劉 暢， 閉水清， 張慶梅， 謝小薰， 肖紹文△，付 駿， 葛盈盈， 陳 芳， 羅 彬△， 李 靜

1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 530021 2廣西醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室，南寧 530021 3廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究重點實驗室，南寧 530021

癌-睪丸抗原OY-TES-1致敏的樹突狀細胞體外抗膠質瘤的免疫效應*

劉 暢1， 閉水清1， 張慶梅2，3， 謝小薰2，3， 肖紹文1△，付 駿2， 葛盈盈2，3， 陳 芳2，3， 羅 彬2，3△， 李 靜2

1廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，南寧 5300212廣西醫(yī)科大學組織學與胚胎學教研室，南寧 5300213廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究重點實驗室，南寧 530021

目的研究負載癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)OY-TES-1的樹突狀細胞(dendritic cell，DC)體外抗膠質瘤的細胞免疫效應。方法細胞因子聯(lián)合誘導HLA-A2+健康人外周血單核細胞為DC，采用OY-TES-1重組蛋白致敏DC，流式細胞術檢測成熟DC表型分子；進而使DC誘導同體T淋巴細胞產(chǎn)生細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，CCK8檢測T細胞增殖情況，ELISPOT檢測IFN-γ含量，乳酸脫氫酶釋放法檢測CTL對膠質瘤細胞U251和A172的殺傷作用。結果負載OY-TES-1的DC低表達CD14，而高表達CD1a、CD83和CD80表型分子，能明顯促進CD8+T細胞的增殖及其IFN-γ的分泌(P<0.05)；而OY-TES-1特異性CTL在效靶比為50∶1時對HLA-A2+和OY-TES-1+U251、HLA-A2-和OY-TES-1+A172均有明顯殺傷作用(均P<0.05)，但其對U251的殺傷作用更強。結論體外用OY-TES-1重組蛋白致敏的DC可誘導特異性抗膠質瘤免疫應答，提示OY-TES-1可能成為膠質瘤免疫治療的靶點。

樹突狀細胞； OY-TES-1； 膠質瘤； 免疫治療

膠質瘤(glioma)是一類常見的侵襲性和惡性程度非常高的神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，患者中位生存期通常不超過2年，預后不良。傳統(tǒng)治療仍然采用手術切除為主，術后輔以放療和化療，但由于腫瘤細胞的侵襲性生長、腦解剖部位的特殊性以及血腦屏障的存在等多種影響因素，膠質瘤的傳統(tǒng)治療效果并不令人滿意，因此急需探索新的治療方法。其中，腫瘤免疫治療由于具有創(chuàng)傷小、特異性強的特點而備受關注，并且，以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎的腫瘤免疫治療是近年來的研究熱點之一[1-3]。

DC是目前已知的功能最強的專職抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)。由于未成熟DC能攝取加工抗原，而成熟DC則能有效提呈可溶性抗原，同時激活靜息和幼稚的T細胞，因此能夠啟動T細胞介導的特異性抗腫瘤免疫反應。經(jīng)研究證實，利用腫瘤抗原、腫瘤細胞RNA和腫瘤細胞裂解物致敏DC，可在體內(nèi)外有效地誘導細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，從而激發(fā)機體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫效應[4]。在過去20年里，基于DC的抗腫瘤療法不斷發(fā)展，并且展現(xiàn)出了良好的臨床應用前景[5]。

癌-睪丸抗原(cancer-testis antigen，CTA)是一類具有免疫原性，高度腫瘤特異性的抗原，僅表達于腫瘤細胞和生殖細胞，而在除睪丸之外的正常組織基本不表達[6-10]，因此被認為是腫瘤免疫治療的理想靶點[11]。OY-TES-1屬CTA中一員[12]，在CT抗原數(shù)據(jù)庫中又稱CT23(http：//www.cta.lncc.br)。研究顯示，OY-TES-1在多種腫瘤組織中表達[13-16]，并在腫瘤患者體內(nèi)能夠引起體液免疫反應[13-14，17]。目前已研究鑒定出一個OY-TES-1的HLA-A24限制性表位，經(jīng)證實該表位能在體外引起細胞免疫反應[18]。同時，根據(jù)我們前期的研究顯示17.14%的膠質瘤患者血清中存在OY-TES-1抗體，而正常人體內(nèi)血清均為OY-TES-1抗體陰性[17]。由此可見，將OY-TES-1用于腫瘤免疫治療具有潛在的臨床應用價值。所以在此基礎上，本研究擬采用OY-TES-1重組蛋白致敏DC，然后使其誘導同體T細胞產(chǎn)生CTL，觀察CTL對膠質瘤細胞的特異性殺傷效應，為今后開發(fā)基于OY-TES-1的腫瘤疫苗提供初步的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP)及其與OY-TES-1重組蛋白(OY-MBP)由本課題組制備；膠質瘤細胞株U251(HLA-A2+)和A172(HLA-A2-)購自中科院上海細胞庫，按照常規(guī)方法進行培養(yǎng)；人淋巴細胞分離液(Ficoll)購于Sigma公司；細胞因子rhTL-4、rhTNF-α、rhGM-CSF購于Peprotech公司；rhIL-2購于山東泉港藥業(yè)有限公司；PE標記的小鼠抗人CD83、CD80、CD14、IgG2b和FITC標記的小鼠抗人CD1a、HLA-DR、IgG1、HLA-ABC抗體和HLA-A2抗體購于eBioscience公司；CD8+細胞磁珠分離試劑盒購于德國美天旎公司；IFN-γ ELISPOT試劑盒購于達科為公司；非放射性細胞毒檢測試劑盒購于Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DC的體外誘導培養(yǎng)、致敏、表型分析 取50 mL HLA-A2+健康人外周血，F(xiàn)icoll密度梯度離心法獲得外周血單個核細胞(PBMC)，將3×106/mL的PBMC加入6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2 h后，收集貼壁單核細胞，用含rhGM-CSF(100 ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)的RPMI 1640進行DC誘導培養(yǎng)，隔日半量換液，同時補充細胞因子，每天用倒置相差顯微鏡觀察細胞生長和形態(tài)變化。

調(diào)整DC細胞密度至1×106/mL，在培養(yǎng)的第6天加入成熟因子rhTNF-α(50 ng/mL)，同時補充含rhGM-CSF(100 ng/mL)和rhIL-4(50 ng/mL)的完全培養(yǎng)液RPMI 1640。在培養(yǎng)的第7天分別加入不同的蛋白100 μL(100 μg/mL)，分為以下3組：OY-TES-1重組蛋白組(OY/DC)、MBP組(MBP/DC)和不加任何蛋白的對照組(PBS/DC)。3組細胞在蛋白致敏24 h后全量換液，同時補充含rhTNF-α、rhGM-CSF和rhIL-4的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，以備后續(xù)實驗。

收集培養(yǎng)到第8天的致敏DC，調(diào)整細胞密度至1×106/mL，然后加入CD14、CD1a、CD80和CD83抗體20 μL，4℃避光孵育30～60 min后，采用流式細胞儀進行檢測。

1.2.2 效應T細胞的分離 收集同體PBMC培養(yǎng)2 h后的非貼壁細胞，調(diào)整細胞密度，采用磁珠陽選法分離CD8+T淋巴細胞。

1.2.3 混合淋巴細胞反應 收集致敏72 h后的DC(刺激細胞)，加入25 μL/mL絲裂霉素C培養(yǎng)30 min后，分別調(diào)整細胞密度為1×105/mL和1×104/mL，分別以DC∶T為1∶1和1∶10加入上述分離的CD8+T淋巴細胞(反應細胞)混合培養(yǎng)獲得CTL細胞，每組設3個復孔，終體積為200 μL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h；于培養(yǎng)結束前2 h加入CCK-8溶液(20 μL/孔)，測各孔吸光度值(A450nm)，計算刺激指數(shù)(stimulation index，SI)：SI=(實驗孔A值-本底A值)/(空白對照孔A值-本底A值)。

1.2.4 ELISPOT法檢測IFN-γ 將致敏DC和CD8+T淋巴細胞共培養(yǎng)，誘導后者為CTL，采用ELISPOT檢測培養(yǎng)液中CTL細胞IFN-γ的分泌量，按照試劑盒說明書進行，共分為6組：背景負對照組(培養(yǎng)液)、負對照組(T細胞)、正對照組(陽性刺激劑+T細胞)、DC組(PBS/DC+T細胞)、MBP/DC組(MBP/DC+T細胞)和OY/DC組(OY /DC+T細胞)。

1.2.5 CTL對膠質瘤細胞的殺傷作用 采用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法測定CTL對靶細胞的毒性。將CTL和靶細胞U251和A172細胞分別按12.5∶1、25∶1、50∶1的效靶比加入96孔板共孵育，4 h后加25 μL裂解液至靶細胞最大釋放孔，繼續(xù)孵育45 min，然后收集各組上清液至另一培養(yǎng)板，加入底物緩沖液，避光放置30 min后終止反應，酶標儀測其A490nm，并計算殺傷率。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，每組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，并用最小顯著差法進行組間的多重比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成熟DC表型分析

流式細胞儀檢測培養(yǎng)至第8天的成熟DC表型分子，結果顯示：CD14為0.65%、CD1a為76.83%、CD83為80.25%、CD80為79.02%(圖1)，表明經(jīng)細胞因子誘導后大部分單核細胞能轉變成DC，且呈成熟DC表型。

A：IgG1 0.11%；B：CD14 0.65%；C：CD1a 76.83%；D：IgG2b 1.53%；E：CD83 80.25%；F：CD80 79.02%圖1 流式細胞儀檢測DC表型分子Fig.1 Detection of DC phenotype by flow cytometry

2.2 混合淋巴細胞反應

用CCK-8法檢測DC誘導CD8+T的增殖能力，結果顯示：OY/DC組能明顯促進CD8+T細胞的增殖，與MBP/DC組和PBS/DC組相比差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；在不同的2種DC∶T體系中，1∶1的刺激效應更強(圖2)。

與OY/DC組比較，*P<0.05圖2 DC誘導同體T淋巴細胞增殖能力測定Fig.2 Proliferation of homologous T lymphocyte induced by DC

2.3 IFN-γ分泌量的檢測

為了進一步明確致敏DC誘導CD8+T細胞免疫反應能力，我們采用ELISPOT法檢測IFN-γ分泌水平，結果顯示：OY/DC組和正對照組能明顯上調(diào)CD8+T淋巴細胞分泌IFN-γ，與其他組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4 CTL對膠質瘤細胞的殺傷作用

LDH釋放法檢測CTL對靶細胞的殺傷作用。結果顯示：在各種效靶比中，OY-DC所誘導的CTL對靶細胞的殺傷效率均較其它對照組高，但僅效靶比為50∶1時差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且在該效靶比時，CTL對HLA-A2+和OY-TES-1+的U251細胞比HLA-A2-和OY-TES-1+的A172細胞具有更強的殺傷作用，此外，我們也觀察到兩組靶細胞均出現(xiàn)隨著效靶比的增高，CTL對其殺傷作用也隨之增強的趨勢(圖4)。

與正對照組比較，*P<0.05；與OY/DC組比較，#P<0.05圖3 ELISPOT法分析分泌IFN-γ的CD8+T細胞數(shù)量Fig.3 The number of CD8+ T cells secreting IFN-γ was analyzed by ELISPOT

與OY/DC-CTL+A172組比較，*P<0.05；與OY/DC-CTL+U251組比較，#P<0.05圖4 不同效應CTL對膠質瘤的特異性殺傷率Fig.4 Specific killing rate of different CTL in glioma

3 討論

DC是目前發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)功能最強，也是唯一能激活初始T淋巴細胞的專職APC[5]。DC來源于骨髓CD34陽性細胞，能高水平地表達與抗原遞呈有關的MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子以及多種共同刺激分子，能夠攝取和處理抗原，并遞呈給T細胞，因此DC能夠激活相應的CD4+T細胞和CD8+T細胞。雖然DC在人體內(nèi)分布廣泛，但含量稀少，占PBMC的1%以下，所以導致了體外或體內(nèi)研究其生物學特性具有一定困難，同時也限制了DC疫苗在臨床的廣泛應用。隨著對DC基本生物過程的不斷認識，如今已可以從外周血、骨髓、臍帶血等組織的單核細胞或造血干細胞CD34+中成功誘導分化為具有免疫功能的DC，其中從PBMC誘導培養(yǎng)DC的方法，由于取材容易已在臨床上推廣應用。本研究通過采用先由外周血將PBMC常規(guī)分離，經(jīng)反復貼壁后獲得粘附的單核細胞，再用rhGM-CSF、rhIL-4和rhTNF-α聯(lián)合誘導培養(yǎng)DC，并對培養(yǎng)的DC進行了鑒定。我們選擇了4個反映DC成熟狀況的細胞表面分子進行檢測，其中CD14是單核細胞特異性表達分子，培養(yǎng)至第8天時其表達已明顯減少；CD83和CD1a是DC相對成熟的表面分子，CD80是與DC抗原提呈功能密切相關的表面分子，這些細胞表面分子的表達在培養(yǎng)至第8天的DC中已明顯提高，證明DC已趨成熟。

致敏的DC具有活化T淋巴細胞的功能，為驗證DC這一功能，我們將經(jīng)蛋白致敏的DC與自體T淋巴細胞共同培養(yǎng)，分別檢測T淋巴細胞的增殖情況及其IFN-γ分泌量。結果顯示，經(jīng)OY-TES-1融合蛋白致敏后的DC能顯著促進T淋巴細胞的增殖，并使IFN-γ分泌量明顯增加。此外，由于DC受到抗原特異或非特異性的刺激后均會促進CD8+T淋巴細胞活化和細胞因子分泌的增加，考慮到本研究所用的OY-TES-1蛋白是一種包含了MBP的重組蛋白，因此我們設立了MBP致敏DC組作為對照組來排除MBP蛋白對DC的作用。結果顯示，雖然各種蛋白致敏DC后均能促進T淋巴細胞活化，但經(jīng)OY-TES-1重組蛋白致敏的DC能更有效刺激T淋巴細胞的增殖并增加CD8+T淋巴細胞IFN-γ的分泌量。而DC促進淋巴細胞分泌IFN-γ的機制，我們推測可能與IFN-γ反向調(diào)節(jié)促進DC成熟活化有關，進而又促進了T淋巴細胞的活化，可能形成了具有放大效應的反饋環(huán)路。CD8+T淋巴細胞經(jīng)DC刺激轉化而成的CTL是極其重要的腫瘤殺傷細胞，并且IFN-γ是CTL發(fā)揮殺傷腫瘤細胞作用的主要細胞因子。

CTL在腫瘤免疫治療中發(fā)揮十分重要的作用，其介導細胞毒效應的多為CD8+，其殺傷效應受MHC-Ⅰ類分子限制，通過釋放毒性顆粒及死亡受體途徑而介導靶細胞死亡。此外約10%的CTL為CD4+，其殺傷效應受MHC-Ⅱ類分子限制，主要通過分泌細胞因子以及激活巨噬細胞從而介導細胞免疫效應。鑒于我國大部分人群HLA抗原表型為HLA-A*02陽性，因此我們首先研究基于HLA-A*02的免疫治療策略。本研究從HLA-A2+外周血中由DC前體細胞誘導培養(yǎng)出DC，然后再采用OY-TES-1重組蛋白致敏該DC，并將致敏后的DC與自體T細胞共同孵育，誘導出OY-TES-1特異性CTL，使得這些CTL能夠特異性殺傷HLA-A2+并表達OY-TES-1的膠質瘤細胞。而對HLA-A2-的膠質瘤細胞，盡管其OY-TES-1蛋白表達較高，但CTL對其殺傷作用明顯減弱，這表明CTL的特異性殺傷作用具有MHC-Ⅰ類分子限制性。另外，本研究還提示了HLA-A2+的OY-TES-1特異性CTL對HLA-A2-的膠質瘤細胞株也有一定的殺傷作用，對于這一現(xiàn)象，我們推測可能有以下原因：①可能與MHC的兼并性有關；② HLA-A24單體型是許多種群中最為常見的等位基因之一，尤其在中國人群有較高的表達(33%)，本實驗中獻血者與膠質瘤細胞株可能也同時表達HLA-A24。

綜上所述，OY-TSE-1融合蛋白致敏DC而誘導的CTL對膠質瘤細胞株具有較強的殺傷作用，這為臨床上將該蛋白運用于膠質瘤的免疫治療提供了初步的實驗依據(jù)。本實驗也存在一些不足之處：如DC的活化和成熟狀態(tài)不穩(wěn)定，這將影響后續(xù)的實驗；未進行體內(nèi)實驗。針對這些問題，在我們接下來的實驗中可進一步優(yōu)化DC的培養(yǎng)，并進行動物體內(nèi)試驗，從而進一步探討負載OY-TES-1抗原的DC瘤苗對腫瘤的殺傷效應。

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ImmuneEffectagainstGliomaMediatedbyDendriticCellsPulsedwithCancer-testisAntigenOY-TES-1InVitro

Liu Chang1，Bi Shuiqing1，Zhang Qingmei2，3etal

1DepartmentofNeurosurgery，TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China2DepartmentofHistologyandEmbryology，3CentralLaboratory，SchoolofPre-ClinicalMedicine，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China

ObjectiveTo detect immune effect against glioma mediated by dendritic cells(DCs)pulsed with cancer-testis antigen(CTA)OY-TES-1invitro.MethodsCytokines induced HLA-A2+healthy human peripheral blood mononuclear cells into DCs，which were loaded by OY-TES-1 recombinant protein.Then flow cytometry was used to detect the phenotype molecules of mature DC.T cell proliferation was tested by CCK8，and IFN-γ level was assessed by ELISPOT assay.Lactate dehydrogenase release method was used for the killing effect of CTL on glioma cells U251 and A172.ResultsDCs loaded OY-TES-1 showed the low expression of CD14 and high expression of CD1a，CD83 and CD80，and could significantly promote the proliferation of CD8+T cells and the secretion of IFN-γ(P<0.05).OY-TES-1 specific CTL had significant killing effect on HLA-A2+and OY-TES-1+U251 and HLA-A2-and OY-TES-1+A172 at the target-target ratio of 50∶1(P<0.05)，but its killing effect was much stronger on U251 than on A172.ConclusionDCs loaded OY-TES-1 can induce specific anti-glioma immune response，suggesting that OY-TES-1 may be the target for glioma immunotherapy.

dendritic cell； OY-TES-1； glioma； immunotherapy

*國家自然科學基金資助項目(No.81360371，No.81360374，No.81460382，No.81560408)；廣西自然科學基金資助項目(No.2016 GXNSFAA380257，No.GXNSFBA380159)；廣西生物靶向診治研究重點實驗室開放課題(No.GXSWBX201505)；廣西區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究重點實驗室自主研究課題(GKE2015-ZZ02)

劉 暢，男，1989年生，碩士研究生，E-mail：249738984@qq.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：xsw57@yahoo.com(肖紹文)；1561148680@qq.com(羅彬)

R739.41

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.06.003

(2017-08-23 收稿)