曾奇虎，楊萍，翁靜飛，王家偉，劉星，范忠才

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

外源性硫化氫對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響及機(jī)制

曾奇虎，楊萍，翁靜飛，王家偉，劉星，范忠才

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州646000)

目的探討外源性硫化氫(H2S)對糖尿病腎病大鼠腎纖維化的影響及其機(jī)制。方法將27只健康雄性SD大鼠腹腔注射鏈尿佐菌素(STZ)建立2型糖尿病模型，8周后建立糖尿病腎病模型。選取糖尿病腎病模型大鼠20只，另選取正常大鼠20只，分為正常對照組(Control+saline組)、H2S對照組(Control+NaHS組)、模型組(DN+saline組)、H2S治療組(DN+NaHS組)，每組10只。予以DN+saline組和Control+NaHS組大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol/(kg·d)，予以Control+saline組和DN+saline組腹腔注射等量生理鹽水。持續(xù)8周后，收集24 h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測24 h尿蛋白定量(24 h Upro)；心臟采血、留取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平；取腎臟組織，采用HE染色法觀察腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)，Western blotting法檢測腎臟組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Smad7蛋白表達(dá)，免疫組化法檢測腎臟纖維化相關(guān)蛋白纖維連接蛋白(FN)、層粘連蛋白(LN)、ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-SMA)表達(dá)。結(jié)果與Control+saline組相比，DN+saline組大鼠BUN、SCr和24 h Upro升高(P均<0.05)，腎臟病理損傷明顯加重，腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA、TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)(P均<0.05)，Smad7蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.05)；與DN+saline組相比，DN+NaHS組大鼠BUN、SCr、24 h Upro降低(P均<0.05)，腎臟病理損傷明顯減輕，腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA、和TGF-β1蛋白表達(dá)下調(diào)(P均<0.05)，Smad7蛋白上調(diào)(P均<0.05)。結(jié)論外源性H2S可明顯改善糖尿病腎病大鼠的腎纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad7信號通路有關(guān)。

糖尿病腎??；硫化氫；轉(zhuǎn)化生長因子β1；Smad7蛋白；腎間質(zhì)纖維化

糖尿病腎病是糖尿病最重要的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致終末期腎病最重要的原因之一。目前認(rèn)為，纖維化和炎癥在糖尿病腎病發(fā)展中起關(guān)鍵性作用，是導(dǎo)致糖尿病腎病最重要病理機(jī)制和途徑。內(nèi)源性硫化氫(H2S)是由半胱氨酸在多種酶催化作用下產(chǎn)生的氣體信號分子，具有松弛血管、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞張力、保護(hù)腎臟及心臟等重要器官的作用[1]，而且外源性H2S亦對心血管疾病具有保護(hù)作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，H2S可能通過絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)等信號通路，減輕糖尿病腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激、炎癥、系膜細(xì)胞增殖，從而改善糖尿病腎病大鼠的腎臟功能[3,4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是一種多功能細(xì)胞因子，參與調(diào)控多種細(xì)胞的免疫、生長、分化、凋亡、自噬、腫瘤抑制等生物進(jìn)程。研究證實，調(diào)控TGF-β1下游信號分子Smads蛋白可影響ɑ-SMA介導(dǎo)的腎間質(zhì)性纖維化過程，從而參與調(diào)控糖尿病腎病進(jìn)程[5]。但目前，對于外源性H2S在糖尿病腎病治療中的作用及機(jī)制尚不明確。2016年10月～2017年4月，我們通過建立2型糖尿病腎病大鼠模型，探討外源性H2S治療糖尿病腎病的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 SPF級成年健康雄性SD大鼠47只，10～16周齡，體質(zhì)量200～220 g，由西南醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食和飲水。鏈尿佐菌素(STZ)、NaHS(作為外源性H2S供體)購自美國Sigma公司；TGF-β1兔抗大鼠多克隆抗體、Smad7兔抗大鼠多克隆抗體、纖維連接蛋白(FN)兔抗大鼠單克隆抗體、層粘連蛋白(LN)兔抗大鼠單克隆抗體、ɑ-平滑肌肌動蛋白(ɑ-SMA)兔抗大鼠單克隆抗體均購自Abcam公司；BCA蛋白測定試劑盒、RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)等Western blotting試劑盒及免疫組化SP試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.2 糖尿病模型建立、分組及處理 動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，取27只大鼠予以高糖高脂(10%豬油、20%蔗糖、6%蛋白粉、3%蛋黃粉、61%常規(guī)飼料)喂養(yǎng)4周，禁食12 h后，腹腔單次注射STZ 40 mg/kg，注射后3 d采尾靜脈血測血糖，以血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠造模成功。糖尿病模型成功后繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)8周，建立糖尿病腎病模型。選取糖尿病腎病模型大鼠20只、正常大鼠20只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組(Control+saline組)、H2S對照組(Control+NaHS組)、模型組(DN+saline組)、H2S治療組(DN+NaHS組)各10只。予以DN+NaHS組和Control+NaHS組大鼠腹腔注射NaHS溶液100 μmol/(kg·d)，Control+saline組和DN+saline組腹腔注射等量生理鹽水，持續(xù)8周。

1.3 24 h尿蛋白定量(24 h Upro)測定 末次給藥后收集24 h尿液，分裝保存，采用考馬斯亮藍(lán)G-250法檢測24 h Upro。

1.4 血清腎功能指標(biāo)測定 收集尿液后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，心臟采血、離心、留取血清，采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平。

1.5 腎臟組織病理觀察 取血后收集腎臟標(biāo)本，4%多聚甲醛固定，制作3 μm石蠟切片，采用HE染色法在光鏡(×200倍)下觀察腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)。

1.6 腎臟組織TGF-β1、Smad7蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取-80 ℃保存的腎臟組織，每100 mg加入預(yù)冷組織裂解液1 mL，超聲破碎儀中(冰浴)勻漿后離心取上清液，使用BCA法檢測蛋白濃度。充分混合的上清加5×蛋白上樣緩沖液后于100 ℃煮沸變性10 min，保存于-20 ℃冰箱。將變性好的組織樣品冰上溶解后以20 μL總蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳后使用半干法轉(zhuǎn)膜至PDVF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗去封閉液，洗膜3次，分別加稀釋一抗兔抗大鼠TGF-β1(1∶1 000)、Smad7(1∶1 000)4 ℃孵育過夜， HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶3 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL顯色、曝光。應(yīng)用Quantity One軟件分析目的條帶光密度值(OD)，使用GAPDH條帶進(jìn)行OD校正。

1.7 腎臟組織纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法檢測腎臟纖維化相關(guān)蛋白FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達(dá)。腎臟組織石蠟切片脫水、包埋、切片(3 μm)，按照SP法試劑盒操作說明書檢測腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達(dá)。FN、LN、ɑ-SMA蛋白在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中呈棕黃色顆粒為陽性，應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件計算各組平均吸光度值(AOD)。

2 結(jié)果

2.1 各組腎功能指標(biāo)及24 h Upro比較 與Control+saline組比較，DN+saline組和DN+NaHS組BUN、SCr、24 h Upro均增高(P均<0.05)。與DN+saline組比較，DN+NaHS組BUN、SCr、24 h Upro均降低(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組腎臟組織病理學(xué)變化 Control+saline組和Control+NaHS組大鼠腎小管排列整齊， 腎間質(zhì)無異常改變，無纖維組織增生，腎小管管腔內(nèi)無結(jié)晶物沉積。與Control+saline組比較，DN+saline組可見大量腎小管上皮細(xì)胞脫落或空泡樣變性，腎小管明顯擴(kuò)張，且存在萎縮的腎小管，腎小球明顯萎縮，腎小管內(nèi)有蛋白管型，腎間質(zhì)纖維化增生及大量炎性細(xì)胞浸潤；與DN+saline組比較，DN+NaHS組腎小球萎縮程度、腎小管擴(kuò)張、腎間質(zhì)纖維化程度均減輕。

表1 各組腎功能指標(biāo)及24 h Upro比較

注：與Control+saline組比較，*P<0.05；與DN+saline組比較，﹟P<0.05。

2.3 各組腎臟組織TGF-β1、Smad7蛋白表達(dá)比較 與Control+saline組比較，DN+saline組腎臟組織TGF-β1表達(dá)增加、Smad7表達(dá)降低(P均<0.05)；與DN+saline組比較，DN+NaHS組腎臟組織TGF-β1表達(dá)降低、Smad7表達(dá)增加(P均<0.05)，見表2、圖1。

2.4 各組腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達(dá)比較 DN+saline組腎臟組織FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達(dá)較Control+saline組增加(P均<0.05)， DN+NaHS組FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達(dá)均低于DN+saline組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組腎臟組織TGF-β1、Smad7、FN、LN、ɑ-SMA蛋白表達(dá)比較

注：與Control+saline組比較，*P<0.05；與DN+saline組比較，﹟P<0.05。

圖1 各組腎臟組織TGF-β1及Smad7蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病主要并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因。糖尿病腎病的病理變化主要表現(xiàn)為腎小球系膜增生、基底膜增厚、腎間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮等，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)成分的異常沉積，從而導(dǎo)致腎衰竭。腎纖維化是多種疾病導(dǎo)致腎衰竭的常見病理特征，是各種原因所致的腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同通路。由于糖尿病腎病多存在復(fù)雜的代謝紊亂，往往比其他原因所致的腎臟疾病進(jìn)展更快，一旦進(jìn)展到終末期腎衰竭，需行腎臟替代治療，治療費用高，病死率高，因此延緩糖尿病腎病意義重大。

H2S 是新發(fā)現(xiàn)的第三類氣體信號分子，是高效的細(xì)胞色素 C 氧化酶抑制劑，對機(jī)體新陳代謝具有意義深遠(yuǎn)的影響，對腎臟具有保護(hù)作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可通過改善胰島素抵抗，降低血糖，改善血脂水平，從而減輕腎臟損傷[6]。H2S也可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和多元醇通路保護(hù)腎臟[7]，說明外源性H2S可能通過多個靶點或信號通路延緩糖尿病腎病進(jìn)展，機(jī)制復(fù)雜，具體機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，與Control+saline組比較，DN+saline組BUN、SCr、24 h Upro均增高，腎臟組織可見大量腎小管上皮細(xì)胞脫落或空泡樣變性，腎小管明顯擴(kuò)張，且存在萎縮的腎小管，腎小球明顯萎縮，提示糖尿病腎病大鼠出現(xiàn)腎臟腎間質(zhì)纖維化且腎功能、尿蛋白明顯惡化；與DN+saline組相比較，DN+NaHS組BUN、SCr、24 h Upro均降低，腎小球萎縮程度、腎小管擴(kuò)張、腎間質(zhì)纖維化程度均減輕，提示外源性H2S能提高糖尿病腎病大鼠的腎臟功能、改善腎臟組織病理改變。

TGF-β1是參與糖尿病腎病進(jìn)展關(guān)鍵的纖維細(xì)胞因子，TGF-β1信號通路可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)基因調(diào)控和聚集，加速腎小球硬化、腎小管及間質(zhì)纖維化，在腎纖維化的發(fā)展中起著中樞調(diào)節(jié)作用[8]。因此，TGF-β1信號通路的誘導(dǎo)和激活對纖維細(xì)胞反應(yīng)的觸發(fā)至關(guān)重要。研究表明，抑制TGF-β1表達(dá)可以減少細(xì)胞外基質(zhì)在糖尿病腎病腎臟聚集，可以通過介導(dǎo)腎小球及腎小管機(jī)制降低尿蛋白[9,10]。Smad7是TGF-β1/Smads信號通路關(guān)鍵分子，通過與TGF-β1受體結(jié)合阻止招募Smad3、Smad2及其磷酸化，改善糖尿病腎病大鼠的腎臟纖維化[11,12]。本研究發(fā)現(xiàn)，DN+NaHS組腎臟組織TGF-β1蛋白表達(dá)較DN+saline組下調(diào)，而Smad7明顯上調(diào)，提示H2S可通過下調(diào)TGF-β1和上調(diào)Smad7，減少細(xì)胞外基質(zhì)聚集而改善腎間質(zhì)纖維化，從而延緩糖尿病腎病進(jìn)展。

FN在腎小球中主要由系膜細(xì)胞產(chǎn)生，具有結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)各類成分并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)其他成分沉積的作用。FN異常增高提示細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚，是糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化的主要表現(xiàn)之一。LN作為基底膜的主要組分，可與Ⅳ型膠原相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞的附著、遷移和在組織中的有序化，對基膜的組裝起關(guān)鍵性作用。α-SMA是血管平滑肌特有的細(xì)胞骨架蛋白，是成肌纖維細(xì)胞特征性標(biāo)志物，參與腎間質(zhì)纖維化，影響糖尿病腎病發(fā)生與進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1/Smads信號通路可以通過上調(diào)α-SMA表達(dá)，加重腎間質(zhì)纖維化，從而導(dǎo)致腎功能下降[13～15]。本研究發(fā)現(xiàn)，DN+saline組大鼠腎臟LN、FN、α-SMA蛋白表達(dá)較Control+saline組明顯升高，表明糖尿病腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化程度明顯增加；與DN+saline組相比較，DN+NaHS組大鼠腎臟中LN、FN、α-SMA蛋白表達(dá)明顯減少，由此推測，H2S可能通過調(diào)控FN、LN、α-SMA，減輕細(xì)胞外基質(zhì)的過度積聚，抑制系膜細(xì)胞的異常增生，減輕腎小球基底膜增厚和系膜的擴(kuò)張，改善糖尿病腎病大鼠腎纖維化病變，可能與其調(diào)控TGF-β1/Smads信號通路有關(guān)。

綜上所述，外源性H2S可能通過調(diào)控TGF-β1/Smad7信號通路改善糖尿病腎病大鼠腎纖維化，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)腎臟效應(yīng)，為2型糖尿病腎病治療提供了新的途徑和靶點。本研究僅初步探討了外源性H2S對2型糖尿病腎病的作用及機(jī)制，今后尚需對TGF-β1/Smad7信號通路下游信號分子及其他通路參與介導(dǎo)外源性H2S對腎臟保護(hù)作用的機(jī)制進(jìn)行深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.009

R587.2

A

1002-266X(2017)46-0034-04

四川省科學(xué)技術(shù)廳-瀘州市人民政府-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合科研專項資金資助項目(0903-100020802) 。

范忠才(E-mail: zhongcai9665@126.com)

2017-06-12)