付德池，楊朝令，汪宏良，李仲娟

(1大冶市第四人民醫(yī)院，湖北黃石435115；2湖北理工學院醫(yī)學院)

曲匹地爾與阿司匹林對糖尿病小鼠血小板活性影響的比較

付德池1，楊朝令2，汪宏良2，李仲娟2

(1大冶市第四人民醫(yī)院，湖北黃石435115；2湖北理工學院醫(yī)學院)

目的探討曲匹地爾對糖尿病小鼠血液中血小板活性的影響及其與阿司匹林相比的效果。方法選擇100只健康小鼠，10只為非模型對照組，90只通過腹腔注射四氧嘧啶建立糖尿病模型。取造模成功的60只小鼠，隨機分為生理鹽水組、阿司匹林組和曲匹地爾組各20只，分別給予生理鹽水10 mL、曲匹地爾和阿司匹林25 mg/kg 10 mL灌胃，1次/d，連續(xù)3 d。3 d后，生理鹽水組、阿司匹林組和曲匹地爾組于灌胃后90、120和150 min時尾靜脈血取血，同法取非模型對照組尾靜脈血。制備富血小板血漿(PRP)及乏血小板血漿(PPP)，用比濁法進行血小板聚集性測定，記錄血小板聚集率，計算血小板抑制率。結果生理鹽水組血小板聚集率高于非模型對照組，曲匹地爾組、阿司匹林組血小板聚集率均低于生理鹽水組(P均<0.01)。曲匹地爾組、阿司匹林組血小板抑制率均高于生理鹽水組，曲匹地爾組血小板抑制率高于阿司匹林組(P均<0.01)。90、120、150 min時曲匹地爾組血小板抑制率均高于阿司匹林組(P均<0.01)。結論曲匹地爾與阿司匹林均能抑制糖尿病小鼠的血小板聚集，曲匹地爾抗血小板聚集效果強于阿司匹林，對血小板活化抑制時間更持久。

曲匹地爾；阿司匹林；血小板聚集；血小板抑制率；糖尿??；心血管疾病

我國糖尿病患者數量居于全球首位，20歲以上的人群糖尿病患病率為9.7%[1]。隨著病情的進展，血栓和心腦血管并發(fā)癥成為影響糖尿病患者生活質量和威脅生命的主要原因。因此，抗血小板治療成為預防糖尿病患者心腦血管并發(fā)癥和缺血性事件發(fā)生的重要策略[2]。在常用抗血小板聚集藥物中，阿司匹林是這類疾病的一級預防藥物，但對于糖尿病、動脈硬化、冠心病和腦梗死等高?；颊叨?，由于其存在較高的血小板聚集率，阿司匹林的應用效果并不理想[3,4]。阿司匹林的抗血小板聚集原理為不可逆地滅活乙酰化環(huán)氧化酶-1(COX-1)中529位絲氨酸的羥基酶活性，從而阻止血栓素A2(TXA2)的形成[5,6]。而三嘧啶衍生物的曲匹地爾則具有不同的抗血小板原理，其是通過抗血小板衍生生長因子受體而發(fā)揮作用[7]。近年研究也表明，曲匹地爾可顯著改善糖尿病患者的視網膜病變，并能促進血管內皮細胞的增生[8,9]。2016年3～10月，我們以阿司匹林作為對照，觀察曲匹地爾對糖尿病模型小鼠血小板活性的影響，為糖尿病患者并發(fā)心血管疾病的藥物選擇提供依據。

1 試藥與儀器

1.1 動物、試劑及儀器 選擇健康昆種小鼠100只，體質量25～35 g，飼養(yǎng)于通風良好，溫度在18～22 ℃環(huán)境。曲匹地爾由迪奧藥業(yè)提供。四氧嘧啶和二磷酸腺苷和二磷酸腺苷購自美國Sigma公司；阿司匹林購自武漢宏信康精細化工有限公司。PACKS-4的多通道血小板凝集度儀購自美國海倫娜公司。

1.2 模型構建、動物分組與干預方法 適應性飼養(yǎng)小鼠1周后，取90只腹腔注射四氧嘧啶注射液70 mg/kg進行糖尿病建模[10]，48 h后取尾靜脈血檢測血糖，以>8 mmol/L為造模成功。剩余的10只大鼠腹腔注射等量生理鹽水作為非模型對照組。將造模成功小鼠隨機分為生理鹽水組、阿司匹林組和曲匹地爾組各20只，曲匹地爾組及阿司匹林組均按25 mg/kg曲匹地爾或阿司匹林灌胃，1次/d，連續(xù)3 d，生理鹽水組僅使用生理鹽水10 mL同法進行灌胃。第3天灌胃后分別取不同時間點血液備用。

1.3 取材方法 生理鹽水組、阿司匹林組和曲匹地爾組干預90、120和150 min時，分別于尾部取血1.5 mL，并取非模型對照組尾靜脈血，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝，收集于潔凈的塑料離心管保存。

1.4 血小板血漿的制備

1.4.1 富血小板血漿(PRP)制備方法 取各組不同時間點血液，100 r/min離心15 min。使用移液槍吸取離心后血液樣本上層的PRP放于一次性塑料試管內，標記為PRP。加蓋并在室溫下保存，穩(wěn)定30 min后待測。

1.4.2 乏血小板血漿(PPP)制備方法 取各組不同時間點血液，1 600～2 000 r/min離心15 min，使用移液槍吸取離心后血液樣本上層血漿并標記為PPP，用PPP稀釋PRP使血小板密度為1×1011/L。在25 ℃下保存，所有檢測標本在采集后3 h內完成。

1.5 血小板凝聚率及抑制率測定 取各組各時間點PPP及PRP，按照PACKS-4多通道血小板凝集度儀說明書操作。準備PPP和PRP及誘導劑，吸取微量或標準量PPP到檢測杯里，加入微量或標準量PRP樣本。37 ℃孵育PRP 3 min，用PPP空白設置100%聚集。將已預溫好的PRP檢測杯插入與PPP對應的通道，用加樣器將試劑加入檢測杯，按下通道鍵用PRP設置聚集水平為0。將裝有250 μL乏血小板血清的石英杯放入通道檢測，取裝有225 μL富血小板血清石英杯，將磁珠橫向放入石英杯中。將石英杯放入檢測通道中，抽取25 μL二磷酸腺苷(ADP)，將試劑垂直打入石英杯檢測。根據儀器打印出的聚集曲線及最大聚集率，分析藥物對ADP誘導1 min后血小板聚集的影響。用比濁法進行血小板聚集性測定，記錄血小板聚集率。以[(對照管聚集率-樣品管聚集率) / 對照管聚集率]計算血小板抑制率[11]。由于90 min時間點是誘導劑ADP作用后的峰值點，比較該時點各組的血小板聚集率及血小板抑制率。

2 結果

2.1 各組干預90 min時血小板聚集率比較 非模型對照組及模型小鼠生理鹽水組、曲匹地爾組、阿司匹林組90 min時血小板聚集率分別為15%±0.36%、55%±0.22%、18%±0.48%、40%±0.56%，模型小鼠生理鹽水組、曲匹地爾組、阿司匹林組血小板聚集率均高于非模型對照組(P均<0.01)。模型小鼠曲匹地爾組、阿司匹林組血小板聚集率均低于生理鹽水組(P均<0.01)。曲匹地爾組血小板抑制率低于阿司匹林組(P<0.01)。

2.2 各組干預90 min時血小板抑制率比較 生理鹽水組、曲匹地爾組、阿司匹林組血小板抑制率分別為0、67.2%±0.36%、27%±1.32%，曲匹地爾組、阿司匹林組血小板抑制率均高于生理鹽水組，曲匹地爾組血小板抑制率高于阿司匹林組(P均<0.01)。

2.3 曲匹地爾組和阿司匹林組不同時間點血小板抑制率比較 曲匹地爾組和阿司匹林組干預90 min時血小板抑制率均高于其他兩時間點(P均<0.01)。各時間點曲匹地爾組血小板抑制率均高于阿司匹林組(P均<0.01)。

表1 各組不同時間點血小板抑制率比較

注：與阿司匹林組比較，*P<0.05；與同組90 min時比較，﹟P<0.01。

3 討論

糖尿病不僅促進動脈硬化，同時也增加了心血管疾病的發(fā)病概率[12]。糖尿病患者并發(fā)血栓和心腦血管癥時，由于患者血小板膜流動性下降，Ca2+、Mg2+代謝發(fā)生變化，花生四烯酸和TXA2增加，前列環(huán)素和抗氧化物質減少，導致血小板聚集異常及血液流變學改變[13],血栓形成的風險變大。同時，TXA2的升高，還會引起冠狀動脈痙攣，使心肌微循環(huán)發(fā)生障礙。誘發(fā)更為嚴重的血管事件。阿司匹林可有效預防糖尿病患者的心腦血管事件，但一級預防研究 (PPP)顯示，阿司匹林并不能減少心血管病因死亡、心肌梗死和腦卒中等嚴重的血管事件的發(fā)生率，可能與糖尿病患者體內存在阿司匹林抵抗相關[14]。曲匹地爾學名為7-二乙基-5-甲基s-三氮唑(1,5-a)嘧啶，早期用于抗心絞痛，上世紀九十年代被日本藥典(12版)收載，并用于糖尿病并發(fā)血栓和心腦血管癥時的臨床治療。曲匹地爾具有擴張冠狀動脈、改善糖尿病脂質代謝和降低血小板聚集等作用[15]。其抗血小板聚集通過抑制血栓素合成，促進前列環(huán)素生成、激活腺苷酸環(huán)化酶，促進環(huán)磷酸腺苷(cAMP)生成增多，抑制磷酸二酯酶活性，減少cAMP水解。血小板內cAMP 增多能激活細胞膜的轉運而穩(wěn)定鈣的貯藏池，使細胞質內游離Ca2+含量降低，從而阻斷血小板的激活。雖然曲匹地爾與阿司匹林在體內抗血小板活化機理部分存在相同[16]，但曲匹地爾對體內存在阿司匹林抵抗的糖尿病患者有著不可替代的優(yōu)勢。曲匹地爾與阿司匹林對糖尿病患者的抗血小板活化作用差異尚不明確。

血小板功能異常及血液流變學的改變在患者血栓形成過程中具有重要作用。血小板聚集率和血小板的抑制率都是血小板活化的一個體外評價指標。血小板在二磷酸腺苷的誘導下出現活化，比濁法測定血小板聚集率，通過儀器設定空白對照可以計算出血小板的抑制率。藥物干預后血小板聚集率的改變，是藥物對血小板活化能力的體現。血小板聚集率升高時，血小板黏附和聚集能力增加，釋放反應及促凝活性增強，導致血液流變學改變[17]，增加糖尿病患者發(fā)生嚴重的血管事件。在糖尿病模型小鼠中，90 min時間點是誘導劑ADP作用后的峰值點，也是考察藥物干預效果的最佳點。本研究結果顯示，生理鹽水組血小板聚集率高于非模型對照組，提示模型小鼠體內血小板活性高于非模型對照組血小板活性;曲匹地爾組、阿司匹林組血小板聚集率均低于生理鹽水組，提示藥物干預后，血小板活性受到抑制。

血小板的抑制率是抗凝藥物效果的直接評價。本研究發(fā)現，曲匹地爾組、阿司匹林組血小板抑制率均高于生理鹽水組，提示抗凝藥物可阻斷血小板的激活；曲匹地爾組血小板抑制率高于阿司匹林組，提示曲匹地爾阻斷血小板激活的效果強于阿司匹林；曲匹地爾組和阿司匹林組干預90 min時血小板抑制率均高于其他兩時間點，提示兩組抗凝藥物90 min時藥效高于其他兩時間點；各時間點曲匹地爾組血小板抑制率均高于阿司匹林組，提示不同時間點曲匹地爾阻斷血小板激活的效果均強于阿司匹林組。

本研究發(fā)現，曲匹地爾組、阿司匹林組血小板聚集率均低于生理鹽水組，曲匹地爾組血小板聚集率低于阿司匹林組，提示曲匹地爾在糖尿病模型小鼠中抗血小板聚集優(yōu)于阿司匹林；90、120及150 min時曲匹地爾組血小板抑制率均高于阿司匹林組，阿司匹林對血小板的抑制效果大幅下降,提示曲匹地爾對糖尿病小鼠的血小板抑制效果比阿司匹林更為持久。

綜上所述，曲匹地爾抗血小板聚集效果強于阿司匹林，對血小板活化抑制時間更持久，更適合糖尿病合并心血管疾病的治療。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.010

R285

A

1002-266X(2017)46-0038-03

湖北省腎臟疾病發(fā)生與干預重點實驗室基金項目(222/222205)；教育部留學生啟動資金(46-1)；湖北省重點學科湖北理工學院藥學學科資助。

李仲娟(E-mail: 1525677891@qq.com)

2017-04-28)