席剛俊，李警保，史 俊，韓正敏，*

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程技術(shù)中心，江蘇 句容 211121；2. 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

白芨內(nèi)生真菌的多樣性

席剛俊1，李警保2，史 俊1，韓正敏2，*

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程技術(shù)中心，江蘇 句容 211121；2. 南京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江蘇 南京 210037)

為研究白芨內(nèi)生菌的多樣性，從新鮮白芨根中提取內(nèi)生真菌的DNA，構(gòu)建ITS rDNA文庫(kù)，進(jìn)行高通量測(cè)序和多項(xiàng)信息分析。結(jié)果顯示，白芨內(nèi)生真菌主要屬于擔(dān)子菌門(mén)(83.4%)和子囊菌門(mén)(14.3%)，另外2.3%無(wú)法鑒定；擔(dān)子菌門(mén)、子囊菌門(mén)、接合菌門(mén)的菌根優(yōu)勢(shì)度指數(shù)分別為0.834 1、0.142 6、0.000 3，無(wú)法鑒定的真菌菌根優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為0.022 9。綱、目的分類(lèi)水平上，傘菌綱蠟殼菌目占83.4%，盤(pán)菌綱盤(pán)菌目占11.4%，錘舌菌綱柔膜菌目占2.1%，無(wú)法鑒定的占2.3%?？品诸?lèi)水平上，內(nèi)生真菌主要屬于Serendipitacea(83.4%)和盤(pán)菌科(11.4%)。屬的分類(lèi)水平上，梨形孢屬(Piriformospora)占83.4%。Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson 4種曲線分析結(jié)果顯示，白芨菌根內(nèi)生真菌的多樣性呈均勻分布。

白芨；內(nèi)生真菌；高通量測(cè)序；分類(lèi)水平；多樣性

自然條件下，幾乎所有的蘭科植物都必須與菌根真菌形成共生關(guān)系才能完成正常的生長(zhǎng)發(fā)育[1-2]。1840年，Link首次證實(shí)了蘭科植物根部有內(nèi)生真菌，然后不斷有蘭科植物與菌根真菌共生關(guān)系的報(bào)道。形成蘭科菌根的真菌大部分屬于擔(dān)子菌(Basidiom-ycotina)，其無(wú)性態(tài)為絲核菌[3-4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蘭科菌根真菌還有少部分為子囊菌(Ascomycotina)和接合菌(Zygomycotina)[5]。Rasmussen[6]研究表明，子囊菌也是蘭科的主要菌根真菌，而且越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)了這一觀點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)在蘭科菌根真菌領(lǐng)域的應(yīng)用，子囊菌開(kāi)始受到廣泛關(guān)注[3]。

白芨[Bletillastriata(Thunb.)Reichb.f. P.E.]為蘭科(Orchidaceae)白芨屬(BletillaReichb.f)植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，因其收斂止血、消腫生肌的功效而廣泛應(yīng)用于臨床。內(nèi)生真菌多樣性的研究對(duì)深入了解白芨具有重要意義。目前，我國(guó)主要以組織塊培養(yǎng)法從蘭科植物根部分離內(nèi)生菌根真菌，這種方法無(wú)法從中分離出所有的內(nèi)生菌根真菌，分離得到的真菌也無(wú)法確定是否為蘭科的內(nèi)生菌根真菌。分子生物技術(shù)的應(yīng)用克服了傳統(tǒng)方法的限制，可以從基因水平上研究菌根真菌的多樣性，確定菌根真菌的群落特征。本試驗(yàn)以表面滅菌的白芨根為材料，提取菌根總DNA，采用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序，利用PEAR將成對(duì)的Reads進(jìn)行合并過(guò)濾，得到Clean Reads；根據(jù)Clean Reads對(duì)樣品進(jìn)行序列可操作分類(lèi)單元(Operational taxonomic units，OTU)、物種特異性和多樣性分析，以獲得白芨根中內(nèi)生真菌的多樣性信息，為進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)白芨的研究提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花三叉白芨新鮮根部，2015年9月采自江蘇句容。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白芨根組織處理及表面消毒

選擇新鮮健康的白芨根，用滅菌的去離子水沖洗干凈，然后分次浸入75%乙醇45 s，2%次氯酸鈉溶液浸泡消毒10 min。消毒完成后，用滅菌的去離子水沖洗5～6次以徹底去除次氯酸鈉；最后超聲波處理2次，每次2 min，以去除菌根表面殘留的微生物DNA。用滅菌的濾紙吸干根表面的殘留水滴，然后用滅菌的解剖刀將根段切成0.5 mm左右的組織段。

1.2.2 菌根總DNA的提取

采用改良的CTAB法提取白芨菌根總DNA。具體步驟如下：

1)取0.5 g白芨根部組織，液氮研磨，磨碎物加入離心管；2)向離心管中加入600 μL預(yù)冷的CTAB-free，冰浴10 min，12 000g離心5 min，取上清液；3)加入600 μL預(yù)熱的2% CTAB提取緩沖液，65 ℃水浴45 min；4)冷卻至室溫后加入等體積的飽和酚，13 000g離心15 min，取上清液；5)加入與上清液等體積的酚、氯仿和異戊醇的混和液(體積比為25∶24∶1)，13 000g離心15 min，取上清液；6)加入與上清液等體積的氯仿、異戊醇的混和液(體積比為24∶1)，13 000g離心15 min，取上清；7)重復(fù)步驟6一次；8)加入0.1倍體積的5 mol·L-1的醋酸鉀和1倍體積的預(yù)冷異丙醇，混勻后置-20 ℃ 30 min或過(guò)夜，13 000g離心10 min，棄上清；9)加入400 μL預(yù)冷的70%乙醇使沉淀懸浮，13 000g離心5 min后棄上清液，重復(fù)2～3次，風(fēng)干；10)加入25 μL的無(wú)菌高純水，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ITS rDNA文庫(kù)構(gòu)建

取10 ng DNA模板，對(duì)目的區(qū)域真菌基因組轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1區(qū)(Internal transcribed spacer 1，ITS1)進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)測(cè)序區(qū)域的不同，選擇對(duì)應(yīng)區(qū)域引物。BITS (5′-ACCTGCGGARG GATCA-3′)和B58S3 (5′- GAGATCCRTTGYTRAAAGTT-3′)[7]。使用TaKaRa的EXtaq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.4 庫(kù)檢和高通量測(cè)序

使用Qubit 2.0稀釋文庫(kù)至1 ng·μL-1，對(duì)文庫(kù)的insert size采用Agilent 2100進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，進(jìn)行Q-PCR(Bio-RAD CFX 96熒光定量PCR儀，Bio-RAD KIT iQ SYBR GRN)，對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。并對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用軟件QIIME對(duì)Read 1和Read 2(分別從5’和3’端2個(gè)方向測(cè)序所得到的序列片段[8])拼接后的序列進(jìn)行分析，包括OTUs的提取、聚類(lèi)分析、Alpha多樣性分析等[9-11]。

OTU分析：采用Usearch61算法和UNITE真菌ITS數(shù)據(jù)庫(kù)(http://unite.ut.ee/)對(duì)OTU進(jìn)行劃分，并對(duì)OTU代表序列的分類(lèi)信息進(jìn)行確定，在各個(gè)分類(lèi)水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，并在真菌屬的水平上計(jì)算真菌的相對(duì)豐度。

聚類(lèi)分析：對(duì)樣品的所有比對(duì)上參考數(shù)據(jù)庫(kù)的序列總數(shù)(Total aligned reads)進(jìn)行聚類(lèi)，默認(rèn)以97%的一致性(identity)將序列聚類(lèi)為OTUs。

Alpha多樣性分析：用QIIME軟件計(jì)算Shannon index、Chao1、Observed-species、Simpson指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根總DNA的提取結(jié)果

白芨菌根總DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，1、2、5白芨菌根總DNA條帶清晰完整，符合后期進(jìn)行菌根總DNA樣品基因建庫(kù)測(cè)序分析的要求。

2.2 序列長(zhǎng)度分析

所測(cè)得的序列中能夠成功合成的成對(duì)序列數(shù)(total assembled reads)為31 380個(gè)，長(zhǎng)度平均約256 bp，拼接后序列長(zhǎng)度分布如圖2所示。

2.3 OTUs分析

2.3.1 OTUs統(tǒng)計(jì)

本試驗(yàn)共獲得33 255條序列(拼接成功的序列總數(shù))，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)成功的序列總數(shù)為16 390，可分為32個(gè)OTUs(97%的序列相似性)。

M，DNA marker；1、2、3、4、5為白芨菌根總DNAM， DNA marker; 1， 2， 3， 4， 5， total DNA from Bletilla striata圖1 白芨菌根總DNA的電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis profile of total DNA from Bletilla striata

從表1可知，序列數(shù)最多的OTU登錄號(hào)是AF019636，序列數(shù)達(dá)到13 667，該菌株是Piriformosporaindica。其次是登錄號(hào)為FJ788739的UnculturedPezizaceae，序列數(shù)為1 858。序列數(shù)最少的有13個(gè)OTUs，它們序列數(shù)量均為2個(gè)。

2.3.2 OTUs豐度排秩分析

OTUs豐度排秩分析(Rank-Abundance)是依據(jù)每個(gè)OTU所含序列數(shù)的多少對(duì)OTUs進(jìn)行排序，白芨菌根樣本里OTUs所包含的序列數(shù)分布情況可以通過(guò)Rank-Abundance直觀地看出，OUTs按包含的序列數(shù)目排秩在20～32之間時(shí)，曲線趨于平穩(wěn)，表明OTUs分布均勻(圖3)。

圖2 ITS1序列長(zhǎng)度Fig.2 Sequence length for ITS1 (bp)2.3 OTUs分析

表1OTUs統(tǒng)計(jì)分布表

Table1Statistical distribution table of OTUs

OTUID分類(lèi)Classification序列數(shù)NumberofsequencesAF019636Piriformosporaindica13667FR734294Rhizoctoniasp．AG＿Fb2FJ478095Psathyrellaartemisiae2DQ235697Gloeotiniatemulenta348GQ153214Pezizomycotinasp112902AY748863Tubersp．2EF619742Unidentifiedsp．5EU750677Fusariumsp．0802371HM999902Pestalotiopsisclavispora26GU910884UnculturedXylariales4EU520606UnculturedAscomycota2HM162101UnculturedAscomycota2JN646040Fusariumsubglutinans2DQ068983Fusariumoxysporum2EU489956UnculturedAscomycota3FJ788738UnculturedPezizaceae9FJ788739UnculturedPezizaceae1858DQ420973Unculturedsoilfungus7JF945256Unculturedfungus208EU490138Unculturedzygomycete2GU569095Mucorsp．CBRF595EU003025Unculturedfungus4FJ439580Fungalsp．GMGC648FR863602Unculturedfungus2DQ420778Unculturedsoilfungus6FJ524314Unculturedendophyticfungus2GQ866223Unculturedfungus23AM260929Unculturedfungus11JN859419Ilyonectriamacrodidyma2HM030634Fungalsp．c879JQ723331Unculturedfungus2JN890532Unculturedfungus52

橫坐標(biāo)表示OUTs按包含的序列數(shù)目排秩，縱坐標(biāo)表示該OTU包含的序列數(shù)的相對(duì)豐度，曲線表示對(duì)應(yīng)樣本的OTUs分布情況X-axis indicated that the OUTs was ranked according to the number of sequences， and the longitudinal coordinate indicated the relative abundance of the sequence numbers contained in the OTU， and Y-axis indicates the OTUs distribution of the corresponding samples圖3 OTUs豐度排秩圖Fig.3 Rank-Abundance of OTUs

2.3.3 白芨內(nèi)生真菌餅圖分析

統(tǒng)計(jì)白芨菌根中的真菌，根據(jù)百分比作餅圖，從門(mén)、綱、目、科、屬不同分類(lèi)水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖4)。門(mén)分類(lèi)水平上，白芨內(nèi)生真菌主要分布在擔(dān)子菌門(mén)(83.4%)，其次是子囊菌門(mén)(14.3%)，還有2.3%是無(wú)法鑒定的。綱分類(lèi)水平上，內(nèi)生真菌主要分布于傘菌綱(83.4%)，其次是盤(pán)菌綱(11.4%)，錘舌菌綱(Leotiomycetes)2.1%，其他綱0.7%，無(wú)法鑒定到綱的占2.3%。目分類(lèi)水平上，內(nèi)生真菌分布于蠟殼菌目(83.4%)，盤(pán)菌目(11.4%)，柔膜菌目(2.1%)，其他目(0.7%)，無(wú)法鑒定到目的占2.3%?？品诸?lèi)水平上，內(nèi)生真菌主要分布于Serendipitaceae(83.4%)和盤(pán)菌科(11.4%)。從屬的分類(lèi)水平來(lái)看，內(nèi)生真菌主要為梨形孢屬(Piriformospora)(83.4%)。

2.3.4 白芨內(nèi)生真菌優(yōu)勢(shì)度指數(shù)分析

為更好地研究白芨菌根的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌，用公式di=Ni/Nt計(jì)算白芨菌根樣品中每個(gè)真菌的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)di；其中，Ni表示物種i在樣本中的個(gè)體數(shù)量，Nt則表示樣品中所有物種的個(gè)體數(shù)量的總和。優(yōu)勢(shì)度指數(shù)可以體現(xiàn)某個(gè)物種在白芨菌根樣品中所占的比例。經(jīng)計(jì)算，白芨菌根樣品在門(mén)水平下的優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為：擔(dān)子菌門(mén)(0.834 1)、子囊菌門(mén)(0.142 6)、接合菌門(mén)(0.000 3)、無(wú)法鑒定(0.022 9)。

2.4 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可以反映樣品內(nèi)菌群的多樣性，包括菌種數(shù)目的均勻度以及菌種的類(lèi)別豐富度。Alpha多樣性越高即真菌種類(lèi)越豐富，真菌數(shù)目越均勻則表示此群落越穩(wěn)定。本試驗(yàn)采用Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson 4種指數(shù)對(duì)菌根樣品中的內(nèi)生真菌多樣性進(jìn)行分析(圖5)。結(jié)果顯示，剛開(kāi)始的測(cè)序量遠(yuǎn)不足以覆蓋樣品時(shí)，4種指數(shù)曲線均出現(xiàn)直線上升，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，曲線斜率下降直至平穩(wěn)，說(shuō)明白芨菌根樣品測(cè)序合理，可以反映白芨菌根中內(nèi)生真菌的多樣性。

圖4 白芨內(nèi)生真菌餅圖分類(lèi)結(jié)果Fig.4 Classfication results of pie chart of endophytic fungi from Bletilla striata

圖5Shannon index、Chao1、Observed species和Simpson指數(shù)曲線

Fig.5Index curves of Shannon index， Chao1， Observed species and Simpson

3 結(jié)論與討論

自然條件下，由于培養(yǎng)條件等方面的影響，有85%～99.9%的微生物無(wú)法通過(guò)純培養(yǎng)獲得。因此，常規(guī)方法不能分離和鑒定生活在組織內(nèi)部的微生物，而且分離獲得的微生物也不一定是天然的優(yōu)勢(shì)菌群[12]。隨著第二代測(cè)序技術(shù)的日趨成熟，將Illumina高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于蘭科菌根中內(nèi)生真菌研究，可以克服組織塊分離培養(yǎng)工作量大，無(wú)法分離到菌根中不可人工培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，以及傳統(tǒng)分子生物學(xué)通量低等缺陷，從基因組水平解析內(nèi)生真菌的分布情況。

陳澤斌等[13]采用高通量測(cè)序技術(shù)研究了鐵皮石斛葉片內(nèi)生真菌的多樣性，獲得的有效序列數(shù)為41 361，OTU數(shù)為33，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌裸胞殼屬(Emericellasp.)的構(gòu)巢裸殼孢屬(Emericellanidulans)是鐵皮石斛葉片的優(yōu)勢(shì)種群。陶剛[14]研究了貴州5個(gè)采樣點(diǎn)的白芨根組織分離的內(nèi)生真菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離到的內(nèi)生真菌有26種屬于子囊菌(占24.3%)，21種屬于擔(dān)子菌(占75.07%)。本試驗(yàn)采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)研究白芨根部的內(nèi)生真菌，證實(shí)了白芨根中確實(shí)存在內(nèi)生真菌，內(nèi)生真菌分屬于32個(gè)OTUs。從門(mén)的分類(lèi)水平來(lái)看，白芨內(nèi)生真菌主要分布在擔(dān)子菌門(mén)(83.4%)和子囊菌門(mén)(14.3%)，這和陶剛[14]的結(jié)果一致。從屬的分類(lèi)水平來(lái)看，內(nèi)生真菌主要分布于梨形孢屬(Piriformosporasp.)(83.4%)。而袁寧[15]、陶剛[14]、陳曉芳等[16]、蘇子敬等[17]雖然也分離到了擔(dān)子菌門(mén)的內(nèi)生真菌，但未分離到梨形孢屬真菌，這可能與白芨的品種、采集地等因素有關(guān)[18]，生長(zhǎng)在不同地方的同種植物，可能有不同的內(nèi)生真菌[18]。從種的分類(lèi)水平來(lái)看，白芨內(nèi)生真菌主要屬于印度梨形孢(Piriformosporaindica)，因此，印度梨形孢為白芨根部的優(yōu)勢(shì)真菌，這也與席剛俊等[19]的鑒定結(jié)果一致。

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DiversityofendophyticfungiinBletillastriata

XI Gangjun1， LI Jingbao2， SHI Jun1， HAN Zhengmin2，*

(1.Bio-EngineeringCenter，JiangsuPolytechnicCollegeofAgricultureandForestry，Jurong211121，China; 2.CollegeofForestry，NanjingForestryUniversity，Nanjing210037，China)

To research the diversity of endophytic fungi inBletillastriata， DNA of endophytic fungi was extracted from the fresh root ofBletillastriata， and ITS rDNA library was constructed. Then， this library was analyzed by high-throughput Illumina sequencing technology and bioinformatics. The results showed that endophytic fungi ofBletillastriatawere mainly distributed in Basidiomycota (83.4%) and Ascomycota (14.3%)， the other 2.3% could’t be identified. Dominance index of endophytic fungi were Basidiomycota (0.834 1)， Ascomycota (0.142 6)， Zygomycota (0.000 3)， and unidentified (0.022 9). At Class and Order levels， the proportion of (Agaricomycetes) Sebacinales was 83.4%， (Discomycete) Pezizales was 11.4%， (Leotiomycetes) Helotiales was 2.1%， unidentified was 2.3%. At Family level，Serendipitaceawas 83.4% and Pezizaceae was 11.4%. At Genus level，Piriformosporawas 83.4%. Analysis of Shannon index， Chao1， Observed species and Simpson showed that diversity of endophytic fungi inBletillastriatawere uniformly distributed.

Bletillastriata; endophytic fungi; high-throughput sequencing; classification level; diversity

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2077-2083

http://www.zjnyxb.cn

席剛俊， 李警保， 史俊， 等. 白芨內(nèi)生真菌的多樣性[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2017， 29(12): 2077-2083.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.16

2017-08-21

江蘇省林業(yè)三新工程(LYSX[2015]02)；江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院內(nèi)項(xiàng)目(2017KJ31)

席剛俊(1981—)，男，湖北仙桃人，碩士，助理研究員，從事鐵皮石斛、白芨病害研究。E-mail: 2469250487@qq.com

*通信作者，韓正敏，E-mail: zmhan@njfu.edu.cn

S567.23+9

A

1004-1524(2017)12-2077-07

(責(zé)任編輯侯春曉)