)后予以化療，包括CMF方案6個(gè)周期(環(huán)磷酰胺+甲氨蝶呤+氟尿嘧啶)化療10例，CEF方案6個(gè)周期(環(huán)磷酰胺+表柔比星+氟尿嘧啶)化療15例，TEC方案6個(gè)周期(多西他賽+表柔比星+環(huán)磷酰胺)化療35例。每半年進(jìn)行電話隨訪一次，直至患者死亡事件發(fā)生。隨訪截止時(shí)間為2017年2月28日。共隨訪6～60個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。ALDH1蛋白與TGF-β1蛋白表達(dá)的相關(guān)性應(yīng)用Spearman相關(guān)性分析。生存分析采用Kaplan-Meier檢驗(yàn)比較生存差異，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三陰性乳腺癌組織中ALDH1、TGF-β1蛋白的表達(dá) ALDH1蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，TGF-β1蛋白主要分布于腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。60例乳腺癌原發(fā)灶中ALDH1蛋白陽性23例(38.33%)，TGF-β1蛋白陽性29例(48.33%)。

2.2 不同臨床病理特征患者的ALDH1、TGF-β1蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 不同臨床病理特征患者的ALDH1、TGF-β1蛋白表達(dá)比較(例)

2.3 ALDH1蛋白表達(dá)陽性、陰性患者的生存分析結(jié)果 ALDH1蛋白表達(dá)陽性患者的5年中位生存時(shí)間為(42.00±3.11)個(gè)月，5年總生存率為34.79%；ALDH1蛋白表達(dá)陰性患者的5年中位生存時(shí)間為(53.84±2.19)個(gè)月，5年無病生存率為78.38%。ALDH1蛋白表達(dá)陽性患者的5年總生存率低于陰性患者(χ2=11.23，P=0.001)。COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，ALDH1蛋白表達(dá)為三陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素(HR=4.70，P<0.05)。

2.4 TGF-β1蛋白表達(dá)陽性、陰性患者的生存分析結(jié)果 TGF-β1蛋白表達(dá)陽性患者的5年中位生存時(shí)間為(44.41±3.02)個(gè)月，5年總生存率為48.28%；TGF-β1蛋白表達(dá)陰性患者的5年中位生存時(shí)間為(53.87±2.20)個(gè)月，5年總生存率為74.19%。TGF-β1蛋白表達(dá)陽性患者的5年總生存率低于陰性患者(χ2=4.88，P=0.027)。

2.5 三陰性乳腺癌組織中ALDH1與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性 三陰性乳腺癌組織中ALDH1蛋白表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.506，P=0.001)。

3 討論

三陰性乳腺癌是指雌激素受體、孕激素受體及人類表皮生長(zhǎng)因子2表達(dá)均為陰性的乳腺癌，在乳腺癌中所占比例15%～20%，與其他亞型相比，通常發(fā)病年齡低，無特定治療靶點(diǎn)，無病生存期短，復(fù)發(fā)快，預(yù)后不良。大量數(shù)據(jù)證實(shí)，小部分具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞亞群具有較強(qiáng)的自我更新和分化的能力，可能是腫瘤最終復(fù)發(fā)的根源[1, 2]。因此，明確乳腺腫瘤干細(xì)胞在三陰性乳腺癌中發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，可為有效治療該亞型乳腺癌提供作用靶點(diǎn)。

ALDH1是一組能將乙醛氧化為乙酸的同工酶，能保護(hù)細(xì)胞免受醛過氧化物的損害。研究證實(shí)，500個(gè)ALDH1+的乳腺腫瘤細(xì)胞即可在小鼠體內(nèi)致瘤，ALDH1+腫瘤細(xì)胞具有自我更新、多向分化及較高致瘤的特性，可作為乳腺腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物[1]。既往研究表明，ALDH1蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)比例較低，陽性率<10%。本課題組前期研究證實(shí)，ALDH1蛋白在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)增高，達(dá)38.33%，表明在三陰性乳腺癌中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1蛋白增高[3]，提示三陰性乳腺癌的預(yù)后不良與ALDH1蛋白表達(dá)增高即腫瘤干細(xì)胞比例增高有密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1可作為乳腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)[3, 5]，且ALDH1也可作為三陰性乳腺癌的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物[6]。但ALDH1在三陰性乳腺癌中的表達(dá)變化及其對(duì)患者預(yù)后的影響尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1蛋白在三陰性乳腺癌組織中表達(dá)率為38.33%，提示在該亞型乳腺癌組織中表達(dá)增高，且與原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、臨床分期及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，ALDH1陽性的患者5年總生存率低于ALDH1陰性患者，ALDH1蛋白表達(dá)為三陰性乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，提示三陰性乳腺癌的預(yù)后不良可能與腫瘤干細(xì)胞比例增高有關(guān)。

TGF-β通路是介導(dǎo)細(xì)胞EMT過程的主體。TGF-β信號(hào)通路參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移[7, 8]。研究表明，TGF-β1在乳腺癌的早期作為一種抑制因子發(fā)揮作用，而在乳腺癌的晚期則促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號(hào)通路的相關(guān)基因在三陰性乳腺癌細(xì)胞系中呈高表達(dá)，TGF-β信號(hào)通路的激活能夠通過EMT促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，而EMT又是細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性的一種途徑[4, 10]。TGF-β1/Smad4 信號(hào)通路在腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化過程中發(fā)揮著重要作用[11]。TGF-β信號(hào)通路的相關(guān)因子可由腫瘤細(xì)胞分泌，并在Basal-like型乳腺癌細(xì)胞微環(huán)境中呈現(xiàn)高表達(dá)[12, 13]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1蛋白在三陰性乳腺癌中的陽性表達(dá)率為48.33%，且陽性患者的5年總生存率低于陰性患者，提示TGF-β1蛋白的表達(dá)與患者預(yù)后不良有關(guān)，TGF-β1蛋白的表達(dá)可能與乳腺腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，在介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，從而導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

TGF-β1的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其可能機(jī)制是TGF-β1通過其下游的Smad信號(hào)通路調(diào)控EMT的產(chǎn)生，而EMT又是腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞特性的途徑。我們推測(cè)TGF-β1通路可能是通過調(diào)控EMT過程，進(jìn)而調(diào)控ALDH1+乳腺腫瘤干細(xì)胞亞群的發(fā)生和發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β通路可調(diào)控乳腺腫瘤干細(xì)胞ALDH1亞群表達(dá)[14]。Shuang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，膽囊癌組織中TGF-β1可通過EMT介導(dǎo)ALDH+腫瘤干細(xì)胞亞群產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1陽性患者5年總生存率明顯低于TGF-β1陰性患者，且其表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物ALDH1呈正相關(guān)關(guān)系，提示 TGF-β1通路與腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展確有一定的相關(guān)性。 深入探討TGF-β1相關(guān)通路影響乳腺腫瘤干細(xì)胞特征的分子機(jī)制，可能會(huì)為三陰性乳腺癌的治療提供新的思路。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.018

R725.2

B

1002-266X(2017)46-0061-03

山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(ZR2014HP036)。

2017-07-22)