黃巖，王賀義，李遠哲，李陽

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

西黃丸對腎母細胞瘤增殖、凋亡的影響及機制探討

黃巖，王賀義，李遠哲，李陽

(鄭州大學第三附屬醫(yī)院，鄭州450052)

目的觀察西黃丸對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡的影響，并探討其作用機制。方法收集臨床確診為腎母細胞瘤患者的術(shù)中癌組織切塊，進行原代培養(yǎng)，取處于對數(shù)生長期的腎母細胞瘤細胞，分為高、中、低濃度組及對照組。高、中、低濃度組分別加入4、2、1 mg/mL的西黃丸浸提液，對照組加入相同劑量的培養(yǎng)基。采用MTS法測定各組細胞增殖抑制率，流式細胞儀測定各組細胞瘤凋亡率，Western blotting法檢測各組細胞中B細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的表達。結(jié)果高、中、低濃度組細胞增殖抑制率均高于對照組，且濃度較高組的細胞增殖抑制率較高(P均<0.05)。高、中、低濃度組細胞凋亡率均高于對照組，且濃度較高組的細胞凋亡率較高(P均<0.05)。高、中、低濃度組Bax蛋白相對表達量均高于對照組，且濃度較高組的Bax蛋白相對表達量較高(P均<0.05)。高、中、低濃度組Bcl-2蛋白相對表達量均低于對照組，且濃度較高組的Bcl-2蛋白相對表達量較低(P均<0.05)。結(jié)論西黃丸可以抑制腎母細胞瘤的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與促進Bax蛋白表達、抑制Bcl-2蛋白表達有關(guān)。

西黃丸；腎母細胞瘤；細胞增殖；細胞凋亡；B細胞淋巴瘤因子-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白

腎母細胞瘤又稱Wilms瘤，是兒童最常見的惡性實體腫瘤之一，占兒童腎臟腫瘤的95%[1]?；純憾嘁愿共堪鼔K和肉眼血尿為首要癥狀就診，其主要治療方法包括手術(shù)治療、放療、化療等，但并發(fā)癥均較多[2]。因此，尋求一種新的治療方案對于提高療效、降低并發(fā)癥具有重要意義。中藥治療以其療效顯著、不良反應(yīng)小以及能明顯提高患者生活質(zhì)量為特點，在臨床應(yīng)用中受到越來越多的重視。西黃丸又名犀黃丸，具有散癰解毒、軟堅散結(jié)等功效[3]。研究表明，西黃丸對人結(jié)腸癌細胞[4]等多種腫瘤細胞均有抑制作用，并已廣泛應(yīng)用于乳腺癌等腫瘤疾病的治療中。但目前，西黃丸對腎母細胞瘤是否有抑制作用及其機制尚不明確。2017年1～5月，我們觀察了西黃丸對腎母細胞瘤細胞增殖、凋亡的影響并探討其可能的機制，為西黃丸治療腎母細胞瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器 西黃丸購自北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰酶、水溶性甲臢化合物(MTS)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)均購于Gibco公司，Annexin V-FITC購于南京諾唯贊生物科技有限公司，B細胞淋巴瘤因子-2(Bcl-2)抗體和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體均購于美國BD公司，免疫印跡試劑盒購于賽默飛世爾科技有限公司。ELx808吸收光酶標儀購于美國伯騰儀器有限公司。

1.2 腎母細胞瘤細胞原代培養(yǎng)及分組方法 選取于我院行腎母細胞瘤切除術(shù)患者的術(shù)中癌組織切塊，置于含雙抗PBS緩沖液的無菌培養(yǎng)皿中浸泡3～5 min，漂洗10次后剪碎，放入盛有0.2%Ⅲ型膠原蛋白酶以及50 μL透明質(zhì)酸酶的15 mL離心管中，氣浴恒溫振蕩器振蕩40～60 min。之后用200目不銹鋼細胞篩過濾并收集濾液，800 r/min離心8 min，棄上清，加入含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后進行第1次換液，以后每2～3天換液1次，待細胞融合達80%后，消化傳代。取處于對數(shù)生長期的腎母細胞瘤細胞，分為高濃度組、中濃度組、低濃度組及對照組，并設(shè)置沒有細胞的DMEM完全培養(yǎng)基作為空白組，每組設(shè)6個復(fù)孔，每孔90 μL。

1.3 西黃丸浸提液的制備 采用金沈銳[5]提出的方法制備西黃丸浸提液。先將西黃丸研磨成粉末，采用密閉容器，浸泡于4 ℃的DMEM培養(yǎng)液中。浸泡24 h后，超聲振蕩助溶2 h，之后再繼續(xù)4 ℃浸泡48 h，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔器過濾后得到西黃丸浸提液。用DMEM培養(yǎng)液將西黃丸浸提液分別稀釋至4、2、1 mg/mL，待后續(xù)實驗。

1.4 細胞增殖抑制率檢測 采用MTS法。取各組細胞，待細胞貼壁后，按5×103/孔的標準接種于96孔板內(nèi)，高濃度組、中濃度組、低濃度組分別加入4、2、1 mg/mL的西黃丸浸提液，對照組加入相同劑量的培養(yǎng)基，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。之后取出96孔板，每孔加入20 μL MTS/PMS(20∶1)混合液，放入培養(yǎng)箱中反應(yīng)3 h，在490 nm下應(yīng)用酶標儀測吸光度。實驗重復(fù)3次。增殖抑制率=(對照組OD490-實驗組OD490)/(對照組OD490-空白組OD490)×100%。

1.5 細胞凋亡率檢測 采用流式細胞儀。取對數(shù)生長期的腎母細胞瘤細胞，按1×105/孔的標準接種于6孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，高、中、低濃度組和對照組分別加入4、2、1、0 mg/mL的西黃丸浸提液，每組設(shè)3個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，收集細胞，加入4 ℃預(yù)冷的PBS緩沖液，1 200 r/min離心5 min，棄上清，之后加入100 μL的Binding Buffer重懸細胞，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫下避光反應(yīng)10 min。最后加入400 μL Binding Buffer，1 h內(nèi)行流式細胞儀檢測，測定細胞凋亡率。細胞凋亡率=凋亡細胞/(凋亡細胞數(shù)+正常細胞數(shù))×100%。實驗重復(fù)3次。

1.6 Bax、Bcl-2蛋白表達檢測 采用Western blotting法。將細胞按1×105/孔接種于6孔板內(nèi)，待貼壁后分別加入4、2、1、0 mg/mL浸提液，24 h后，去培養(yǎng)基，PBS沖洗3遍，加入裂解液，離心5 min，移取上清液。凝膠電泳，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PBS沖洗3次。將Bax抗體和Bcl-2抗體稀釋至0.1 μg/mL后加到NC膜正面，冰箱過夜。之后加入稀釋的紅色熒光標記的羊抗兔IgG，室溫反應(yīng)2 h，PBS沖洗3次。以β-actin為內(nèi)參，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃描結(jié)果，分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參灰度比值來表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 高、中、低濃度組細胞增殖抑制率均高于對照組，且濃度較高組的細胞增殖抑制率較高(P均<0.05)。見表1。

2.2 各組細胞凋亡率比較 高、中、低濃度組細胞凋亡率均高于對照組，且濃度較高組的細胞凋亡率較高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖抑制率及細胞凋亡率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度組比較，﹟P<0.05；與中濃度組比較，△P<0.05。

2.3 各組Bax、Bcl-2蛋白表達比較 高、中、低濃度組Bax蛋白相對表達量均高于對照組，且濃度較高組的Bax蛋白相對表達量較高(P均<0.05)。高、中、低濃度組Bcl-2蛋白相對表達量均低于對照組，且濃度較高組的Bcl-2蛋白相對表達量較低(P均<0.05)。見表2、圖1。

表2 各組Bax、Bcl-2蛋白表達比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與低濃度組比較，﹟P<0.05；與中濃度組比較，△P<0.05。

圖1 各組Bax、Bcl-2蛋白表達情況(Western blotting法)

3 討論

目前，手術(shù)治療聯(lián)合放化療是治療腎母細胞瘤的主要手段，但是放化療在殺傷腫瘤細胞的同時，對人體正常的細胞也有較大的損害，會引起各種不良反應(yīng)和并發(fā)癥[6]。中藥配合放化療不但可以減輕其不良反應(yīng)，對腫瘤的療效也有明顯的提高，并且能改善患者全身癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。在腫瘤對化療藥物耐藥性越來越嚴重的今天，大力研究與發(fā)展中國傳統(tǒng)醫(yī)學與藥物，尋求新的治療方案已顯得刻不容緩。

惡性腫瘤的主要特征是無限增殖和凋亡障礙，因此抑制腫瘤細胞的增殖及誘導(dǎo)其凋亡是治療腫瘤的關(guān)鍵[10,11]。本研究發(fā)現(xiàn)，高、中、低濃度組細胞增殖抑制率均高于對照組，且濃度較高組的細胞增殖抑制率較高，提示西黃丸浸提液可以抑制腎母細胞瘤細胞的增殖，且其增殖抑制率與西黃丸浸提液濃度具有相關(guān)性，隨著西黃丸浸提液濃度的增加，腎母細胞瘤細胞的增殖抑制率也逐漸增加；高、中、低濃度組細胞凋亡率均高于對照組，且濃度較高組的細胞凋亡率較高，提示西黃丸浸提液對腎母細胞瘤細胞的凋亡具有促進作用，隨著西黃丸浸提液濃度的增加，腎母細胞瘤細胞的凋亡率也逐漸增加。

細胞凋亡是一個復(fù)雜的多基因調(diào)控的過程[12]。Bcl-2基因家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1等蛋白均具有抑制細胞凋亡的作用，相反，Bax、Bak、Bid、Bcl-xs、Bad等蛋白可以誘導(dǎo)細胞凋亡[13]。其中Bcl-2是第一個被確認具有抑制細胞凋亡作用的基因，它可以直接抑制過氧化物誘導(dǎo)的凋亡，又可作用于線粒體，抑制其釋放Cyt-c、AIF等促凋亡蛋白，同時，又能抑制促凋亡因子Bax、Bak的細胞毒作用，還能抑制凋亡蛋白酶Caspase-3的激活，維持細胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)，從而抑制細胞的凋亡[14]。Bax屬于前凋亡基因，其可在細胞線粒體膜上形成同源二聚體，使線粒體釋放Caspase活化因子，激活Caspase蛋白，從而誘導(dǎo)細胞的凋亡[15]。研究表明，隨著細胞凋亡率的增加，Bax蛋白的表達水平也顯著升高[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，高、中、低濃度組Bax蛋白相對表達量均高于對照組，且濃度較高組的Bax蛋白相對表達量較高，而高、中、低濃度組Bcl-2蛋白相對表達量均低于對照組，且濃度較高組的Bcl-2蛋白相對表達量較低，提示西黃丸浸提液可以抑制腎母細胞瘤細胞Bcl-2蛋白的表達、增加Bax蛋白的表達，從而下調(diào)腎母細胞瘤細胞中Bcl-2/Bax蛋白表達比例，從而誘導(dǎo)腎母細胞瘤細胞的凋亡。

綜上所述，西黃丸浸提液可以抑制腎母細胞瘤細胞的增殖并且誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與其降低Bcl-2表達并且上調(diào)Bax蛋白的表達有關(guān)。本研究為西黃丸治療腎母細胞瘤提供了科學依據(jù)，表明西黃丸治療腎母細胞瘤具有較大潛力。

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EffectsofXihuangpillsonproliferationandapoptosisofWilmstumor

HUANGYan,WANGHeyi,LIYuanzhe,LIYang

(TheThirdAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

ObjectiveTo observe the effects of Xihuang pills on the proliferation and apoptosis of Wilms tumor cells, and to explore its mechanism.MethodsWe collected the cancer tissues from the diagnosed cancer patients to perform primitive culture. Then, we selected the cells in the logarithmic growth phase to divide them into the high-dose, medium-dose and low-dose groups and the control group which were separately added with 4, 2, and 1 mg/mL water extracts of Xihuang pills, and the same dose of medium. The proliferation inhibition rate was detected by MTS, the rate of apoptosis was detected by flow cytometry, and the expression of Bax and Bcl-2 proteins was detected by Western blotting.ResultsThe proliferation inhibition rates of the high-dose group, medium-dose group, and low-dose group were higher than that of the control group, and the proliferation inhibition rate of the higher dose group was much higher than that of lower dose group (allP<0.05). The apoptosis rates of the high-dose group, medium-dose group, and low-dose group were higher than that of the control group, and the apoptosis rate of the higher dose group was much higher than that of lower dose group (allP<0.05). Western blotting showed that the relative expression of Bax was in the following order: high-dose group>medium-dose group>low-dose group>control group, allP<0.05; and the relative expression of Bcl-2 was in the opposite order: high-dose group

Xihuang pills; Wilms tumor; cell proliferation; apoptosis; B-cell lymphoma 2; Bcl-2-associated X protein

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.46.003

R737.11；R256.5

A

1002-266X(2017)46-0012-04

黃巖(1968-)，男，學士，主任醫(yī)師，研究方向為小兒泌尿外科。E-mail： hy13838047843@126.com

2017-05-10)

·作者·編者·讀者·

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