劉皓，曲一丹，劉興基，李衛(wèi)紅，桑慧，司艷紅，商戰(zhàn)平

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000)

·基礎(chǔ)研究·

白藜蘆醇后處理對(duì)大鼠腎臟缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制

劉皓，曲一丹，劉興基，李衛(wèi)紅，桑慧，司艷紅，商戰(zhàn)平

(泰山醫(yī)學(xué)院，山東泰安271000)

目的探討白藜蘆醇后處理對(duì)腎臟缺血再灌注(I/R)損傷的影響及其機(jī)制。方法將60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組，每組各15只。模型對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組制備急性腎臟I/R模型，假手術(shù)組僅行假手術(shù)，對(duì)雙側(cè)腎臟不進(jìn)行處理。白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組造模成功后，待腎臟血流恢復(fù)后用16號(hào)灌胃針進(jìn)行灌胃給藥。假手術(shù)組及模型對(duì)照組術(shù)后立即灌胃0.9%NaCl溶液2 mL。給藥處理24 h后，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)血清尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平。取左側(cè)腎臟，配成腎組織勻漿，檢測(cè)丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性。采用HE染色法觀察病理學(xué)變化，Paller法進(jìn)行腎小管壞死程度評(píng)分。結(jié)果白藜蘆醇低、高劑量組血清BUN、Cr水平均低于模型對(duì)照組(P均<0.05)，白藜蘆醇高劑量組血清BUN、Cr水平均低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組腎組織MDA含量低于模型對(duì)照組，SOD活性高于模型對(duì)照組(P均<0.05)；白藜蘆醇高劑量組腎組織MDA含量低于白藜蘆醇低劑量組，SOD活性高于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組腎臟組織病理學(xué)改變較模型對(duì)照組明顯緩解，白藜蘆醇高劑量組緩解更明顯。白藜蘆醇低、高劑量組腎小管壞死程度評(píng)分低于模型對(duì)照組，白藜蘆醇高劑量組低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。結(jié)論白藜蘆醇后處理可明顯改善腎臟I/R損傷大鼠的腎功能指標(biāo)、減輕腎臟組織損傷，其機(jī)制可能與抑制腎臟組織氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

白藜蘆醇；腎臟；缺血再灌注損傷；藥物后處理；氧化應(yīng)激

腎臟缺血再灌注(I/R)損傷在臨床中多見，其大多發(fā)生于休克、血管手術(shù)或腎臟移植術(shù)過程中[1]。腎臟I/R損傷是導(dǎo)致急性腎衰竭(ARF)的常見原因，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[2]。近些年，用藥物后處理的方法來改善腎臟I/R損傷的方式引起了更多的關(guān)注。白藜蘆醇是一種天然多酚類化學(xué)物質(zhì)，具有抑制炎癥反應(yīng)、抗腫瘤作用和抗氧化作用等多種功能，并可顯著減輕多種器官的I/R損傷[3]。但既往大多采用白藜蘆醇預(yù)處理的方式研究其對(duì)腎臟I/R的保護(hù)作用，對(duì)其在腎臟I/R損傷后處理中的作用尚不明確。2016年5～12月，我們觀察了白藜蘆醇后處理對(duì)腎臟I/R模型大鼠的影響，探討白藜蘆醇后處理對(duì)腎臟I/R損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與試劑 健康雄性Wistar大鼠60只，CL級(jí)，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。白藜蘆醇購自美國(guó)Sigma公司；考馬斯亮藍(lán)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、血尿素氮(BUN)及血肌酐(Cr)含量測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；戊巴比妥鈉購自南京都萊生物有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 采用簡(jiǎn)單隨機(jī)化法將60只大鼠按照1∶1∶1∶1分配到假手術(shù)組、模型對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組，每組各15只。模型對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組制備急性腎臟I/R模型，腹腔注射2%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，腹正中線行小切口，將兩側(cè)腎蒂游離并剝離周圍組織，結(jié)扎右腎腎蒂，使用動(dòng)脈夾將左腎腎蒂夾閉48 min后松開移去，恢復(fù)血流再灌注，然后逐層縫合。移除動(dòng)脈夾后，當(dāng)觀察到腎表面顏色從暗紫色變化為血色時(shí)，表明血流恢復(fù)，急性腎臟I/R模型制備成功。假手術(shù)組只進(jìn)行腹部小切口操作后，用0.9%NaCl溶液濕潤(rùn)的消毒紗布進(jìn)行覆蓋，對(duì)雙側(cè)腎臟不進(jìn)行任何處理。

1.3 干預(yù)方法 白藜蘆醇低劑量組及白藜蘆醇高劑量組造模后立即進(jìn)行后處理，進(jìn)行灌胃給藥，待腎臟血流恢復(fù)后用16號(hào)灌胃針進(jìn)行灌胃給藥。假手術(shù)組及模型對(duì)照組術(shù)后立即灌胃0.9%NaCl溶液2 mL。

1.4 血清BUN、Cr水平測(cè)定 給藥后處理24 h后，麻醉大鼠，開腹經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，離心留取血清，依照試劑盒的操作說明，檢測(cè)血清BUN、Cr水平。

1.5 腎組織MDA含量及SOD活性測(cè)定 取血后處死各組大鼠，取左側(cè)腎臟，取部分腎皮質(zhì)，配成10%的腎臟組織勻漿，依照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作方式檢測(cè)MDA含量及SOD活性。

1.6 腎組織病理組織觀察及腎小管壞死程度評(píng)分取腎臟組織，制備石蠟切片，采用HE染色法觀察組織學(xué)形態(tài)與病理學(xué)變化。按Paller法[4]進(jìn)行腎小管壞死程度評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管擴(kuò)張、細(xì)胞扁平為1分；腎小管腔內(nèi)有脫落、 壞死的細(xì)胞，無管型或細(xì)胞碎片為2分；上皮細(xì)胞顆粒變性為1分；空泡變性為1分；細(xì)胞核固縮為1分。

2 結(jié)果

2.1 各組血清BUN、Cr水平比較 模型對(duì)照組血清 BUN、Cr水平均高于假手術(shù)組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組血清BUN、Cr水平均低于模型對(duì)照組(P均<0.05)。白藜蘆醇高劑量組血清BUN、Cr水平均低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組血清BUN、Cr水平比較

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05； 與白藜蘆醇低劑量組比較，#P<0.05。

2.2 各組腎組織MDA含量及SOD活性比較 模型對(duì)照組腎組織MDA含量高于假手術(shù)組，SOD活性低于假手術(shù)組(P均<0.05)。白藜蘆醇低、高劑量組腎組織MDA含量低于模型對(duì)照組，SOD活性高于模型對(duì)照組(P均<0.05)。白藜蘆醇高劑量組腎組織MDA含量低于白藜蘆醇低劑量組，SOD活性高于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組腎臟組織病理學(xué)表現(xiàn)及腎小管壞死程度評(píng)分比較 假手術(shù)組腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，小管管腔完好，未見間質(zhì)水腫與組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，上皮細(xì)胞無水腫、壞死。模型對(duì)照組腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯異常，小管管腔顯著擴(kuò)張，上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的腫脹、壞死，并且出現(xiàn)管型、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫現(xiàn)象。白藜蘆醇低、高劑量組腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)均有輕微變化，小管上皮細(xì)胞以腫脹為主，壞死罕見，炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫的現(xiàn)象與模型組相比顯著緩解，管腔中見到脫落細(xì)胞以及管型的現(xiàn)象明顯少于模型對(duì)照組，病理學(xué)改變較模型對(duì)照組明顯緩解。白藜蘆醇高劑量組病理改變較白藜蘆醇低劑量組明顯改善。假手術(shù)組、模型對(duì)照組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇高劑量組腎小管壞死程度評(píng)分分別為(1.15±0.32)、(35.87±1.50)、(4.50±1.41)、(8.76±1.60)分，模型對(duì)照組高于假手術(shù)組，白藜蘆醇低、高劑量組均低于模型對(duì)照組，白藜蘆醇高劑量組低于白藜蘆醇低劑量組(P均<0.05)。

表2 各組腎組織MDA含量及SOD活性比較

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05； 與白藜蘆醇低劑量組比較，#P<0.05。

3 討論

目前，對(duì)腎臟I/R損傷進(jìn)行藥物預(yù)處理的預(yù)防與治療的研究已取得較好的進(jìn)展[5]，顯示出明顯的治療效果。但在實(shí)際的臨床診療中，更多見的是由于腎臟發(fā)生缺血后造成損傷來就醫(yī)的，目前并無法在缺血發(fā)生之前預(yù)知其發(fā)生，進(jìn)而采用藥物預(yù)處理進(jìn)行干預(yù)，這一局限性限制了藥物預(yù)處理方法在臨床I/R損傷治療中的應(yīng)用。藥物后處理指的是在組織器官缺少血液灌流較長(zhǎng)時(shí)間的情況下，在血流恢復(fù)之前或者開始恢復(fù)數(shù)分鐘以內(nèi)用藥[6]。對(duì)I/R損傷進(jìn)行藥物后處理的方式具有事后性的特點(diǎn)，是近年來提出的新的器官保護(hù)策略，并且具有廣闊的研究前景。因此，探討對(duì)腎臟I/R損傷進(jìn)行藥物后處理治療更加重要。

白藜蘆醇是一種存在于漿果、花生皮、葡萄等中的天然多酚類化學(xué)物質(zhì)，具有許多有益的健康效應(yīng)，如抗炎、抗衰老、抗腫瘤等。近年研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有較強(qiáng)的抵抗氧化損傷的功能，可作為一種活性氧(ROS)清除劑[6]。白藜蘆醇還能夠通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)來調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，增加抗氧化作用，是一種有效的抗氧化劑[16]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可顯著減輕多種器官及組織如骨骼肌、神經(jīng)、心臟、肝臟、胃、腸道及腎臟的I/R損傷[7～13]。白藜蘆醇擁有對(duì)臟器I/R損傷較好的保護(hù)作用與良好的應(yīng)用價(jià)值，是近年來的研究熱點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組血清 BUN、Cr水平高于假手術(shù)組，提示腎臟I/R損傷導(dǎo)致了大鼠腎功能損害,血清BUN、Cr水平顯著增加，并出現(xiàn)腎臟的病理性損害；白藜蘆醇低、高劑量組血清BUN、Cr水平均低于模型對(duì)照組，白藜蘆醇高劑量組血清BUN、Cr水平均低于白藜蘆醇低劑量組，提示使用白藜蘆醇后處理給藥后減輕了上述改變，能夠明顯減輕腎臟I/R損傷，起到保護(hù)腎功能與降低腎臟病理性損害的作用，并且高劑量應(yīng)用時(shí)的保護(hù)作用更明顯。

研究顯示，腎臟I/R損傷出現(xiàn)時(shí)高度破壞腎組織，并啟動(dòng)了一系列促使細(xì)胞凋亡和壞死的程序。這些有害的效應(yīng)被證實(shí)是由于腎再灌注時(shí)由ROS產(chǎn)生的[14]。特別是在再灌注期間，I/R后發(fā)生的組織損傷與部分組織中增加的氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[15]。在腎臟I/R損傷的進(jìn)程發(fā)生時(shí)，ROS在機(jī)體內(nèi)開始形成并積聚，從而使得氧自由基持續(xù)產(chǎn)生。同時(shí)，腎臟細(xì)胞線粒體缺氧使抗氧化物酶的活性減弱，清除氧自由基的作用降低，機(jī)體自由基防御系統(tǒng)受到了破壞，導(dǎo)致了氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞死亡。SOD是人體中主要存在的自由基清除劑，對(duì)保護(hù)腎臟組織抵抗自由基所造成的損害有重要意義，其活性水平可以用于評(píng)價(jià)機(jī)體自由基的清除作用。多不飽和脂肪酸存在于生物膜當(dāng)中，體內(nèi)ROS能夠與它產(chǎn)生化學(xué)變化，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化(LPO)現(xiàn)象出現(xiàn)，以致于生成能夠?qū)M織細(xì)胞產(chǎn)生損傷的毒害性產(chǎn)物，如MDA。MDA能夠有效衡量體內(nèi)自由基對(duì)細(xì)胞損傷程度，有助于判斷LPO的發(fā)生對(duì)組織細(xì)胞所造成的損傷水平。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組腎組織MDA含量高于假手術(shù)組，SOD活性低于假手術(shù)組，提示大鼠急性腎臟I/R的發(fā)生導(dǎo)致了機(jī)體氧化應(yīng)激的損傷；白藜蘆醇低、高劑量組腎組織MDA含量低于模型對(duì)照組，SOD活性高于模型對(duì)照組，提示白藜蘆醇后處理能夠顯著減少腎臟I/R損傷中腎組織MDA含量、提升SOD活力，表明應(yīng)用白藜蘆醇對(duì)急性腎臟I/R損傷進(jìn)行后處理能夠有效降低體內(nèi)氧自由基含量，并加強(qiáng)腎組織對(duì)自由基清理的功能，以此來抵抗LPO損傷，能夠使機(jī)體抵御氧化毒性產(chǎn)物對(duì)組織細(xì)胞的破壞，減少組織細(xì)胞的損傷與壞死，從而進(jìn)一步減輕I/R損傷；白藜蘆醇高劑量組腎組織MDA含量低于白藜蘆醇低劑量組，SOD活性高于白藜蘆醇低劑量組，提示高劑量應(yīng)用時(shí)的保護(hù)作用更明顯。

臨床上腎臟I/R損傷是出現(xiàn)急性腎功能衰竭的主要原因，可導(dǎo)致腎血管阻力增加、腎小球?yàn)V過率下降、腎小管壞死等。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯異常，小管管腔顯著擴(kuò)張，上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的腫脹、壞死，并且出現(xiàn)管型、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)水腫現(xiàn)象，提示腎臟I/R損傷造成了腎組織的嚴(yán)重?fù)p傷；白藜蘆醇高劑量組、低劑量組腎臟組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)與模型組相比顯著緩解，提示該藥物可減弱腎臟I/R損傷，減輕腎組織受損的程度；白藜蘆醇高劑量組病理改變較白藜蘆醇低劑量組明顯改善，提示高劑量應(yīng)用時(shí)可更好地減輕腎組織病理改變。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組腎小管壞死程度評(píng)分高于假手術(shù)組，提示腎臟I/R損傷造成了腎組織中大量腎小管損傷，腎小管受到嚴(yán)重破壞；白藜蘆醇低、高劑量組低于模型對(duì)照組，白藜蘆醇高劑量組低于白藜蘆醇低劑量組，提示白藜蘆醇可減輕腎組織腎小管的損傷程度，對(duì)腎臟起到一定的保護(hù)作用，并且高劑量應(yīng)用時(shí)可更好地減輕腎組織腎小管的損傷程度。

綜上所述，白藜蘆醇后處理可減輕腎臟I/R損傷，改善腎臟功能、減輕腎組織腎小管的損傷程度，其作用可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，從而減少了氧化應(yīng)激所造成組織損傷，表明白藜蘆醇后處理對(duì)腎臟I/R模型大鼠的腎臟具有保護(hù)作用。然而，由于腎臟I/R損傷發(fā)生機(jī)制、該藥物的作用機(jī)理以及藥物后處理機(jī)制的復(fù)雜性，白藜蘆醇后處理對(duì)抗腎臟I/R損傷的機(jī)制有待更進(jìn)一步研究。

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國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(201610439014)。

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2017-04-16)