聶忠莉，王 倩，胡一冰，王曉玲，葉 丁，張 勇，蕭茂玲，郭 瑞

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041)

馬西替坦片中有關(guān)物質(zhì)的HPLC測(cè)定

聶忠莉1，王 倩1，胡一冰1，王曉玲2，葉 丁2，張 勇2，蕭茂玲2，郭 瑞2

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司，四川 成都 610041)

為測(cè)定馬西替坦片中的有關(guān)物質(zhì)，利用高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調(diào)至pH值=3.0)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL.實(shí)驗(yàn)顯示，在各破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達(dá)到完全分離，雜質(zhì)MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6檢測(cè)限分別為0.019 ng、0.013 ng、0.072 ng、0.108 ng，峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，校正因子都為1.0.結(jié)果表明，本方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)，適用于馬西替坦片中有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定.

馬西替坦；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法

0 引 言

肺動(dòng)脈高壓，是一種以肺血管阻力升高最終導(dǎo)致右心衰竭的嚴(yán)重的癥候群[1].馬西替坦，為美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療肺動(dòng)脈高壓(PAH)的一類(lèi)內(nèi)皮素受體拮抗劑[2].內(nèi)皮素受體拮抗劑類(lèi)藥物能使肺動(dòng)脈松弛、降低肺部血壓[3].臨床實(shí)驗(yàn)證明，馬西替坦的耐藥性和安全性良好，藥物與藥物之間相互作用風(fēng)險(xiǎn)較小，可降低肺動(dòng)脈高壓(PAH)患者的發(fā)病率和死亡率，且主要是通過(guò)減緩疾病進(jìn)展發(fā)揮作用[4-5].馬西替坦片為馬西替坦的制劑，而制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下主要考慮的雜質(zhì)為原料在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中產(chǎn)生的降解雜質(zhì)，以及在制劑制備工藝過(guò)程與儲(chǔ)存及運(yùn)輸過(guò)程中產(chǎn)生的降解雜質(zhì).本研究擬采用高效液相方法，對(duì)本品的雜質(zhì)MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3和MAA6進(jìn)行分析，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，擬對(duì)制劑的質(zhì)量控制提供相應(yīng)的依據(jù).

1 試藥與儀器

1.1 試 藥

實(shí)驗(yàn)所用試藥包括：馬西替坦對(duì)照品(批號(hào)，130802)，雜質(zhì)MAA6-1對(duì)照品(批號(hào)，MAA6-1-20130601)，雜質(zhì)MAA6-2對(duì)照品(批號(hào)，MAA6-2-20130601)，雜質(zhì)MAA7-3對(duì)照品(批號(hào)，MAA7-3-20130701)，雜質(zhì)MAA6對(duì)照品(批號(hào)，A6-130726)，馬西替坦片(小試3批的批號(hào)：140101、140102、140103)，均由成都克萊蒙醫(yī)藥科技有限公司提供；馬西替坦片(中試3批批號(hào)，140201、140202、140203)，由峨眉山通惠制藥有限公司生產(chǎn)，馬西替坦片(批號(hào)，UM 010B0801)，由Actelion Pharmaceuticals，Ltd生產(chǎn)；乙腈(色譜純)、磷酸(分析純)、三乙胺(分析純)，由天津科密歐公司生產(chǎn).

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：5410/L-2455型高效液相色譜儀(Hitachi HITACHI)，BP 210D型電子天平(Sartorius)，pHS-3C型酸度計(jì)(上海佑科).

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

實(shí)驗(yàn)的色譜條件為：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調(diào)至pH值為3.0)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL.梯度洗脫程序見(jiàn)表1.

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

取本品適量，精密稱(chēng)定，加乙腈溶解并定量稀釋至每1 mL約含1.0 mg的溶液，超聲15 min，作為供試品溶液.

精密量取供試品溶液適量，加乙腈制成每1 mL中約含1 μg的溶液，作為對(duì)照溶液.

精密稱(chēng)取雜質(zhì)MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6和馬西替坦對(duì)照品適量，用乙腈溶解并稀釋制成每1 mL含各雜質(zhì)約1.0 μg、含馬西替坦約1.0 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液.

2.3 系統(tǒng)適用性

精密量取對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，MAA6-2、MAA6-1、MAA6、MAA7-3和馬西替坦分別依次出峰，各成分峰之間的分離度應(yīng)符合規(guī)定，理論塔板數(shù)按馬西替坦主峰計(jì)不得低于5 000.

精密量取對(duì)照溶液10 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成分色譜峰峰高約為滿(mǎn)量程的20%；再精密量取供試液、對(duì)照溶液和對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的2倍.

供試品溶液色譜圖中如有與對(duì)照品溶液峰保留時(shí)間一致的峰，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，不得過(guò)0.1%；其他雜質(zhì)峰的峰面積不得大于對(duì)照液主峰面積的0.1倍(0.1%)，總雜質(zhì)不得超過(guò)0.5%.

2.4 專(zhuān)屬性

精密稱(chēng)取馬西替坦樣品適量分別進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、高溫和光照破壞性實(shí)驗(yàn).取上述專(zhuān)屬性試驗(yàn)樣品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1和表2.

(a)未破壞樣品圖譜

(b)酸破壞樣品圖譜

(c)堿破壞樣品圖譜

(d)氧化破壞樣品圖譜

(e)高溫破壞樣品圖譜

(f)光照破壞試驗(yàn)圖譜

(g)雜質(zhì)對(duì)照品圖譜

圖1樣品實(shí)驗(yàn)圖譜

從圖1可知，各峰依次為雜質(zhì)MAA7-8、MAA6-2、MAA6-1、MAA7-6、起始物料C、中間體A6、MAA7-7、MAA7-2、MAA7-3、中間體A5、起始物料A4和馬西替坦。

表2 有關(guān)物質(zhì)專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由專(zhuān)屬性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在各破壞條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)與主峰，以及雜質(zhì)與雜質(zhì)之間分離度均在1.5以上，能達(dá)到完全分離，主峰峰純度均達(dá)到1.0000，雜質(zhì)峰峰純度均達(dá)0.99以上，峰的降解平衡在90%～102%之間.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法專(zhuān)屬性良好，能檢測(cè)出本品在儲(chǔ)藏和運(yùn)輸過(guò)程的極端條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物.

2.5 重復(fù)性

取馬西替坦自制片10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取細(xì)粉適量(相當(dāng)于馬西替坦10 mg)置10 mL量瓶中，加入雜質(zhì)貯備液(含雜質(zhì)約為0.1 mg/mL)各0.1 mL，加乙腈至接近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，同法制備6份樣品.

取上述供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各雜質(zhì)的含量，同一樣品連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次，各雜質(zhì)含量的RSD%均小于2.0%，表明方法的重復(fù)性良好.

2.6 穩(wěn)定性

取馬西替坦自制片10片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取細(xì)粉適量(相當(dāng)于馬西替坦10 mg)，置10 mL量瓶中，加入雜質(zhì)貯備液(含雜質(zhì)約為0.1 mg/mL)各0.1 mL，加乙腈至接近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液.

取上述供試品溶液分別于0、2、4、8、24 h分別測(cè)定，記錄圖譜，以各成分峰面積計(jì)算RSD.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在室溫下放置24 h，其峰面積和雜質(zhì)個(gè)數(shù)均無(wú)明顯變化，供試溶液室溫放置24 h穩(wěn)定.

2.7 檢測(cè)限與定量限

取馬西替坦及各已知雜質(zhì)適量，用乙腈溶解后，分別稀釋制成適宜濃度，分別精密吸取一定量注入液相色譜儀并檢測(cè)信號(hào)噪音比.檢測(cè)結(jié)果為：MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6檢測(cè)限分別為0.019 ng、0.013 ng、0.108 ng、0.072 ng，定量限分別為0.116 ng、0.052 ng、0.251 ng、0.162 ng.定量限樣重復(fù)6次，進(jìn)樣峰面積RSD分別為2.57%、4.21%、1.70%、3.64%.

2.8 線(xiàn) 性

精密稱(chēng)取馬西替坦及各雜質(zhì)適量，用乙腈逐級(jí)稀釋?zhuān)苽湎盗谢旌先芤?0.05 μg～1.5 μg/mL)并分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雜質(zhì)MAA6-1在濃度為0.05～1.5 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性方程式為，Y=143 655.59x+1 099.39，R2=0.9997，校正因子1.0；雜質(zhì)MAA6-2在濃度為0.05～1.6 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性方程式為，Y=146 467.46x-1 067.70，R2=0.9987，校正因子1.0；雜質(zhì)MAA7-3在濃度為0.06～1.9 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性方程式為，Y=159 007.60x-587.41，R2=0.9998，校正因子1.0.雜質(zhì)MAA6在濃度為0.05～1.5 μg/mL范圍內(nèi)，進(jìn)樣10 μL，峰面積與濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程式為，Y=138 620.14x+510.81，R2=0.9999，校正因子1.0.

2.9 回收率

1)雜質(zhì)對(duì)照溶液的制備.分別取馬西替坦各雜質(zhì)適量，精密稱(chēng)定，分別用乙腈配制成每1 mL約含0.1 mg的貯備溶液.

2)對(duì)照品溶液的制備.分別取雜質(zhì)貯備液各0.1 mL，置同一10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液.

3)供試品溶液的制備.取馬西替坦粉末適量(相當(dāng)于馬西替坦10 mg)，共10份，精密稱(chēng)定，分別置10 mL量瓶中，其中1～3號(hào)樣品分別加入雜質(zhì)貯備液0.05 mL(相當(dāng)于雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限度50%)，4～6號(hào)樣分別加入雜質(zhì)貯備液0.1 mL(相當(dāng)于雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限度100%)，7～9號(hào)樣品分別加入雜質(zhì)貯備液0.15 mL(相當(dāng)于雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)限度150%)，再分別加入乙腈至近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液.

按有關(guān)物質(zhì)檢查色譜條件分別精密吸取上述10 μL進(jìn)樣，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算各樣品中各雜質(zhì)的含量和回收率.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雜質(zhì)MAA6-1、MAA6-2、MAA7-3、MAA6的平均回收率分別為，102.68%、101.74%、105.47%、104.00%，RSD分別為，1.50%、1.18%、1.51%、1.07%.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各雜質(zhì)的回收率均在100%～110%之間，RSD均小于2.0%.表明本方法回收率良好，準(zhǔn)確度符合要求.

2.10 精確度

由不同專(zhuān)業(yè)人員在不同日期用不同儀器按重復(fù)性試驗(yàn)測(cè)定6份供試液有關(guān)物質(zhì)，記錄色譜圖，計(jì)算結(jié)果的RSD.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一批樣品在不同日期由不同專(zhuān)業(yè)人員在不同儀器上測(cè)得含量基本一致，RSD%小于2.0%.表明本方法精密度符合要求.

2.11 耐用性

取本品粉末適量，精密稱(chēng)定，置10ml量瓶中，加入雜質(zhì)對(duì)照品貯備液0.1 mL，加入乙腈至近刻度，超聲提取15 min，取出，放冷至室溫，用乙腈定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，制得供試品溶液.

在變動(dòng)色譜條件中的流動(dòng)相pH值、流速、柱溫及不同色譜柱條件下，分別精密量取供試品溶液10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察各雜峰之間、雜峰與主峰之間的分離情況及各雜質(zhì)含量的變化情況，結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 有關(guān)物質(zhì)耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3結(jié)果顯示，在測(cè)定條件出現(xiàn)小的變動(dòng)時(shí)，所測(cè)定的各雜質(zhì)含量變化不大，含量的RSD%均小于5.0%.表明本方法的耐用性良好.

2.12 樣品測(cè)定

按照上述色譜條件，采用高效液相色譜法對(duì)小試和中試各批樣品及對(duì)照藥品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4.

表4 小試、中試樣品及對(duì)照藥品檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果表明，在3批小試、3批中試樣品中均只檢驗(yàn)出了降解雜質(zhì)MAA7-3.

3 結(jié) 論

本研究參照《中國(guó)藥典》2015年版中藥品質(zhì)量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則，對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證.結(jié)果表明，方法學(xué)驗(yàn)證項(xiàng)目中各項(xiàng)均符合檢測(cè)要求.最終確定馬西替坦片中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)條件為：采用高效液相色譜法，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水(1 000 mL水，加入三乙胺1 mL，用磷酸調(diào)至pH值為3.0)為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm.柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便，高效快速，專(zhuān)屬性好，靈敏度高，分離效果好，適用于馬西替坦片中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè).

[1]中國(guó)醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)，《中華心血管病雜志》編輯委員會(huì).肺動(dòng)脈高壓篩查診斷與治療專(zhuān)家共識(shí)[J].中華心血管病雜志,2007，35(11):979-987.

[2]摘自《丁香園》.FDA批準(zhǔn)馬西替坦用于治療肺動(dòng)脈高血壓[J].上海醫(yī)藥,2013，34(21):61-62.

[3]潘曉菲，譚初兵，時(shí)麗麗，等.新型肺動(dòng)脈高壓治療藥物馬西替坦[J].中國(guó)新藥雜志,2014，23(1):3-5.

[4]金玉潔，肖桂芝，王文倩，等.新型內(nèi)皮素受體拮抗劑馬西替坦[J].現(xiàn)代藥物與臨床,2013，28(3):405-407.

[5]趙文麗.馬西替坦Ⅲ期臨床試驗(yàn)資料表明治療肺動(dòng)脈高壓有效[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2016，40(6):806-80?.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.

DeterminationofRelatedSubstancesinMacitentanbyHPLC

NIEZhongli1,WANGQian1,HUYibing1,WANGXiaoling2,YEDing2，ZHANGYong2，XIAOMaoling2，GUORui2

(1.School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China; 2.Chengdu Climb Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Chengdu 610041, China)

The paper establishes an HPLC method for the determination of the related substances in macitentan.The silane bonded silica is used as filler,with water(1 000 mL water,with three triethylamine 1ml being added,adjusted to pH 3.0 with phosphoric acid) as mobile phase A,acetonitrile as mobile phase B,Gradient elution.The detection wavelength is 220 nm.With the flow rate of the mobile phase being 1.0 mL/min and column temperature being 40 ℃,the sample volume is 10 μL.The results show that the separation degree between the main peak and impurity produced in different damaging conditions,as well as that between impurity and impurity is more than 1.5,which means that complete separation can be achieved.The detection limits of impurity MAA6-1，MAA6-2，MAA7-3 and MAA6 are 0.019,0.013,0.072,0.108 ng respectively.There is a good linear relationship between the peak area and the concentration.The correction factor is 1.0.It's concluded that the method mentioned in this paper is simple,accurate,specific enough and suitable for the determination of the related substances in macitentan.

macitentan;related substances;HPLC

TQ460.7+2；O657.7+2

A

1004-5422(2017)04-0342-05

2017-09-24.

聶忠莉(1966 — )，女，副主任藥師，從事藥物制劑與分析研究.