趙天惠，張佰清*

耐受性枯草芽孢桿菌的脈沖強(qiáng)光誘變篩選及產(chǎn)酶活力分析

趙天惠，張佰清*

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

采用脈沖強(qiáng)光對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變處理，通過耐受性測(cè)試，在抗性菌株中篩選出優(yōu)良耐受菌株，并與原始菌株對(duì)比分析產(chǎn)酶活力及遺傳穩(wěn)定性，以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳比較分析菌體蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。結(jié)果表明，在脈沖電壓2 450 V，照射距離5 cm，脈沖40 次條件下，篩選出8 株抗性菌株；經(jīng)初篩和復(fù)篩得到兼具高溫耐受、強(qiáng)酸耐受和高濃度膽鹽耐受性變異菌株B3和B7，產(chǎn)α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力分別比原始菌株提高了67%和77%（P＜0.01）、56%和71%（P＜0.01）、34%和42%（P＜0.05），變異菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性較高（P＞0.05），可遺傳變異；誘變前后菌體蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異；結(jié)果證明脈沖強(qiáng)光用于枯草芽孢桿菌的誘變具有可行性。

耐受性；枯草芽孢桿菌；脈沖強(qiáng)光；誘變篩選；產(chǎn)酶活力

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是工業(yè)生產(chǎn)中重要的食品級(jí)益生菌，在發(fā)酵食品方面具有悠久歷史[1-2]。人工誘變篩選出的優(yōu)良枯草芽孢桿菌可以在加工貯藏中更好地耐受不良環(huán)境影響仍保持高活性，而且其發(fā)酵產(chǎn)酶水平高，因此誘變篩選優(yōu)良菌株已然成為研究熱點(diǎn)。常見的誘變方法（如化學(xué)誘變和紫外誘變等）對(duì)菌株的篩選均存在一定缺陷[3-5]，因此，探索新型物理方法應(yīng)用于枯草芽孢桿菌誘變育種已成為當(dāng)前生產(chǎn)中急待解決的問題。近年來(lái)，國(guó)外Cregenzán-Alberti等[6]利用高溫脈沖電場(chǎng)誘變處理枯草芽孢桿菌內(nèi)生孢子，得到的突變株在123 ℃條件下更具耐熱性；Ma Yingfang等[7]利用常壓室溫等離子體誘變篩選高產(chǎn)重組蛋白枯草芽孢桿菌突變株，獲得的突變株WB600 mut-12#重組α-淀粉酶活力較野生菌株提高了35%。

脈沖強(qiáng)光誘變裝置利用瞬間放電以脈沖的形式激發(fā)燈管中的惰性氣體，發(fā)出與太陽(yáng)光譜相近、強(qiáng)烈的閃光[8]，進(jìn)行誘變微生物。經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理過的菌體核酸結(jié)構(gòu)受到影響，而細(xì)胞中的DNA修復(fù)機(jī)制不發(fā)生作用，因此該方法可以誘導(dǎo)微生物發(fā)生變異[9-10]。目前，國(guó)內(nèi)張佰清[11]、趙春燕等[12]利用脈沖強(qiáng)光對(duì)啤酒酵母、乳酸乳球菌進(jìn)行誘變處理，使菌株發(fā)酵性能有所提高。國(guó)外有人研究發(fā)現(xiàn)，脈沖強(qiáng)光會(huì)改變菌體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而引起細(xì)胞變異[13-14]，并且證明，脈沖強(qiáng)光誘變微生物具有處理時(shí)間短、污染小、操作容易控制等優(yōu)點(diǎn)，具有可行性。

本研究利用脈沖強(qiáng)光誘變篩選出具有良好耐高溫、耐強(qiáng)酸、耐膽鹽性的枯草芽孢桿菌株B3和B7，其產(chǎn)酶能力也高于原始菌株，該優(yōu)良性狀能夠穩(wěn)定遺傳，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析得出誘變前后菌體蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異，證明了脈沖強(qiáng)光對(duì)枯草芽孢桿菌的誘變具有可行性，為工業(yè)微生物誘變育種開辟了新的途徑，對(duì)促進(jìn)酶制劑工業(yè)的發(fā)展具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌（B. subtilis）由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

脈沖強(qiáng)光裝置（脈沖寬度為2 0 μ s，波長(zhǎng)為200～1 100 nm，輸出最大電壓為5 000 V，輸入最大能量為644 J）由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院自行設(shè)計(jì)。HZQ-F160A恒溫振蕩器、PHS-3C型酸度計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；電熱手提式高壓蒸汽消毒鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；紫外-可見分光光度計(jì) 上海尤尼科儀器有限公司；3K15型離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；DYY-28A型垂直板電泳槽、DYY-8C型電泳儀電源 北京六一生物科技有限公司；Spectrophotometer1510酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、淀粉平板培養(yǎng)基、酪蛋白平板培養(yǎng)基參照郝林[15]的方法配制。三丁酸甘油脂平板培養(yǎng)基參照郭威[16]的方法配制。

發(fā)酵培養(yǎng)基：α-淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：可溶性淀粉12 g、蛋白胨8 g、牛肉膏2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、pH 7.2；蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：可溶性淀粉5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、KH2PO40.3 g、NaCl 1 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、pH 7.2；脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨20 g、葡萄糖5 g、(NH4)2SO41 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41 g、橄欖油1.0 mL、pH 7.2。

1.3.2 菌株活化和菌懸液的制備

將枯草芽孢桿菌接種到固體斜面培養(yǎng)基上，放入恒溫箱中于32 ℃培養(yǎng)24 h，即得到活化菌株。取活化好的菌株2環(huán)接種于裝有牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（30 mL/250 mL三角瓶）中，32 ℃ 150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)12 h，形成種子液。取2 mL種子液轉(zhuǎn)接到另一個(gè)液體培養(yǎng)基（10 mL/100 mL三角瓶）中，相同條件下，培養(yǎng)6 h后形成處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)液，配成濃度為106個(gè)/mL的菌懸液，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.3 脈沖強(qiáng)光處理方法與誘變參數(shù)的確定

在無(wú)菌環(huán)境下，將放置在培養(yǎng)皿中的菌懸液放入脈沖裝置處理室，使培養(yǎng)皿與氙燈垂直，進(jìn)行脈沖強(qiáng)光處理。在預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)定脈沖電壓為2 450 V，照射距離為5 cm，脈沖次數(shù)分別為8、14、21、27、34、40 次和47 次。分別取出經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理后的菌懸液稀釋至10-3個(gè)/mL，取0.1 mL涂布于固體平板培養(yǎng)基上，未處理的稀釋菌懸液為對(duì)照，32 ℃暗處倒置培養(yǎng)36 h，利用平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌落總數(shù)，計(jì)算不同處理?xiàng)l件下菌株的致死率，見公式（1）：

1.3.4 菌株的抗性篩選

通常認(rèn)為脈沖強(qiáng)光誘變時(shí)，菌株致死率達(dá)到90%以上，菌株具有抗性，最容易發(fā)生變異[11,17]。從脈沖強(qiáng)光處理后第1～5代致死率均達(dá)到90%以上的菌株中挑選菌落呈圓形或橢圓形，呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皺，中央突起的抗性菌株8 株，接種至固體斜面培養(yǎng)基上備用。

1.3.5 菌株初篩

將供初篩的抗性菌株活化24 h后，分別對(duì)其進(jìn)行耐受性測(cè)試[18-19]，以菌株耐受效果作為初篩標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.6 菌株復(fù)篩

將初篩得到的菌株活化24 h后配制成菌懸液，吸取0.1 mL菌懸液，分別均勻涂布于淀粉平板培養(yǎng)基、酪蛋白平板培養(yǎng)基上，32 ℃倒置培養(yǎng)48 h，測(cè)量單菌落周圍形成透明水解圈直徑與菌落直徑的比值，與原始菌株相比，比值增加10%以上的菌株初步認(rèn)為其發(fā)生了正突變，挑取至斜面保存[20]。產(chǎn)α-淀粉酶菌株的篩選方法參照游玟娟[21]的方法；產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選方法參照Philip[22]的方法；產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選方法參照郭威[16]的方法，分別測(cè)量直徑比值A(chǔ)/a、P/p與Z/z。1.3.7 酶活力測(cè)定

1.3.7.1 粗酶液的制備

將復(fù)篩得到的菌株制成培養(yǎng)液，按照5%接種量分別接入50 mL液體α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于32 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，棄菌體沉淀取上清液，于4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.7.2 發(fā)酵產(chǎn)α-淀粉酶活力的測(cè)定

參照Yoo[23]改良法：在可溶性淀粉溶液中加入粗酶液（稀釋10倍），55 ℃保溫反應(yīng)10 min，冷卻后加入稀硫酸終止反應(yīng)，加入稀碘液，顯色20 min，660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蒸餾水作空白，以煮沸失活的粗酶液為對(duì)照。酶活力單位定義為1 mL酶液在55 ℃、pH 6.0條件下，10 min內(nèi)水解1 mg可溶性淀粉所需的酶量為一個(gè)酶活單位，以U/mL表示。酶活力根據(jù)公式（2）計(jì)算：

式中：E0、E分別為對(duì)照和反應(yīng)液的吸光度；100為系數(shù)；稀釋倍數(shù)為10。

1.3.7.3 發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶活力的測(cè)定

L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制質(zhì)量濃度分別為0、20、40、60、80、100 μg/mL的L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，用分光光度計(jì)分別測(cè)定其吸光度OD680nm。以吸光度為縱坐標(biāo)，L-酪氨酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蛋白酶活力的測(cè)定方法：采用福林-酚法[24]。在酪蛋白溶液中加入粗酶液（稀釋10倍），40 ℃保溫反應(yīng)10 min，加入三氯乙酸溶液，離心，取上清液，加入碳酸鈉溶液和福林-酚試劑使用液，顯色20 min，測(cè)定OD680nm值。測(cè)定空白對(duì)照時(shí)，先加三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶液。酶活力單位定義為1 mL酶液在40 ℃、pH 7.5條件下，1 min內(nèi)水解干酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位，以U/mL表示。酶活力根據(jù)公式（3）計(jì)算：

式中：A為樣品OD值（查標(biāo)準(zhǔn)曲線可得相對(duì)應(yīng)的酪氨酸質(zhì)量/μg）；4為反應(yīng)試劑總體積/mL；10為反應(yīng)時(shí)間/min；N為粗酶液的稀釋倍數(shù)。

1.3.7.4 發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶活力的測(cè)定

采用橄欖油乳化法[25]。向底物溶液和磷酸緩沖液中加入待測(cè)粗酶液，40 ℃恒溫反應(yīng)15 min，加入乙醇終止反應(yīng)，加入酚酞指示劑，加入NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴定至出現(xiàn)微紅色并保持30 s不褪色。測(cè)定空白對(duì)照時(shí)，先加乙醇溶液，后加待測(cè)粗酶液。酶活力單位定義為1 mL酶液于40 ℃，pH 7.5的條件下，每分鐘水解脂肪產(chǎn)生1 μmol脂肪酸所需的酶量為一個(gè)酶活單位，以U/mL表示。酶活力根據(jù)公式（4）計(jì)算：

式中：V為樣品消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL；V0為空白消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度/（mol/L）；N為粗酶液的稀釋倍數(shù)，取值為10；t為反應(yīng)時(shí)間15 min。

1.3.8 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶穩(wěn)定性的分析

變異菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將其接種到斜面上連續(xù)傳代培養(yǎng)5 代，每代均接種到3 種酶的發(fā)酵培養(yǎng)基上進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各代的α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶活力。

1.3.9 菌株SDS-PAGE分析

參照石坡[26]的方法制備電泳蛋白樣品；采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定菌體蛋白濃度，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定吸光度以計(jì)算蛋白濃度；配制電泳溶液和緩沖溶液，進(jìn)行SDS-PAGE，在考馬斯亮藍(lán)染色的凝膠中觀察分離的蛋白條帶。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS Version 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以 ±s表示（n=3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘變參數(shù)的確定結(jié)果

菌株在脈沖電壓為2 450 V，照射距離為5 cm，脈沖次數(shù)分別為0、8、14、21、27、34、40 次和47次的處理后，菌株致死效果如圖1所示。

圖1 脈沖次數(shù)對(duì)菌株致死效果的影響Fig. 1 Effect of pulse number on mortality

由圖1可知，菌株的致死率隨脈沖次數(shù)增加而增大。當(dāng)脈沖21 次時(shí)，致死率為76.4%；當(dāng)脈沖40 次時(shí)，致死率達(dá)到92.5%；當(dāng)脈沖次數(shù)大于47 次時(shí)，菌株幾乎全部死亡。因此，選取菌株致死率高于90%并保證有一定數(shù)量存活菌株的誘變參數(shù)，此時(shí)菌株具有抗性，最容易發(fā)生變異，即選擇脈沖電壓2 450 V，照射距離5 cm，脈沖40 次，誘變效果良好。

2.2 抗性篩選結(jié)果

表1 枯草芽孢桿菌對(duì)脈沖強(qiáng)光的抗性篩選結(jié)果Table 1 Resistance of Bacillus subtilis to pulsed light

根據(jù)上述誘變參數(shù)處理菌株，選取存活菌種進(jìn)行斜面培養(yǎng)基試管培養(yǎng)，反復(fù)處理至第5代，該菌株第1代到第5代的致死率均在90%以上，差異不顯著（P＞0.05），表現(xiàn)出一定的抗性。因此，從第5代存活的菌種進(jìn)行篩選，得到編號(hào)分別為B1～B8的8 株菌株，并接種到斜面培養(yǎng)基試管中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 初篩結(jié)果

2.3.1 高溫耐受性菌株篩選

枯草芽孢桿菌屬于益生菌，通常被制成微生物飼料添加劑，飼料加工過程中的高溫處理對(duì)菌種的存活率有影響，從而制約了動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的吸收利用。分別將原始菌株B0和B1～B8抗性菌株經(jīng)60、70、80、90 ℃水浴處理10 min，菌株存活率在80%以上作為篩選指標(biāo)。

圖2 溫度對(duì)菌株存活率的影響Fig. 2 Effect of temperature on survival rate of the original and mutant strains

由圖2可知，抗性菌株B1、B3、B4、B5、B7、B8的存活率均高于原始菌株B0，大部分均在80%以上；B2、B6的耐高溫能力較差，當(dāng)溫度達(dá)到90 ℃時(shí)，菌株存活率未達(dá)到80%，與原始菌株B0差異不顯著（P＞0.05）。因此，從8 株抗性菌株中篩選出B1、B3、B4、B5、B7、B8六株耐高溫性的菌株進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 強(qiáng)酸耐受性菌株篩選

益生菌進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)須經(jīng)過胃酸環(huán)境才能到達(dá)腸道發(fā)揮作用，因此益生菌必須具有良好的耐酸能力。分別對(duì)原始菌株B0和B1、B3、B4、B5、B7、B8抗性菌株在pH 2、pH 3和pH 4的人工胃液中37 ℃作用3 h，以存活率不低于60%作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 人工胃液對(duì)菌株存活率的影響Fig. 3 Survival rate of the original and mutant strains in different artif i cial gastric juices

由圖3可知，抗性菌株B1、B3、B4和B7在3 個(gè)pH值梯度的人工胃液中的存活率均高于原始菌株B0，都高于60%；B5、B8在pH 2環(huán)境中存活率低于60%，且B8存活率顯著低于B0（P＜0.05）。因此，篩選得到B1、B3、B4和B7這4 株菌株繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 膽鹽耐受性菌株的篩選

十二指腸中的膽汁酸鹽對(duì)益生菌具有抑制作用，菌體只有具備較高的膽鹽耐受性，才能保持足夠的活菌數(shù)，從而發(fā)揮益生作用。分別對(duì)原始菌株B0和B1、B3、B4、B7四株抗性菌株在膽鹽質(zhì)量濃度為0.1、0.2 g/100 mL和0.3 g/100 mL中處理180 min，篩選指標(biāo)設(shè)定為存活率超過70%。

圖4 膽鹽對(duì)菌株存活率的影響Fig. 4 Effect of bile salt concentration on survival rate

由圖4可知，抗性菌株B3、B4和B7在不同膽鹽質(zhì)量濃度中的存活率均高于原始菌株B0，且都不低于70%；菌株B1在膽鹽質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL和0.2 g/100 mL時(shí)存活率較高，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 g/100 mL時(shí)，其耐受性較差，存活率不足70%，顯著低于原始菌株B0（P＜0.05）。因此，只有B3、B4和B7三株菌株符合耐膽鹽性的標(biāo)準(zhǔn)。

由以上結(jié)果可知，脈沖強(qiáng)光可以篩選出具有耐高溫性、耐強(qiáng)酸性和耐膽鹽性的優(yōu)越抗性菌株B3、B4和B7，將這3 株菌株接種斜面培養(yǎng)基保存，用于復(fù)篩。

2.4 復(fù)篩結(jié)果

表2 產(chǎn)α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶菌株篩選結(jié)果Table 2 α-Amylase, protease and lipase activity of selected mutants

由表2可知，與原始菌株相比，經(jīng)脈沖強(qiáng)光誘變的菌株產(chǎn)α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶3 種酶周圍形成透明水解圈直徑與菌落直徑的比值（A/a值、P/p值和Z/z值）更大，菌株B4的比值（A/a值、P/p值和Z/z值）比原始菌株增加量小于10%，只有菌株B3和B7的比值增加量遠(yuǎn)超過10%，差異顯著（P＜0.05），因此篩選出發(fā)生正突變的菌株B3和B7，其產(chǎn)酶能力有較大提高。

2.5 酶活力測(cè)定結(jié)果及產(chǎn)酶遺傳穩(wěn)定性分析

2.5.1 α-淀粉酶活力測(cè)定結(jié)果及菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性分析

表3 菌株產(chǎn)α-淀粉酶活力的測(cè)定結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性Table 3 Genetic stability of mutants B3 and B7 for α-amylase production

由表3可知，變異菌株B3和B7的α-淀粉酶活分別為（114.06±0.43）U/mL和（120.89±0.32） U/mL，是原始菌株B0酶活（68.3±0.14）U/mL的1.67倍和1.77倍，差異極顯著（P＜0.01）。將變異菌株B3、B7分別傳代培養(yǎng)5 次，酶活變化幅度很小，差異不顯著（P＞0.05），說明變異菌株產(chǎn)酶能力穩(wěn)定。

2.5.2 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=0.010x＋0.002 5，R2=0.998 8，說明此方法在L-酪氨酸質(zhì)量濃度為0～100 μg/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系。

2.5.3 蛋白酶活力測(cè)定結(jié)果及菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性分析

表4 菌株產(chǎn)蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性Table 4 Genetic stability of mutants B3 and B7 for protease production

由表4可知，變異菌株B3和B7的蛋白酶活分別為（88.3±0.35）U/mL和（96.79±0.26）U/mL，比原始菌株B0酶活（56.6±0.21）U/mL提高了56%和71%，差異極顯著（P＜0.01），經(jīng)傳代培養(yǎng)5 次，B3和B7的酶活力趨于穩(wěn)定，差異不顯著（P＞0.05），因此，脈沖強(qiáng)光誘變處理得到的變異菌株產(chǎn)蛋白酶能力可良好穩(wěn)定遺傳。

2.5.4 脂肪酶活力測(cè)定結(jié)果及菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性分析

表5 菌株產(chǎn)脂肪酶活力的測(cè)定結(jié)果及遺傳穩(wěn)定性Table 5 Genetic stability of mutants B3 and B7 for lipase production

由表5可知，變異菌株B3和B7的脂肪酶活分別為（16.21±0.27）U/mL和（17.18±0.36）U/mL，是原始菌株B0酶活（12.1±0.15）U/mL的1.34 倍和1.42 倍，差異顯著（P＜0.05），傳代培養(yǎng)5 次，B3、B7各代酶活力變化不大，差異不顯著（P＞0.05），因此，變異菌株B3、B7的產(chǎn)脂肪酶遺傳性能很穩(wěn)定。

2.6 原始菌株和變異菌株的SDS-PAGE分析

將3 個(gè)菌體蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，經(jīng)凝膠成像分析系統(tǒng)分析并拍照形成電泳圖，如圖6所示。

圖5 各部分蛋白成分的比較Fig. 5 Comparison of protein components of the original strains and mutants B3 and B7

由圖5可知，原始菌株和變異菌株蛋白條帶存在有無(wú)和明暗的差異。3 株菌株在分子質(zhì)量大小約為28 kDa處均出現(xiàn)清晰的條帶，但變異菌株B7、B3的條帶比原始菌株B0顏色更深更明顯；B7、B3比B0多出一條分子質(zhì)量大小約為16 kDa的條帶；B7在分子質(zhì)量約為19 kDa的條帶比B3更寬一些，B7蛋白表達(dá)更多；B3、B7在分子質(zhì)量大小約為21、36 kDa處均出現(xiàn)條帶，在相同兩處B0卻沒有條帶，說明原始菌株經(jīng)誘變處理，促進(jìn)了某些蛋白質(zhì)的合成；3株菌株在分子質(zhì)量大小為58～62 kDa之間出現(xiàn)明顯的條帶，B7、B3的蛋白表達(dá)量更高。以上結(jié)果說明，菌株經(jīng)脈沖強(qiáng)光處理后蛋白發(fā)生改變，是因?yàn)槊}沖強(qiáng)光處理菌株對(duì)其核酸造成影響，使某些基因的表達(dá)發(fā)生變化，改變了某些蛋白質(zhì)的合成。

3 結(jié)論與討論

本研究采用脈沖強(qiáng)光對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變處理，在脈沖電壓2 450 V、照射距離5 cm、脈沖40 次的條件下，篩選出兼具耐受高溫、耐受強(qiáng)酸和耐受高濃度膽鹽的變異菌株B3和B7，產(chǎn)α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶活力分別是原始菌株的167%和177%（P＜0.01）、156%和171%（P＜0.01）、134%和142%（P＜0.05），變異菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定性較高且可遺傳變異，SDS-PAGE凝膠電泳顯示菌體誘變前后蛋白表達(dá)出現(xiàn)差異性，該方法應(yīng)用于枯草芽孢桿菌誘變育種領(lǐng)域具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)誘變篩選出了高耐受性變異枯草芽孢桿菌，并且其α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶的產(chǎn)生能力得到了顯著提高。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，以上耐受性和幾種產(chǎn)酶能力的增強(qiáng)對(duì)菌株用于抵抗動(dòng)物胃腸道內(nèi)的不良環(huán)境[18]、肉類嫩化處理[28]、定向改變食品組分以提高特定營(yíng)養(yǎng)成分的比例[29]等方面均具有積極作用。因此，脈沖強(qiáng)光處理枯草芽孢桿菌取得了良好的誘變效果，在枯草芽孢桿菌誘變育種領(lǐng)域發(fā)展?jié)摿薮?，在微生物工業(yè)酶制劑中應(yīng)用前景廣闊。

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Pulsed Light Mutagenesis and Screening of Bacillus subtilis for Improved Tolerance and Extracellular Enzymatic Activities of Screened Mutants

ZHAO Tianhui, ZHANG Baiqing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Pulsed light was applied to mutagenize Bacillus subtilis. The resulting mutants were screened for improved tolerance. The extracellular enzymatic activity and genetic stability of the selected mutants were analyzed and compared with those of the original strain and the differential protein expression of the original strain and the mutant strains was determined by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed that 8 resistant mutant strains were generated under the conditions of pulse voltage of 2 450 V, distance of 5 cm and pulse number of 40.After primary and secondary screening, the mutant strains B3 and B7 with good tolerance to high temperature tolerance, acid and high concentration of bile salt were obtained. Their α-amylase activity, protease activity, lipase activity was increased by 67% and 77% (P ＜ 0.01), 56% and 71% (P ＜ 0.01), and 34% and 42% (P ＜ 0.05), compared with those of the original strain,respectively. The enzymatic activity of the obtained mutants was stable (P ＞ 0.05) and showed genetic variation. The protein expression level was different between before and after mutagenesis. These fi ndings proved the feasibility of application of pulsed light to mutagenize B. subtilis.

tolerance; Bacillus subtilis; pulsed light; mutagenesis and screening; enzymatic activity

10.7506/spkx1002-6630-201802030

TS201.3

A

1002-6630（2018）02-0192-06

趙天惠, 張佰清. 耐受性枯草芽孢桿菌的脈沖強(qiáng)光誘變篩選及產(chǎn)酶活力分析[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2): 192-197.

10.7506/spkx1002-6630-201802030. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Tianhui, ZHANG Baiqing. Pulsed light mutagenesis and screening of Bacillus subtilis for improved tolerance and extracellular enzymatic activities of screened mutants[J]. Food Science, 2018, 39(2): 192-197. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802030. http://www.spkx.net.cn

2017-01-24

趙天惠（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称贩菬峒庸ぜ夹g(shù)。E-mail：1183412100@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：張佰清（1966—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称饭こ碳夹g(shù)的開發(fā)和應(yīng)用。E-mail：sybaiqingxl@sina.com