黃書(shū)倫，鄭凱文，胡 洋，李章程，程方俊，2，*，宋振輝，2，周作勇，2，劉國(guó)林，林春發(fā)，林永潤(rùn)，張婷婷

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2. 重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

鴨源大腸桿菌 Ⅰ 型菌毛的鑒定及FimA、FimH基因特征分析

黃書(shū)倫1，鄭凱文1，胡 洋1，李章程1，程方俊1，2，*，宋振輝1，2，周作勇1，2，劉國(guó)林1，林春發(fā)1，林永潤(rùn)1，張婷婷1

(1.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2. 重慶市獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心，重慶 402460)

為了解川渝部分地區(qū)鴨源大腸埃希菌Ⅰ型菌毛產(chǎn)生情況及分子特征，采用MSHA/MRHA試驗(yàn)、PCR擴(kuò)增Ⅰ型菌毛基因(FimA、FimH)進(jìn)行菌毛類型鑒定；通過(guò)分析FimA氨基酸序列的親水性、抗原性、表面可及性來(lái)預(yù)測(cè)抗原位點(diǎn)。MSHA/MRHA試驗(yàn)結(jié)果顯示，MSHA檢測(cè)陽(yáng)性率為44.3%；PCR檢測(cè)FimA陽(yáng)性率為63.41%，F(xiàn)imH陽(yáng)性率為100%。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示：FimA氨基酸序列與比對(duì)株大腸埃希菌(ECOR61)相比，存在19個(gè)差異位點(diǎn)；FimH氨基酸序列與比對(duì)株(ECOR45)相比，僅少數(shù)菌株出現(xiàn)1～2個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，表明該片段高度保守。對(duì)FimA氨基酸序列進(jìn)行抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，多數(shù)菌株抗原表位共同區(qū)域分布在84～88、142～146、149～150位氨基酸之間，除上述位點(diǎn)外，部分菌株在101～105、130～134位氨基酸出現(xiàn)抗原表位。

大腸埃希菌；Ⅰ型菌毛；氨基酸；序列比對(duì)；抗原表位

禽大腸埃希菌病(avian colibacillosis)是由禽致病性大腸埃希菌(avian pathogenicEscherichiacoli，APEC)引起的禽類急性、全身性腸外感染的一系列疾病的總稱，臨床上以心包炎、肝周炎、氣囊炎、蜂窩織炎、敗血癥及輸卵管炎、腹膜炎等為主要特征[1]。APEC是危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原微生物之一，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也是重要的食源性人畜共患病原菌[2-3]。禽大腸埃希菌菌毛主要有Ⅰ型菌毛和P型菌毛2種，Ⅰ型菌毛作為一種重要的毒力因子，在大腸埃希菌感染過(guò)程中可介導(dǎo)細(xì)菌與多種細(xì)胞的D-甘露糖受體特異性結(jié)合，使細(xì)菌黏附于消化道黏膜表面從而引起感染，而P型菌毛僅在細(xì)菌進(jìn)一步致病過(guò)程中起作用[4]。致病性大腸埃希菌的菌毛具有良好的免疫原性[1]，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，可用于菌毛亞單位疫苗的制備。Ⅰ型菌毛由多個(gè)基因群編碼，其中FimA基因是Ⅰ型菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位基因，F(xiàn)imH基因可負(fù)責(zé)Ⅰ型菌毛甘露糖特性的表達(dá)和特殊黏附素受體的識(shí)別[5]。大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的檢測(cè)常用電子顯微鏡檢查、甘露糖敏感血凝試驗(yàn)及甘露糖抵制血凝試驗(yàn)(MSHA/MRHA)、玻板凝集反應(yīng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、核酸探針及PCR擴(kuò)增等方法。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)鴨源大腸埃希菌Ⅰ型菌毛FimH基因的報(bào)道較少，尚未見(jiàn)重慶地區(qū)鴨源大腸埃希菌菌毛相關(guān)研究報(bào)道。

為了解重慶、四川地區(qū)禽大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的產(chǎn)生情況及分子特征，本試驗(yàn)采用MSHA/MRHA及PCR擴(kuò)增，對(duì)2005—2015年收集的重慶、四川部分地區(qū)鴨源大腸埃希菌分離株進(jìn)行Ⅰ型菌毛鑒定，并通過(guò)FimA和FimH序列分析和FimA抗原位點(diǎn)預(yù)測(cè)，為鴨源大腸埃希菌的防控及亞單位疫苗的制備提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株及供試動(dòng)物

70株鴨源大腸埃希菌菌株由西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院鑒定保存。其中，2005—2015年從重慶多地區(qū)分離到42株，以YC N-n、RC N-n編號(hào)，四川地區(qū)分離到28株，以LC N-n編號(hào)；豚鼠購(gòu)自重慶市中藥研究院。

1.2 主要試劑

小劑量DNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生化有限公司；D-甘露糖、改良Minka培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、1%豚鼠紅細(xì)胞懸液等。

1.3 引物及參考序列

FimA和FimH基因分別參考文獻(xiàn)[6-7]設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物序列如下：FimA基因(預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)度315 bp)上游引物5’-AGTTAGGACAGGTTCGTACCGCAT-3’，下游引物5’-AAATAACGCGCCTGGAACGGAATG-3’；FimH基因(預(yù)擴(kuò)增長(zhǎng)度508 bp)上游引物5’-TGCAGAACGGATAAGCCGTGG-3’，下游引物5’-GCAGTCACCTGCCCTCCGGTA-3’。

1.4 MSHA/MRHA試驗(yàn)

將各菌株分別用改良Minka液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，同樣培養(yǎng)條件下連續(xù)傳代3次，即為菌毛化菌體。細(xì)菌懸液濃度控制為約109cfu·mL-1，甘露糖敏感血凝試驗(yàn)及甘露糖抵制血凝試驗(yàn)(MSHA/MRHA)按文獻(xiàn)[8]所述方法作適當(dāng)調(diào)整。每株細(xì)菌進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 FimA和FimH基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)MSHA/MRHA試驗(yàn)結(jié)果，選取41株菌株經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用基因組提取試劑盒提取其基因組，作為擴(kuò)增菌毛基因的模板。采用上述引物，分別對(duì)FimA和FimH基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：上、下游引物(20 pmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL，模板2.0 μL，2×PremixExTaq12.5 μL，總體積25 μL。FimA基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)PCR循環(huán)；72 ℃ 10 min。FimH基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

取PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察結(jié)果。對(duì)目的片段進(jìn)行回收與純化，送生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果利用NCBI的Blast在線翻譯成氨基酸序列后，采用軟件MEGA 5.0進(jìn)行比對(duì)，運(yùn)用DNA Star Protean程序預(yù)測(cè)FimA的抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSHA/MRHA試驗(yàn)結(jié)果

70株鴨源大腸埃希菌MSHA/MRHA試驗(yàn)結(jié)果顯示，有31株可以產(chǎn)生紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象且不能抵抗D-甘露糖的抑制作用，39株未出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，空白對(duì)照組無(wú)自凝現(xiàn)象，部分結(jié)果見(jiàn)圖1。表明31株菌毛化大腸埃希菌呈MSHA陽(yáng)性，陽(yáng)性率為44.3%，其中，重慶分離株陽(yáng)性率為45.2%，四川分離株陽(yáng)性率為42.9%。

2.2 FimA和FimH基因檢測(cè)結(jié)果

共檢測(cè)41株菌株，其中，26株菌株可擴(kuò)增出與FimA基因片段大小相符的條帶(約300 bp)，PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為63.41%，其中，重慶分離株陽(yáng)性率為64%，四川地區(qū)分離株陽(yáng)性率為62.5%；15株未擴(kuò)增出目的片段，部分結(jié)果見(jiàn)圖2。41株菌株均能擴(kuò)增出與FimH基因片段大小相符的條帶(約500 bp)，陽(yáng)性率為100%，部分結(jié)果見(jiàn)圖3。

1， RC2-2; 2， LC4-2; 3， LC4-1; 4， LC2-4; 5， LC3-6; 6， RC2-1; 7， RC1-2; 8， LC2-3; 9， LC1-5; 10， YC1-2; 11， YC1-1; M， DL 2 000 DNA Marker圖2 部分大腸埃希菌FimA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification results of FimA gene from some Escherichia coli strains

12， LC1-4; 13， LC3-5; 14， LC1-3; 15， LC4-2; 16， LC3-4; 17， LC3-3; 18， LC1-2; 19， LC1-1; 20， LC3-2; 21， LC3-1;M， DL 2 000 DNA Marker圖3 部分大腸埃希菌FimH基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of FimH gene from some Escherichia coli strains

2.3 FimA氨基酸序列比對(duì)

將26株鴨源大腸埃希菌和GenBank中的大腸埃希菌ECOR61(登錄號(hào)為KC405511.1)的FimA基因核苷酸序列在線翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，F(xiàn)imA基因編碼97個(gè)氨基酸(FimA 65-161)，與參考株相比，有19個(gè)氨基酸位點(diǎn)存在差異(表1)。

2.4 FimH氨基酸序列比對(duì)

將41株大腸埃希菌和GeneBank中的大腸埃希菌ECOR45(登錄號(hào)為FJ865819.1)的FimH核苷酸序列在線翻譯成氨基酸序列后進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，所擴(kuò)增條帶可編碼162個(gè)氨基酸(FimH 125-287)，其中，僅RC3-4菌株180位點(diǎn)(R→H)、11株菌株在228位點(diǎn)(A→V)出現(xiàn)差異。由此推斷，該FimH氨基酸片段高度保守。

2.5 FimA抗原位點(diǎn)

運(yùn)用DNA Star Protean程序預(yù)測(cè)FimA氨基酸序列抗原表位，結(jié)果顯示，多數(shù)菌株抗原表位區(qū)域主要分布在84～88、142～146、149～150位氨基酸(如LC1-1，圖4)。除上述位點(diǎn)外，部分菌株在101～105位(如RC1-2，圖5)、130～134(如RC1-3，圖6)位氨基酸出現(xiàn)抗原表位。

表12005—2015年重慶、四川部分鴨源大腸埃希菌FimA氨基酸位點(diǎn)比對(duì)

Table1Comparison of FimA amino acid mutation sites inEscherichiacolifrom some ducks in Chongqing and Sichuan from 2005 to 2015

菌株編號(hào)StrainsNo．氨基酸殘基位點(diǎn)Sitesofaminoacidresidue78879094100103104105106107121129132133135140142143144KC4055111NNSVAAGHTNNRAATTSSELC1?1--------------A----LC1?2--------------A----LC1?3--------------A----LC1?4--------------A----LC1?5--------------A----LC1?6--------------A----LC2?1-----------------EQLC2?2Y----V-------------LC2?3Y-------------A----LC2?4Y-------------A----RC1?1YTDI-GT-P-K---A--AQRC1?2-TDI-GT-P-K---A--AQRC1?3-ST--SA-PK--NE---AQRC1?4-ST--SA-PK--NE---AQRC1?5-ST--SA-PK--NE---AQRC2?1YD--TTN----K--AS-AQRC2?2-D--TTN----K--AS-AQRC2?3-D--TTN----K--AS-AQRC2?4-D--TTN----K--AS-AQRC2?5-D--TTN----K--AS-AQYC1?1-TT----R-D--N----AQYC1?2-TT----R-D--N----AQYC1?3-TT----R-D--N---MAQYC1?4-TT------D----A---KYC1?5-TT------D----A-I-KYC1?6-TT------D-K--A---Q

圖4 LC1-1株FimA蛋白親水性、抗原性、表面可及性Fig.4 Hydrophilicity plot， antigenic index， surface probability plot of FimA protein from LC1-1 strain

3 結(jié)論與討論

大腸埃希菌在侵襲機(jī)體過(guò)程中，Ⅰ型菌毛對(duì)機(jī)體呼吸道的黏附起著重要作用，可介導(dǎo)細(xì)菌與多種細(xì)胞的D-甘露糖受體特異性結(jié)合，使細(xì)菌定居于黏膜表面從而引起感染，且這種特異性黏附能被D-甘露糖所抑制[9-11]，因而可通過(guò)D-甘露糖敏感血凝特性(MSHA)試驗(yàn)對(duì)大腸埃希菌Ⅰ型菌毛進(jìn)行初步的鑒定。本研究Ⅰ型菌毛鑒定中，MSHA陽(yáng)性率為44.3%，四川地區(qū)報(bào)道185株鴨源致病性大腸埃希菌MSHA陽(yáng)性率為65.9%，45株雞源致病性大腸埃希菌MSHA陽(yáng)性率為80%[12-13]，表明不同地區(qū)、不同動(dòng)物源的大腸埃希菌Ⅰ型菌毛的表達(dá)情況存在差異。FimA基因檢測(cè)陽(yáng)性率為63.41%，F(xiàn)imH基因陽(yáng)性率為100%，兩者陽(yáng)性率均高于MSHA陽(yáng)性率，同國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道一致[12-14]，說(shuō)明傳統(tǒng)的MSHA/MRHA試驗(yàn)適用于檢測(cè)Ⅰ型菌毛的表達(dá)情況，即Ⅰ型菌毛表現(xiàn)型檢測(cè)，而FimA及FimH基因的PCR擴(kuò)增對(duì)Ⅰ型菌毛基因攜帶情況檢測(cè)更具優(yōu)越性，即基因型檢測(cè)。本試驗(yàn)中部分菌株檢測(cè)出Fim基因卻未表現(xiàn)MSHA陽(yáng)性，即Ⅰ型菌毛未表達(dá)，研究表明Fim基因在表達(dá)過(guò)程中受到基因以外諸多因素的調(diào)控，推測(cè)外界環(huán)境影響了Ⅰ型菌毛的表達(dá)[15]。MSHA/MRHA試驗(yàn)和PCR方法各有優(yōu)劣，在Ⅰ型菌毛鑒定過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況采取不同方法或多種方法結(jié)合的方式進(jìn)行。FimA和FimH基因檢測(cè)陽(yáng)性率的差異以及Ⅰ型菌毛表達(dá)的影響因素還有待進(jìn)一步研究。

圖5 RC1-2株FimA蛋白親水性、抗原性、表面可及性Fig.5 Hydrophilicity plot， antigenic index， surface probability plot of FimA protein from RC1-2 strain

圖6 RC1-3菌株FimA蛋白親水性、抗原性、表面可及性Fig.6 Hydrophilicity plot， antigenic index， surface probability plot of FimA protein from RC1-3 strain

試驗(yàn)株與參考株FimA共有19個(gè)氨基酸位點(diǎn)差異，說(shuō)明川渝地區(qū)鴨源大腸埃希菌Ⅰ型菌毛FimA在進(jìn)化過(guò)程中存在不同程度的變異，部分菌株差異較大，氨基酸位點(diǎn)的差異對(duì)Ⅰ型菌毛具體功能的影響還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，多數(shù)菌株抗原表位共同區(qū)域分布在84～88、142～146、149～150位氨基酸，少數(shù)菌株在101～105、130～134位，說(shuō)明川渝地區(qū)鴨源大腸埃希菌抗原表位存在變異。葉如俊等[16]報(bào)道，8株雞源致病性大腸埃希菌Ⅰ型菌毛蛋白在1～4、49～53、82～91、126～132、145～150位氨基酸有較高抗原性，本試驗(yàn)結(jié)果與此大致相同，說(shuō)明不同禽源大腸埃希菌一定程度上具有相同的抗原位點(diǎn)。致病性大腸埃希菌的Ⅰ型菌毛具有良好的免疫原性，雖然多數(shù)分離株具有相似的抗原位點(diǎn)，但在實(shí)際生產(chǎn)中，由于不同菌株Ⅰ型菌毛抗原位點(diǎn)的差異會(huì)影響亞單位疫苗的實(shí)際免疫效果。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)川渝部分菌株Ⅰ型菌毛的抗原表位存在差異，因此，在利用Ⅰ型菌毛制備亞單位疫苗時(shí)，應(yīng)充分考慮此因素，建議制備多價(jià)亞單位疫苗以增強(qiáng)臨床免疫效果。

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IdentificationoftypeⅠfimbriaeofEscherichiacoliisolatedfromducksandgeneticcharacteristicsoftheirFimAandFimHgenes

HUANG Shulun1， ZHENG Kaiwen1， HU Yang1， LI Zhangcheng1， CHENG Fangjun1，2，*， SONG Zhenhui1，2， ZHOU Zuoyong1，2， LIU Guolin1， LIN Chunfa1， LIN Yongrun1， ZHANG Tingting1

(1.CollegeofAnimalScience，SouthwestUniversity，Chongqing402460，China; 2.VeterinaryScienceEngineeringResearchCenterofChongqing，Chongqing402460，China)

To study the generation and molecular characteristics ofEscherichiacolitypeⅠfimbriae from ducks in parts of Sichuan-Chongqing region， the typeⅠfimbriae was identified by MSHA/MRHA test， and theirFimAandFimHgenes were identified by PCR amplification; The hydrophilicity， antigenicity， and surface probability of FimA amino acid sequences were analyzed by DNAStar to predict antigenic sites. The MSHA/MRHA test results showed that the positive rate of MSHA was 44.3%. PCR results indicated that the positive rate ofFimAandFimHwere 63.41% and 100%， respectively. Amino acid sequences of FimA and FimH were deduced and contrasted respectively with comparativeEscherichiacolistrain ECOR61 and ECOR45. Amino acid sequence alignment showed that there were 19 different positions in FimA amino acid sequences. However， there were 1-2 different positions in FimH amino acid sequences， it was believed that FimH amino acid sequences were highly conserved. The antigenic sites of FimA amino acid sequences were predicted. The results indicated that antigenic epitopes of most strains were distributed in 84-88， 142-146 and 149-150 amino acids. In addition， some other strains’ antigenic epitopes appeared at 101-105 and 130-134 amino acids.

Escherichiacoli; typeⅠfimbriae; amino acid; sequence alignment; antigenic epitope

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 1994-1999

http://www.zjnyxb.cn

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.06

2017-05-15

重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)(CSTC2015SHMSZX80020)；重慶市前沿與應(yīng)用基礎(chǔ)研究(cstc2016jcyA0235)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(XDJK2017D083)

黃書(shū)倫(1994—)，男，福建南安人，動(dòng)物醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生。E-mail: 572974812@qq.com

*通信作者，程方俊，E-mail: cfj-xn@163.com

S855.3

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1004-1524(2017)12-1994-06

(責(zé)任編輯侯春曉)