李沛利，高 源，劉 丹，李 娟，嚴(yán)吉明

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院&作物重大病害實(shí)驗(yàn)室&作物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，成都 611130）

四川省成都市巴西野牡丹炭疽病病原菌的初步鑒定

李沛利，高 源，劉 丹，李 娟，嚴(yán)吉明*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院&作物重大病害實(shí)驗(yàn)室&作物科學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，成都 611130）

【目的】確定巴西野牡丹炭疽病的病原，為病害的診斷和防治提供理論依據(jù)。【方法】從四川省成都市采集疑似為炭疽病的巴西野牡丹病葉，采用組織分離法分離病原菌，單孢純化所得菌株通過柯赫氏法則驗(yàn)證，結(jié)合菌落特征、分生孢子與附著胞的形態(tài)和多基因的系統(tǒng)發(fā)育分析確定病原菌?！窘Y(jié)果】巴西野牡丹炭疽病的致病菌為狹義的膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides sensu stricto）?！窘Y(jié)論】這是狹義的膠胞炭疽菌（C.gloeosporioides sensu stricto）引起巴西野牡丹炭疽病的首次報(bào)道。

巴西野牡丹；炭疽?。恍螒B(tài)學(xué)；多基因

巴西野牡丹（Tibouchina semidecandra Cogn.）原產(chǎn)于巴西，屬野牡丹科蒂牡花屬，常綠灌木。巴西野牡丹繁殖極其容易，葉片終年常綠，花色紫紅，密集美觀，常作為觀賞植物廣為種植[1]。

巴西野牡丹的抗病性強(qiáng)，目前關(guān)于該植物病害的報(bào)道較少，根據(jù)在fungaldatabases中檢索[2]結(jié)果，國外報(bào)道了4種病害，國內(nèi)僅見黃晉與[3]對由旋柄腐霉（Pythium helicoides）引起的根腐病進(jìn)行的報(bào)道，Shi Z.R.[4]對由菱形貝爾特孢（Beltrania rhombica）引起的新型葉斑病進(jìn)行的報(bào)道。我們在對成都市巴西野牡丹進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種由炭疽菌屬（Colletotrichum Cda.）菌物引起的炭疽病。該病主要危害葉片，形成葉斑，炭疽病的發(fā)生不僅使巴西野牡丹的光合作用受到制約，也大大降低了巴西野牡丹的觀賞價(jià)值。

炭疽菌屬（Colletotrichum Cda.）菌物種的鑒定主要在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。其中利用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列（rDNAITS）是常用的方法。真菌在rDNA-ITS區(qū)段既具保守性，又在屬間及同屬不同種間存在著廣泛的多態(tài)性，利用這一特性對ITS區(qū)進(jìn)行PCR，可用于病菌分類鑒定、監(jiān)測及病害診斷等。但在炭疽菌屬的分子鑒定中，由于復(fù)合種[5-8]的存在，僅采用ITS序列無法有效的識(shí)別。因此目前除ITS序列之外，常與肌動(dòng)蛋白（actin，ACT）、幾丁質(zhì)合成酶 A（chitin synthase A，CHS-1）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、β-微管蛋白（β-tubulin，TUB2）、鈣調(diào)蛋白（calmodulin，CAL）等基因一起聯(lián)合構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行鑒定，不同復(fù)合種鑒定常用的基因略有差異[5-8]。

巴西野牡丹的適應(yīng)性極佳，廣泛用于成都的城市綠化和園林綠地，雖然巴西野牡丹炭疽病在成都零星發(fā)生，但局部地區(qū)發(fā)病率較高，使其觀賞價(jià)值受到很大影響。弄清病原菌的分類地位是病害防治的基礎(chǔ)，但目前未見關(guān)于巴西野牡丹炭疽病病原菌的記載，更無系統(tǒng)報(bào)道。因此有必要對成都市炭疽菌屬（Colletotrichum Cda.）菌物引起的巴西野牡丹炭疽病進(jìn)行病原鑒定，從而為該病的診斷和防治提供一定理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

采自四川省成都市植物園的疑似為炭疽病的巴西野牡丹病樣，觀察并記錄其發(fā)病部位與病斑形狀、顏色等特點(diǎn)后，裝入保鮮袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離培養(yǎng)

采用常規(guī)的組織分離法[9]進(jìn)行病原菌分離，獲得的培養(yǎng)物采用直接挑取法[10]進(jìn)行純化，獲得病原菌的單孢菌株，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定

購買盆栽巴西野牡丹用于實(shí)驗(yàn)，選取無病斑、生長一致的健康葉片，清洗去表面的灰塵，再用75%的酒精棉球擦拭，無菌水清洗后自然晾干，設(shè)置無傷、穿刺和砂紙擦拭3種處理方式。用無菌水從活化培養(yǎng)7 d的PDA平板上洗下分生孢子，配制成濃度為107個(gè)/mL的孢子懸浮液，用毛筆刷于處理好葉片表面，均以刷無菌水的葉片為對照，每處理接種10片葉片，重復(fù)3次[11]。接種后的植株置于塑料棚內(nèi)保濕培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況。待葉片發(fā)病則取發(fā)病部位重新分離，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.2.3 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將確定為致病菌的菌株移接至PDA平板，在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記錄菌絲生長速度及菌落的形態(tài)。培養(yǎng)至產(chǎn)孢以后，挑取分生孢子制成臨時(shí)玻片，觀察其形態(tài)特征，隨機(jī)選取100個(gè)分生孢子測量大小。

分生孢子附著胞的萌發(fā)參考Yang Y.L.等[12]報(bào)道進(jìn)行，24 h后在顯微鏡下觀察分生孢子附著胞的形態(tài)，隨機(jī)選取50個(gè)測量大小。菌絲附著胞的萌發(fā)參考Cai L.等[13]的方法，7 d后在顯微鏡下觀察菌絲附著胞形態(tài)，隨機(jī)選取50個(gè)測量大小。

1.2.4 病原菌的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將供試菌株分別接種于PDA平板上，7 d后收集菌絲，采用生工生物工程股份有限公司（生工）研制的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。參照B.S.Weir等人[6]的方法，由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，反應(yīng)體系及條件參照李沛利等[11]進(jìn)行。

將獲得的PCR產(chǎn)物送至生工測序，所得各個(gè)基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對，并結(jié)合測序峰圖對必要的地方進(jìn)行手動(dòng)修改。下載相似性高的序列及其對應(yīng)復(fù)合種常見模式菌的序列（表1），使用ClustalX 2.0.10軟件進(jìn)行剪切，按ITS-ACT-GAPDHCHS-1-TUB2-CAL的順序相連，以C.Karstii（CORCG6）為外群，通過PAUP v4.0b10軟件以最大簡約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀

巴西野牡丹炭疽病在田間發(fā)病情況差異較大，有的地方零星發(fā)生，但有的地方發(fā)病率可達(dá)40%～50%。一般從葉尖開始發(fā)病，病斑不規(guī)則形，灰褐色至枯白色，邊緣褐色。隨著病害的擴(kuò)展，病斑逐漸蔓延到葉片中部，嚴(yán)重時(shí)整葉發(fā)病，造成葉片死亡（見圖 1）。

2.2 菌株的分離培養(yǎng)

經(jīng)分離培養(yǎng)得到的菌株菌落形態(tài)基本一致，將單孢純化后得到代表菌株命名為BXYMD用于進(jìn)一步測定。

表1 建樹所用菌株及登陸號(hào)Table1 Details of the isolates used in this study

2.3 致病性測定

將單孢菌株BXYMD活化后，接種到健康的巴西野牡丹葉片上，結(jié)果表明，無傷接種與對照葉片均未發(fā)?。簧凹埐潦煤笏㈡邞乙旱娜~片10 d后全部發(fā)?。▓D2a），癥狀與自然發(fā)病的癥狀相似，對照葉片均未發(fā)?。▓D2b）；穿刺接種與對照葉片均僅在針刺處有輕微壞死（圖2c、圖2d）。分離人工接種的感病葉片，所得病原菌與原接種病原菌特征一致，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證。

2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

單孢菌株活化培養(yǎng)后用于觀察菌落形態(tài)。菌落正面產(chǎn)生灰白色菌絲（圖3a），背面為黃褐色，略帶輪紋狀（圖3b），菌絲生長速率為13.3 mm/d，培養(yǎng)第5天菌落中央伴有粉紅色孢子堆產(chǎn)生。分生孢子單胞，圓柱形，較直，一端鈍圓，另一端鈍圓或略細(xì)（圖3c）。隨機(jī)選取100個(gè)分生孢子進(jìn)行測量，得其大小為（12.6～18.6）μm×（3.9～6.1）μm，（av=16.1 μm×5.3 μm，n=100）。分生孢子一般兩端萌發(fā)形成附著胞，形態(tài)多呈近球形、卵形或者棒形，少數(shù)不規(guī)則形，邊緣多平滑（圖4），有的還能形成次級(jí)附著胞，大小為（6.6～10.2）μm×（3.9～7.2）μm，（av=8.3 μm×5.7 μm，n=50）。形成的菌絲附著胞呈近球形、卵形、棒形或不規(guī)則形（圖 5），大小為（7.3～15.5）μm×（3.9～7.9）μm，（av=10.7 μm×5.8 μm，n=50）。

圖1 自然患病的巴西野牡丹葉片F(xiàn)igure1 Anthracnose symptoms on T.semidecandra leaves in the field

圖2 接種10 d的巴西野牡丹葉片F(xiàn)igure2 Anthracnose symptoms on T.semidecandra leaves after inoculation 10 days

圖3 菌落及分生孢子形態(tài)圖Figure3 Characteristics of colony and conidia

圖4 分生附著胞形態(tài)圖Figure4 Characteristics of conidia

圖5 菌絲附著胞形態(tài)圖Figure5 Characteristics of mycelial

2.5 病原菌的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及其親緣關(guān)系

構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹樹長TL=760，一致性指數(shù)CI=0.8250，保留指數(shù)RI=0.8188，校正一致性指數(shù)RC=0.6755，從發(fā)育樹上（圖6）可以看出，BXYMD菌株與參與分析的狹義膠胞炭疽菌（C.gloeosporioides sensu stricto）聚在一起，形成一個(gè)明顯的分支，而其他種的炭疽菌也各自聚在一起形成明顯的分支，并且每個(gè)分支之間都有很高的支持率，將巴西野牡丹炭疽病的致病菌（帶★菌株）確定為狹義的膠胞炭疽菌（C.gloeosporioides sensu stricto（Penz.）Penz.&Sacc）。

圖6 基于最大簡約法構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 6 Polygene phylogenetic tree from maximum parsimony analysis

3 討論與結(jié)論

致病性測定發(fā)現(xiàn)，在人工接種10d后，僅砂紙擦拭能讓寄主發(fā)病，而針刺接種未引起寄主發(fā)病，說明病原菌需要較嚴(yán)重的傷口才能侵入寄主，這可能是因?yàn)榘臀饕澳档と~片表面的細(xì)絨毛，可有效地阻擋微傷后病原菌的侵入，砂紙擦拭打破了這種保護(hù)，這可能也是田間自然情況下巴西野牡丹抗病性較強(qiáng)的原因。目前，成都的巴西野牡丹苗多來自廣州、福建、廣西等地，在長途運(yùn)輸中，如果葉片損傷嚴(yán)重，則種植后發(fā)病也會(huì)比較嚴(yán)重，盡量減少傷口的產(chǎn)生及使用不帶炭疽菌的種苗是減少巴西野牡丹炭疽病發(fā)生的有效途徑。

炭疽菌屬分生孢子的形態(tài)有兩種，一種是直孢形，兩端多鈍圓或漸尖成梭形，另一種是彎孢形，端鈍或漸尖。本研究純化培養(yǎng)后所得到的BXYMD菌株分生孢子為直孢形，由于多個(gè)復(fù)合種，如膠胞炭疽復(fù)合種（C.gloeosporioides species complex）、暹羅炭疽復(fù)合種（C.siamense species complex）、博林炭疽復(fù)合種（C.boninense species complex）[6-8]都具有類似的孢子形態(tài)，因此依據(jù)分生孢子的形態(tài)只能將病原菌鑒定到屬。但有部分形態(tài)特殊的炭疽菌，如尾狀炭疽復(fù)合種（C.caudatum species complex），因其分生孢子為鐮刀形，且能在分生孢子頂端產(chǎn)生一絲狀附屬物而區(qū)別于其他的炭疽菌[14]，故能根據(jù)分生孢子形態(tài)鑒定到復(fù)合種。分生孢子的大小在種外和種間變化均較大，通常不作為分類的主要依據(jù)，但分生孢子的形態(tài)對某些特定種有重要的參考價(jià)值，比如C.gigasporum復(fù)合種的分生孢子長度明顯大于多數(shù)其他直孢形的炭疽菌，為從種水平上對該復(fù)合種進(jìn)行鑒定提供了有力的依據(jù)[15]。

炭疽菌萌發(fā)可形成分生孢子附著胞和菌絲附著胞，總體來說，菌絲附著胞體積比分生孢子附著胞大，但兩種附著胞的形態(tài)在種間和種內(nèi)變化都較大。不同種的炭疽菌可產(chǎn)生相同形態(tài)的附著胞，比如引起辣椒炭疽病的果生炭疽菌（C.fructicola）和平頭炭疽菌（C.truncatum）的分生孢子附著胞都呈卵形或橢圓形，邊緣較平滑，菌絲附著胞都有卵形，邊緣淺裂的類型[16]。同一個(gè)種的炭疽菌也可產(chǎn)生不同形態(tài)的附著胞，比如本研究中的BXYMD菌株形成的分生孢子附著胞和菌絲附著胞都有近球形、卵形、棒形，不規(guī)則形幾種形態(tài)，說明難以憑借附著胞的形態(tài)判斷其歸屬，需結(jié)合分子生物學(xué)特性進(jìn)一步確定。

基于形態(tài)特征結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定炭疽菌屬（Colletotrichum）已被大家接受，廣泛用于識(shí)別病原和解決分類上存在的問題[11-20]。ITS序列是最先被用于炭疽菌分類的DNA序列，同時(shí)也是應(yīng)用最為廣泛的序列[16]。盡管GenBank中ITS序列很豐富，但許多炭疽菌為復(fù)合種群，包含很多生物學(xué)上的獨(dú)立物種，ITS序列不能有效的區(qū)分炭疽菌復(fù)合種群的近緣種[5-8]。同時(shí)，GenBank中有些ITS序列的信息是錯(cuò)誤的，因此，僅采用ITS序列鑒定出的結(jié)果，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定不同的復(fù)合種需要用不同的基因，如尖孢復(fù)合種（C.acutatum species complex）常用 ITS、ACT、GAPDH、CHS-1、TUB2、組蛋白基因（histone3，HIS3）[5]；膠胞復(fù)合種（C.gloeosporioides speciescomplex）常用 ITS、ACT、GAPDH、CHS-1、TUB2、CAL、錳超氧化物歧化酶基因（manganese-superoxide dismutase，SOD2）、谷氨酰胺合成酶基因（glutamine synthetase，GS）和氨肽酶N2基因與交配型基因的間隔區(qū)（apn2-mat1-2-1 intergenic spacer，ApMat）基因[6]；博寧復(fù)合種（C.boninense species complex）常用 ITS、ACT、TUB2、CHS-1、GAPDH、HIS3 和 CAL 基因[7]。巴西野牡丹炭疽病的病原菌BXYMD經(jīng)ITS、ACT、GADPH、CHS-1、TUB2、CAL 序列聯(lián)合建樹，確定為狹義的膠胞炭疽菌（C.gloeosporioides sensu stricto），這是關(guān)于該病原引起巴西野牡丹炭疽病的首次報(bào)道。膠胞炭疽菌是一種寄主范圍很廣的病原菌[6]，初步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該病原在人工接種的條件下，可以侵染紅葉石楠，但其寄主范圍還有待進(jìn)一步研究，另一方面，炭疽病普遍存在一病多菌[11，17-18]的現(xiàn)象，引起巴西野牡丹炭疽病的病原是否還有其他種類還需擴(kuò)大采樣范圍進(jìn)一步確定。對四川成都巴西野牡丹葉斑病病原系統(tǒng)鑒定，病原的確定為該地區(qū)巴西野牡丹病害的診斷和防治提供理論依據(jù)。

［1］夏俊.新優(yōu)多花花灌木巴西野牡丹［J］.福建熱作科技，2014，39（4）：48-49.

［2］FARR D F，ROSSMAN A Y.Systematic mycology and microbiology laboratory［DB］.http：//nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/，2017.

［3］黃晉與.由Pythium helicoides引起之巴西野牡丹根腐?。跩］.Plant Pathology Bulletin，2009，18（1）：51-56.

［4］SHI Z R，XIANG M M，ZHANG Y X，et al.First report of leaf spot on Tibouchina semidecandra caused by Beltrania rhombica in China［J］.Plant Disease，2012，96（9）：1380-1380.

［5］DAMM U，CANNON P F，WOUDENBERG J H，et al.The Colletotrichum acutatum species complex［J］.Studies in Mycology，2012，73（1）：37-113.

［6］WEIR B S，JOHNSTON P R，DAMM U.The Colletotrichum gloeosporioides species complex［J］.Studies in Mycology，2012，73（1）：115-180.

［7］DAMM U，CANNON P F，WOUDENBERG J H，et al.The Colletotrichum boninense species complex［J］.Studies in Mycology，2012，73（1）：1-36.

［8］SHARMA G，PINNAKA A K，SHENOY B D.Resolving the Colletotrichum siamense species complex using ApMat marker［J］.Fungal Diversity，2015，71（1）：247-264.

［9］方中達(dá).植病研究方法［M］.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：102-104.

［10］龔國淑，徐琴，張敏，等.一種簡便的病原真菌單孢分離方法研究［J］.玉米科學(xué)，2010，18（1）：126-134.

［11］李沛利，李娟，龔國淑，等.四川省鵝掌柴炭疽病病原菌的初步鑒定［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2017，47（3）：296-304.

［12］YANG Y L，LIU Z Y，CAI L，et al.Colletotrichum anthracnose of Amaryllidaceae［J］.Fungal Diversity，2009，39（2）：123-146.

［13］CAI L，HYDE K D，TAYLOR P，et al.A polyphasic approach for studying Colletotrichum［J］.Fungal Diversity，2009，39（2）：183-204.

［14］CROUCH J A.Colletotrichum caudatum s.l.is a species complex［J］.Ima Fungus，2014，5（1）：17-30.

［15］LIU F，CAI L，CROUS P W，et al.The Colletotrichum gigasporum species complex［J］.Persoonia Molecular Phylogeny&Evolution of Fungi，2014，33（1）：83-97.

［16］CANNON P F，DAMM U，JOHNSTON P R，et al.Colletotrichumcurrent status and future directions［J］.Studies in Mycology，2012，73（1）：181-213.

［17］LIU F，TANG G，ZHENG X，et al.Molecular and phenotypic characterization of Colletotrichum species associated with anthracnose disease in peppers from Sichuan Province，China［J］.Scientific Reports，2016，6：32761.

［18］HAN Y， ZENG X， XIANG F， etal.Distributionand characteristics of Colletotrichum spp.associated with anthracnose of strawberry in Hubei，China［J］.Plant Disease，2015，100（5）：996-1006.

［19］CAICEDO J D，LALANGUI K P，POZO A N，et al.Multilocus molecular identification and phylogenetic analysis of Colletotrichum tamarilloi，as the causal agent of Tamarillo（Solanum betaceum）anthracnose in the Ecuadorian highlands［J］.European Journal of Plant Pathology，2017，148（4）：983-996.

［20］王薇，符丹丹，張榮，等.蘋果炭疽葉枯病病原學(xué)研究［J］.菌物學(xué)報(bào)，2015，34（1）：13-25.

Primary Identification of the Pathogen Causing Anthracnose of Tibouchina semidecandra in Chengdu,Sichuan

LIPei-li，GAOYuan，LIUDan，LIJuan，YANJI-ming*
（College of Agronomy&Key Laboratory for Major Crop Diseases&National Demonstration Center for Experimental Crop Science Education，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China）

【Objective】The aim of the study was to identify the pathogen causing anthracnose on Tibouchina semidecandra and to provide a theoretical reference for the diagnosis and treatment of disease.【Methods】Leavesexhibitedsymptomsof anthracnose were collected from Chengdu in Sichuan Province，tissue separation，single-spore purification and Koch's postulate were conducted.Through cultural characteristics，morphological characteristics of conidia and appressoria，the phylogenetic analysis of multi-locus sequences to confirmthepathogenicagents.【Results】Thepathogenwasidentifiedas Colletotrichumgloeosporioides sensu stricto.【Conclusion】To our knowledge，it was first to be reported that C.gloeosporioides sensu stricto causinganthracnoseonT.semidecandra.

Tibouchina semidecandra；anthracnose；morphology；multi-genes

S432.44

A

1000-2650（2017）04-0529-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.04.011

2017-08-22

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)雙支計(jì)劃（03572101）；四川農(nóng)業(yè)大學(xué)導(dǎo)師培育計(jì)劃（04051835）。

李沛利，碩士，實(shí)驗(yàn)師。*責(zé)任作者：嚴(yán)吉明，博士，教授，主要從事植物病理學(xué)和真菌學(xué)方面的相關(guān)研究，E-mail：jimingyan@126.com。

（本文審稿：姬廣海；責(zé)任編輯：鞏艷紅；英文編輯：徐振鋒）