焦榮紅，于明月，張明明，?；勖?，劉 欣

脂肪酸結(jié)合蛋白4基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系研究

焦榮紅1，于明月1，張明明2，?；勖?，劉 欣1

目的探究脂肪酸結(jié)合蛋白4(FABP4)基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。方法選取2013年10月—2014年9月在河北省人民醫(yī)院就診的頸動(dòng)脈粥樣硬化患者580例，采用TaqMan SNP基因分型技術(shù)檢測(cè)rs77878271多態(tài)性；采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測(cè)FABP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)FABP4蛋白。rs77878271基因型與頸動(dòng)脈中層內(nèi)膜厚度(IMT)的關(guān)系分析采用多元線性回歸分析，與頸動(dòng)脈斑塊的關(guān)系分析采用多因素Logistic回歸分析。結(jié)果本組患者中攜帶TT基因型者占88.6%(514/580)、攜帶TC基因型者占10.0%(58/514)、攜帶CC基因型者占1.4%(8/58)。不同rs77878271基因型患者隨訪期間心血管事件發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同rs77878271基因型患者男性比例、年齡、吸煙率、肥胖發(fā)生率、高血壓發(fā)生率、糖尿病發(fā)生率、使用降壓藥物者所占比例、使用降糖藥物者所占比例、使用降脂藥物者所占比例、使用抗栓藥物者所占比例及總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(INS)、C反應(yīng)蛋白(CRP)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同rs77878271基因型患者體質(zhì)指數(shù)(BMI)、IMT、頸動(dòng)脈斑塊者所占比例及低密度脂蛋白(LDL)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多元線性回歸分析結(jié)果顯示，rs77878271基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈IMT有關(guān)(β=0.23，P<0.05)；多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，rs77878271基因型是頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈斑塊的影響因素〔OR=3.02,95%CI(1.46,7.97),P<0.05〕。TC基因型患者FABP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于CC基因型患者(P<0.05)。結(jié)論FABP4基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化程度有關(guān)。

頸動(dòng)脈硬化；脂肪酸結(jié)合蛋白4；rs77878271；多態(tài)性,單核苷酸

脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4)是脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)水平較高的一種脂質(zhì)分子伴侶，可調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、炎癥并促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[1- 2]。FABP4基因是定位于8q21的單拷貝基因，含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。董美玲等[3]研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP4基因第四號(hào)外顯子上的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs1054135與兒童肥胖無(wú)關(guān)，但rs16909187、rs16909196多態(tài)性與女性青少年肥胖有關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP4基因缺陷或口服FABP4小分子抑制劑可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[4-5]、改善肥胖相關(guān)代謝紊亂及降低2型糖尿病發(fā)生率[6]。人類FABP4基因啟動(dòng)子rs77878271 (T-87C)多態(tài)性破壞了CAAT盒子/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α結(jié)合序列，導(dǎo)致體外和體內(nèi)脂肪組織中FABP4基因轉(zhuǎn)錄降低，且FABP4變異體低表達(dá)降低了冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7]。本研究旨在探討FABP4基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年10月—2014年9月在河北省人民醫(yī)院就診的頸動(dòng)脈粥樣硬化患者580例，均經(jīng)頸動(dòng)脈超聲檢查或數(shù)字減影血管造影確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥30歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并頸動(dòng)脈畸形、頸動(dòng)脈瘤、動(dòng)脈炎、自身免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、肝腎功能不全及慢性炎性疾病者；(2)近30 d內(nèi)有輸血史者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo) 分析所有患者的臨床特征，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、心血管危險(xiǎn)因素、頸動(dòng)脈中層內(nèi)膜厚度(IMT)、頸動(dòng)脈斑塊、藥物使用情況及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。心血管危險(xiǎn)因素包括吸煙、肥胖(BMI≥28.0 kg/m2)、高血壓、糖尿?。徊捎貌噬嗥绽粘曉\斷儀檢測(cè)頸動(dòng)脈IMT，其中頸動(dòng)脈IMT≥1.2 mm定義為頸動(dòng)脈斑塊；藥物使用情況包括降壓藥物、降糖藥物、降脂藥物及抗栓藥物使用情況；實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(INS)及C反應(yīng)蛋白(CRP)。

1.3 隨訪 所有患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪截至2016年9月。記錄患者隨訪期間心血管事件發(fā)生情況，包括死亡、缺血性卒中、短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)、心肌梗死及冠心病等。

1.4 基因分型 采集所有患者全血2 ml，采用苯酚-氯仿法提取基因組DNA，通過(guò)TaqMan SNP基因分型技術(shù)檢測(cè)FABP4基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性。PCR反應(yīng)體系為5 μl，包括模板10 ng，2×TaqMan PCR MasterMix 2.5 μl、20×SNP Assay 0.25 μl。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；(92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min)×40個(gè)循環(huán)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR反應(yīng))和熒光信號(hào)讀取均在ABI7900HT Sequence Detector上完成，采用SDS 2.0圖像分析軟件進(jìn)行終點(diǎn)分析，通過(guò)檢查不同等位基因所標(biāo)記的熒光強(qiáng)度判斷待測(cè)樣本基因型。

1.5 FABP4 mRNA和蛋白檢測(cè)方法 切除患者整塊頸動(dòng)脈粥樣硬化組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗，取一小塊組織剪碎后加入1 ml TRIzol不斷研磨，待組織細(xì)胞溶解后轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。使用氯仿-異戊醇法提取RNA，使用PrimeScript?RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green熒光染料作為檢測(cè)信號(hào)，在FTC-3000 qPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,采用相對(duì)定量法(2-△△CT)分析FABP4 mRNA相對(duì)表達(dá)量。另取一小塊組織剪碎后加入1 ml RIPA裂解液(含1 mM PMSF)研磨，充分裂解細(xì)胞后，將液體轉(zhuǎn)移至無(wú)菌Eppendorf管中。采用人FABP4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)FABP4蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 不同rs77878271基因型患者心血管事件發(fā)生率比較 本組患者中攜帶TT基因型者占88.6%(514/580)、攜帶TC基因型者占10.0%(58/514)、攜帶CC基因型者占1.4%(8/58)。隨訪期間，攜帶TT基因型者心血管事件發(fā)生率為31.7%(163/514)，攜帶TC基因型者為34.5%(20/58)，攜帶CC基因型者為12.5%(1/8)；不同rs77878271基因型患者隨訪期間心血管事件發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.924，P=0.140，見(jiàn)表1)。

表1 不同rs77878271基因型患者心血管事件發(fā)生情況(例)

Table1 Incidence of cardiovascular events in patients with different rs77878271 genotypes

rs77878271基因型例數(shù)缺血性卒中TIA心肌梗死冠心病TT51428403857TC582433CC80001

注：TIA=短暫性腦缺血發(fā)作

2.2 不同rs77878271基因型患者臨床特征比較 不同rs77878271基因型患者男性比例、年齡、吸煙率、肥胖發(fā)生率、高血壓發(fā)生率、糖尿病發(fā)生率、使用降壓藥物者所占比例、使用降糖藥物者所占比例、使用降脂藥物者所占比例、使用抗栓藥物者所占比例及TC、HDL、TG、FBG、INS、CRP水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同rs77878271基因型患者BMI、頸動(dòng)脈IMT、頸動(dòng)脈斑塊者所占比例及LDL水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表2)。

表2 不同rs77878271基因型患者臨床特征比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，IMT=內(nèi)膜中層厚度，TC=總膽固醇，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白，TG=三酰甘油，F(xiàn)BG=空腹血糖，INS=空腹胰島素，CRP=C反應(yīng)蛋白；a為χ2值

2.3 頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈IMT的影響因素分析 多元線性回歸分析結(jié)果顯示，rs77878271基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈IMT有關(guān)(P<0.05，見(jiàn)表3)。

表3 頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈IMT影響因素的多元線性回歸分析

Table3 Multivariate linear regression analysis on influencing factors of carotid IMT in carotid atherosclerotic patients

變量βSEt值P值年齡0 330 390 860 41性別0 370 390 530 57BMI-0 520 39-0 090 93使用降脂藥物0 340 111 510 16rs77878271基因型0 230 073 260 03

2.4 頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈斑塊的影響因素分析 將年齡(賦值：<65歲=0，≥65歲=1)、性別(賦值：女性=0，男性=1)、肥胖(賦值：否=0，是=1)、使用降脂藥物(賦值：無(wú)=0，有=1)、rs77878271基因型(賦值：CC=0，TC/TT=1)作為自變量，將頸動(dòng)脈斑塊(賦值：無(wú)=0，有=1)作為因變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，rs77878271基因型是頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈斑塊的影響因素(P<0.05，見(jiàn)表4)。

表4 頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈斑塊影響因素的多因素Logistic回歸分析

Table4 Multivariate Logistic analysis on influencing factors of carotid plaques in carotid atherosclerotic patients

變量βSEWaldχ2值dfP值OR(95%CI)年齡0 390 110 4810 551 43(0 55，3 11)性別0 430 070 5510 591 57(0 82，2 55)BMI0 750 881 5110 211 18(0 45，2 12)降脂藥物0 891 233 3410 071 781(0 73，4 32)rs77878271基因型1 611 534 0910 023 02(1 46，7 97)

2.5 不同rs77878271基因型患者FABP4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 以攜帶TT基因型患者FABP4 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量作為1，攜帶TC基因型患者mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于攜帶CC基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表5)。

Table5 Comparison of relative expression quality of FABP4 mRNA and protein in patients with different rs77878271 genotypes

基因型例數(shù)mRNA相對(duì)表達(dá)量蛋白相對(duì)表達(dá)量TC580 31±0 070 33±0 05CC80 84±0 100 75±0 11t值6 653 27P值0 010 03

3 討論

FABP4主要表達(dá)于脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可影響脂肪酸代謝及脂肪酸信號(hào)傳導(dǎo)，與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。既往研究結(jié)果顯示，頸動(dòng)脈斑塊中FABP4高表達(dá)與卒中發(fā)生有關(guān)[8]，分析其機(jī)制可能如下：FABP4激活未折疊蛋白應(yīng)答(UPR)信號(hào)通路[4]，導(dǎo)致血管壁巨噬細(xì)胞中的游離膽固醇進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)而增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并擾亂其功能[6]，導(dǎo)致無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞凋亡[9- 10]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2周齡載脂蛋白E缺陷小鼠經(jīng)致死性放射后，分別移植FABP4突變和缺陷型小鼠的骨髓，結(jié)果顯示，正常飲食喂養(yǎng)13周后移植FABP4缺陷型骨髓的小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊體積明顯縮小[11]；小鼠口服FABP4小分子抑制劑可防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展及血管病變發(fā)生[12]，提示FABP4可能具有促動(dòng)脈粥樣硬化作用。雖然FABP4缺乏抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，但FABP4基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性與人類動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示，不同rs77878271基因型患者隨訪期間心血管事件發(fā)生率間無(wú)差異，分析其原因可能與本研究隨訪時(shí)間短及納入的部分患者較年輕有關(guān)。

頸動(dòng)脈IMT增加是亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化的臨床標(biāo)志，其與心肌梗死和卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)[12]。既往研究結(jié)果顯示，小鼠FABP4基因缺陷可改善脂質(zhì)代謝、保護(hù)胰腺β細(xì)胞，進(jìn)而預(yù)防肥胖誘導(dǎo)的胰島素抵抗和2型糖尿病[13-14]。本研究結(jié)果顯示，rs77878271基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈IMT有關(guān)，且rs77878271基因型是頸動(dòng)脈粥樣硬化患者頸動(dòng)脈斑塊的影響因素，提示rs77878271基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化程度有關(guān)。

綜上所述，F(xiàn)ABP4基因啟動(dòng)子rs77878271多態(tài)性與頸動(dòng)脈粥樣硬化程度有關(guān)，F(xiàn)ABP4可能成為動(dòng)脈粥樣硬化新的治療靶點(diǎn)。

作者貢獻(xiàn)：焦榮紅進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，撰寫論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；于明月、張明明、劉欣進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；?；勖暨M(jìn)行結(jié)果分析與解釋；于明月、劉欣進(jìn)行論文及英文的修訂。

本文無(wú)利益沖突。

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RelationshipbetweenFABP4GenePromoterrs77878271PolymorphismandCarotidAtherosclerosis

JIAORong-hong1，YUMing-yue1，ZHANGMing-ming2，NIUHui-min1，LIUXin1

1.DepartmentofUltrasonography，thePeople′sHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050051，China2.ClinicalLaboratory，thePeople′sHospitalofHebeiProvince，Shijiazhuang050051，China

ObjectiveTo investigate the relationship between FABP4 gene promoter rs77878271 polymorphism and carotid atherosclerosis.MethodsA total of 580 patients with carotid atherosclerosis were selected in the People′s Hospital of Hebei Province，TaqMan SNP genotyping technique was used to detect the FABP4 gene promoter rs77878271 polymorphism；real-time fluorescence quantitative PCR was used to detected the relative expression quantity of FABP4 mRNA，enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the relative expression quantity of FABP4 protein.Multivariate linear regression analysis was used to analyze the influencing factors of carotid IMT，meanwhile multivariate Logistic regression analysis was used to analyze the influencing factors of carotid plaques.ResultsOf the 580 patients，514 cases were TT genetype(accounting for 88.6%)，58 cases were TC genetype(accounting for 10.0%)，8 cases were CC genetype(accounting for 1.4%).No statistically significant differences of incidence of diovascular events was found in patients with different genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271 during the follow-up(P>0.05).No statistically significant differences of male proportion，age，smoking rate，incidence of fat，hypertension or diabetes，proportion of patients using antihypertensive drugs，antidiabetic drugs，lipid-lowering drugs or antithrombotic drugs，TC，HDL，TG，F(xiàn)BG，INS or CRP was found in patients with different genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271(P>0.05)，while there were statistically significant differences of BMI，carotid IMT，proportion of patients with carotid plaques and LDL in patients with different genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271(P<0.05).Multivariate linear regression analysis results showed that，genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271 was significantly correlated with carotid IMT in patients with carotid atherosclerosis(β=0.23，P<0.05)；multivariate Logistic regression analysis results showed that，genetypes of FABP4 gene promoter rs77878271 was one of influencing factors of carotid plaques in patients with carotid atherosclerosis〔OR=3.02，95%CI(1.46，7.97)，P<0.05〕.Relative expression quantity of FABP4 mRNA and protein in patients with TC genetypes were statistically significantly lower than those in patients with CC genetypes(P<0.05).ConclusionFABP4 gene promoter rs77878271 polymorphism is significantly correlated with carotid atherosclerosis.

Carotid atherosclerosis；Fatty acid-binding protein 4；rs77878271；Polymorphism，single

河北省重點(diǎn)課題計(jì)劃項(xiàng)目(20150137)

1.050051河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院超聲科

2.050051河北省石家莊市，河北省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

R 543.4

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.11.012

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2017-09-21；

2017-11-20)

謝武英)