方芳，馬靜，崔家博，王立國(guó)

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林132013)

胡桃醌對(duì)前列腺癌細(xì)胞雄激素受體及PI3K/AKT通路蛋白表達(dá)的影響

方芳，馬靜，崔家博，王立國(guó)

(吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗(yàn)學(xué)院，吉林吉林132013)

目的探討胡桃醌對(duì)人前列腺癌LNCaP 細(xì)胞雄激素受體(AR)及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路蛋白表達(dá)的影響。方法培養(yǎng)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、胡桃醌低劑量組、胡桃醌中劑量組及胡桃醌高劑量組。分別加入終濃度為12.5、25和50 μmol/L胡桃醌作用24 h，空白對(duì)照組不加入胡桃醌。采用Western blotting法檢測(cè)磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、AR、β-catenin蛋白表達(dá)。為觀察LY294002與胡桃醌對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路是否具有交互作用，將LNCaP細(xì)胞分為空白對(duì)照組、胡桃醌組、LY294002組、胡桃醌+LY294002組，胡桃醌組加入胡桃醌50 μmol/L，LY294002組加入LY294002 20 μmol/L，胡桃醌+LY294002組加入LY294002 20 μmol/L及胡桃醌50 μmol/L，空白對(duì)照組不加入LY294002及胡桃醌，各組干預(yù)24 h后，采用Western blotting法檢測(cè)p-AKT、β-catenin、AR及AR下游分子前列腺特異性抗原(PSA)的表達(dá)變化。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，胡桃醌低、中、高劑量組p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。與胡桃醌組、LY294002組比較，胡桃醌+LY294002組p-AKT、β-catenin、AR及PSA蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。結(jié)論胡桃醌能夠抑制前列腺癌細(xì)胞AR的表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路導(dǎo)致AR共刺激分子β-catenin表達(dá)下降有關(guān)。

胡桃醌；前列腺癌；雄激素受體；磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一。針對(duì)雄激素-雄激素受體(AR)的雄激素剝奪療法(ADT)是治療中晚期前列腺癌的主要手段。前列腺是雄激素依賴性器官，AR在去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)發(fā)生過程中起著核心作用，仍然是臨床治療CRPC的有效靶點(diǎn)[1,2]。因此，發(fā)掘新的藥物和治療方法，改善CRPC的療效和預(yù)后，就成為目前前列腺癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。胡桃醌是從胡桃楸的外殼中提取的一種活性成分，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[4,5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，胡桃醌具有抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡作用[6]。然而，胡桃醌對(duì)前列腺癌細(xì)胞中AR的表達(dá)是否有影響及其機(jī)制尚不明確。2015年1月～2017年1月，本研究通過觀察胡桃醌對(duì)人前列腺癌LNCaP細(xì)胞AR表達(dá)及其作用機(jī)制，探討胡桃醌抑制前列腺癌細(xì)胞的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 前列腺癌LNCaP細(xì)胞(上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù))；胡桃醌(美國(guó)Sigma公司)；兔抗磷酸化蛋白激酶 B (p-AKT)、β-catenin、前列腺特異性抗原(PSA)、β-actin抗體和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/AKT通路抑制劑LY294002(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)；AR(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及干預(yù)方法 人前列腺癌LNCaP細(xì)胞于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用RPMI 1640+10% FCS培養(yǎng)，隔日換液。分為空白對(duì)照組、胡桃醌低劑量組、胡桃醌中劑量組及胡桃醌高劑量組。胡桃醌低、中、高劑量組分別加入終濃度為12.5、25和50 μmol/L胡桃醌作用細(xì)胞24 h，空白對(duì)照組不加入LY294002及胡桃醌。

1.3 p-AKT、p-AR及β-catenin蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)。提取細(xì)胞總蛋白，取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠上蛋白移至醋酸纖維素膜，于50 g/L脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗p-AKT、β-catenin、AR(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。次日TBST洗膜，分別加HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)，室溫避光孵育2 h。TBST洗膜，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

1.4 胡桃醌與LY294002交互作用觀察 分為空白對(duì)照組、胡桃醌組、LY294002組、胡桃醌+LY294002組，胡桃醌組加入胡桃醌50 μmol/L，LY294002組加入LY294002 20 μmol/L，胡桃醌+LY294002組加入LY294002 20 μmol/L及胡桃醌50 μmol/L，空白對(duì)照組不加入LY294002及胡桃醌。各組干預(yù)24 h后，采用Western blotting法檢測(cè)p-AKT、β-catenin、AR及AR下游分子PSA的表達(dá)變化，方法同1.3。

2 結(jié)果

2.1 各組p-AKT、AR、β-catenin蛋白表達(dá)比較 與空白對(duì)照組比較，胡桃醌低、中、高劑量組p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)，詳見表1、圖1。

表1 各組p-AKT、AR及β-catenin蛋白表達(dá)比較

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，﹟P<0.01。

圖1 各組p-AKT、AR及β-catenin蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.2 胡桃醌與LY294002交互作用結(jié)果 與胡桃醌組、LY294002組比較，胡桃醌+LY294002組p-AKT、β-catenin、AR及PSA蛋白表達(dá)均降低(P均<0.05)。詳見表2、圖2。

表2 胡桃醌與LY294002交互作用對(duì)p-AKT、β-catenin、AR、PSA蛋白表達(dá)的影響

注：與胡桃醌+LY294002組比較，*P<0.05。

圖2 胡桃醌與LY294002交互作用對(duì)p-AKT、β-catenin、AR、PSA蛋白表達(dá)的影響(Western blotting法)

3 討論

近年來由于飲食結(jié)構(gòu)改變和人口老齡化，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率逐年增高[7]?；颊咴诮邮蹵DT治療后2～3年內(nèi)，往往由雄激素依賴性前列腺癌(ADPC)轉(zhuǎn)化為CRPC。CRPC是前列腺癌病程中的致死性階段，盡管采用新型ADT藥物、化療、核素與生物治療等方法可使CRPC的預(yù)后有所改善，但是患者的平均存活期仍不足2年[8]。因此，發(fā)掘新的藥物和治療方法，改善CRPC的療效和預(yù)后，就成為目前前列腺癌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

CRPC是前列腺癌病程中的致死性階段，AR在CRPC發(fā)生中起著核心作用。AR通過基因擴(kuò)增、突變、剪接體、共激活因子和信號(hào)通路活化等途徑導(dǎo)致其異常表達(dá)或(和)活化，使ADPC細(xì)胞增殖并最終導(dǎo)致CRPC[9,10]。AR通路是CRPC諸多形成機(jī)制中的共同點(diǎn)，在ADPC 進(jìn)展為CRPC的過程中起著核心作用。AR引發(fā)CRPC的機(jī)制主要有AR點(diǎn)突變、AR過表達(dá)、AR共激活因子促進(jìn)AR異?；罨萚11]。因此，AR亦是CRPC 的治療靶點(diǎn)。PSA是AR調(diào)節(jié)的下游靶分子，AR可以促進(jìn)PSA基因的轉(zhuǎn)錄及其表達(dá)。PSA是前列腺癌的特異性標(biāo)志物，PSA增高是診斷前列腺癌發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志物。

我國(guó)的藥用植物資源豐富，已發(fā)現(xiàn)多種植物成分具有抗癌作用。人們很早就發(fā)現(xiàn)核桃楸樹皮及果皮具有抗腫瘤、抗炎和殺蟲的作用，在中國(guó)許多治療癌癥的驗(yàn)方中都含有核桃楸成分。研究發(fā)現(xiàn)，核桃楸中具有抗腫瘤、抗炎及殺蟲作用的有效成分是胡桃醌。本研究表明，胡桃醌作用前列腺癌LNCaP細(xì)胞后p-AKT、AR及AR的共刺激分子β-catenin 蛋白表達(dá)逐漸下降。PI3K/AKT信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞中起著重要的調(diào)節(jié)作用，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、血管生成等作用。研究表明，PI3K/AKT通路可以調(diào)節(jié)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性。β-catenin是AR的共激活因子，β-catenin能與AR結(jié)合，有效協(xié)助AR誘導(dǎo)AR調(diào)控基因的表達(dá)。本研究表明，胡桃醌低、中、高劑量組p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達(dá)均降低，提示胡桃醌能夠降低p-AKT、β-catenin及AR蛋白表達(dá)。

進(jìn)一步證實(shí)胡桃醌、PI3K/AKT信號(hào)通路與AR之間的關(guān)系，本研究采用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002與胡桃醌共同作用細(xì)胞24 h，觀察LY294002與胡桃醌對(duì)于PI3K/AKT信號(hào)通路是否具有交互作用。本研究結(jié)果表明，LY294002與胡桃醌間具有交互效應(yīng)，胡桃醌+LY294002組p-AKT、β-catenin、AR及PSA蛋白表達(dá)表達(dá)均降低，提示LY294002與胡桃醌間的交互效應(yīng)可使p-AKT、β-catenin、AR和PSA蛋白表達(dá)表達(dá)明顯降低，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。

綜上所述，胡桃醌能夠抑制前列腺癌細(xì)胞AR及其下游分子PSA的表達(dá)，其機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號(hào)通路導(dǎo)致AR共刺激分子β-catenin表達(dá)下降有關(guān)。

[1] Eqan A, Dong Y, Zhang H, et al. Castration-resistant prostate cancer: adaptive response in the androgen axis[J]. Cancer Treat Rev, 2014,40(3):426-433.

[2] Henzler C, Li Y, Yang R, et al. Truncation and constitutive activation of the androgen receptor by diverse genomic rearrangements in prostate cancer[J]. Nat Commun, 2016,7(7):13668-13680.

[3] Wang J, Zou JX, Xue X, et al. ROR-γ drives androgen receptor expression and represents a therapeutic target in castration-resistant prostate cancer[J]. Nat Med, 2016,22(5):488-496.

[4] Xu HL, Yu XF, Qu SC, et al. Juglone, from Juglans mandshruica Maxim, inhibits growth and induces apoptosis in human leukemia cell HL-60 through a reactive oxygen species-dependent mechanism[J]. Food Chem Toxicol, 2012,50(3-4):590-596.

[5] 趙行宇,楊森,周麗霞,等．胡桃醌對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào),2013,2(3):255-258.

[6] 方芳,王立國(guó),孔德玉,等.胡桃醌對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)作用研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2013,24(5):1120-1121．

[7] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[8] Lowrance WT, Roth BJ, Kirkby E, et al. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015[J]. J Urol, 2016,195(5):1444-1452.

[9] Henzler C, Li Y, Yang R, et al. Truncation and constitutive activation of the androgen receptorby diverse genomic rearrangements in prostate cancer[J]. Nat Commun, 2016,7(7):13668-13680.

[10] Watson PA, Arora VK, Sawyers CL, et al. Emerging mechanisms of resistance to androgen receptor inhibitors in prostate cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2015,15(12):701-711.

[11] Ferraldeschi R, Welti J, Luo J, et al. Targeting the androgen receptor pathway in castration-resistant prostate cancer: progresses and prospects[J]. Oncogene, 2015,34(14):1745-1757.

JugloneinhibitsARexpressionthroughPI3K/AKTpathwayinhumanprostatecancercells

FANGFang,MAJing,CUIJiabo,WANGLiguo

(CollegeofLaboratory,JilinMedicalUniversity,Jilin132013,Chain)

ObjectiveTo investigate the effects of juglone on the androgen receptor (AR) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/AKT pathway expression in the prostate cancer LNCaP cells.MethodsThe human prostate cancer LNCaP cells were divided into the blank control group (without juglone), the low-dose juglone group (12.5 μmol/L), medium-dose juglone group (25 μmol/L) and high-dose juglone group (50 μmol/L). After the cells in each group were treated for 24 h, Western blotting was used to detect the expression of p-AKT, AR and β-catenin. In order to observe whether LY294002 and juglon had interaction on PI3K/AKT signal pathway, LNCaP cells were divided into the blank control group (without juglone and LY294002), juglone group (50 μmol/L juglone), LY294002 group (20 μmol/L LY294002), juglone and LY294002 group (50 μmol/L Juglone and 20 μmol/L LY294002). Cells in each group were treated for 24 h and Western blotting was used to detect the expression of p-AKT, AR, β-catenin, and prostate-specific antigen (PSA).ResultsCompared with the blank control group, the p-AKT, β-catenin and AR expression levels of LNCaP cells decreased in the low-dose, medium-dose and high-dose juglone groups (allP<0.05). Compared with the juglone group and LY294002 group, the expression levels of p-AKT, β-catenin, AR, and PSA decreased in the juglone and LY294002 groups (allP<0.05).ConclusionJuglone can inhibit the expression of AR in the prostate cancer cells, and its mechanism may be that the inhibition of PI3K/AKT signaling pathways leads to the decrease of β-catenin expression.

juglone; prostate carcinoma; androgen receptor; phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.006

R737.25

A

1002-266X(2017)46-0024-03

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究[吉教科合字(2014)第360號(hào)]。

方芳(1973-)，女，博士，副教授，研究方向?yàn)槟[瘤的藥物治療。E-mail: jillmcfang@163.com

王立國(guó)(1971-)，男，博士，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟[瘤的藥物治療。E-mail： urolancet@sina.com

2017-08-13)