趙圣明，趙巖巖，馬漢軍，何鴻舉

1 株廣譜抗菌活性菌株的篩選鑒定及其抗菌蛋白的分離純化

趙圣明，趙巖巖，馬漢軍，何鴻舉

（河南科技學院食品學院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

從湖南傳統(tǒng)臘肉中分離篩選得到1 株具有廣譜抑菌活性的菌株HLR13，該菌株發(fā)酵液對蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、藤黃微球菌和腸炎沙門菌等食品中常見的致病菌具有較強的抑制活性。通過形態(tài)學特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析，該菌株被鑒定為枯草芽孢桿菌斯皮茲仁亞種（Bacillus subtilis subsp. spizienii）。采用硫酸銨分級沉淀、離子交換層析（Q Sepharose FF）和凝膠過濾層析（Sephadex G-75）等方法對該菌株所產抗菌蛋白進行分離純化，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測顯示純化后的蛋白為單一條帶，通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析和NCBI/nr蛋白數據庫比對初步確定該抗菌蛋白分子質量為31 494 Da，是枯草芽孢桿菌產生的一種假定蛋白。本實驗可為新型天然防腐劑的開發(fā)提供一定理論依據。

枯草芽孢桿菌斯皮茲仁亞種（Bacillus subtilis subsp. spizienii）；抗菌蛋白；菌株鑒定；分離；純化

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一種內生孢子的革蘭氏陽性菌，具有較強的抗逆能力，也是目前環(huán)境中廣泛存在的非致病性細菌，不產毒素，對人畜不產生危害，具有良好的發(fā)酵能力，能分泌多種酶類和抗菌活性物質等[1-2]，在農業(yè)和食品領域已被廣泛應用[3-4]?？莶菅挎邨U菌可以生產多種抗菌肽，包括核糖體合成的subtilosin A[5]、sublancin[6]和mersacidi[7]等和非核糖體合成的iturin和fengycin等[8]。此外，枯草芽孢桿菌還能夠產生多種抗菌蛋白，對常見的病原性細菌和真菌具有較好的抑制作用，尤其是在生物防治植物病蟲害方面有著重要應用。Yang Chiyea等[9]從分離自臺灣馬鈴薯種植園土壤中的枯草芽孢桿菌CHU26的發(fā)酵產物中獲得了一種抗菌蛋白，該蛋白屬于幾丁質酶，對植物致病真菌立枯絲核菌具有明顯的抑制作用。Zhao Jing等[10]從分離自白菜根際土壤中的枯草芽孢桿菌XF-1發(fā)酵產物中獲得了抗菌蛋白，該蛋白對引起十字花科植物根腫病的甘藍根腫菌具有較強的抑制作用。黃娜等[11]從分離自土壤的枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物中獲得了抗菌蛋白，此抗菌蛋白對蘋果炭疽病菌具有較好的抑制作用。目前國內外關于抗菌蛋白的研究主要集中于農業(yè)生物防治方面，在食品防腐保鮮方面的應用研究尚較少[12-13]。然而還有許多枯草芽孢桿菌產的抗菌蛋白未被開發(fā)，篩選能夠產生高效廣譜抗菌蛋白并可應用于食品工業(yè)的微生物菌株，將為天然抗菌蛋白的應用開辟更廣闊的前景。

本實驗從中國傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉中分離獲得1 株對食源性致病菌具有較強抑制活性的枯草芽孢桿菌菌株，采用硫酸銨分級沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析對抗菌蛋白進行分離純化，并對其抑菌活性進行測定，為抗菌蛋白在食品防腐保鮮中的開發(fā)應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與試劑

湖南傳統(tǒng)農家自制臘肉，樣品取回后貯藏于4 ℃冰箱備用。

革蘭氏染色試劑盒 杭州百思生物技術有限公司；細菌總DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；10×Taq buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶、Gel Extraction Kit、DNA Ladder Marker 日本TaKaRa公司；Sephadex LH-20 美國Phamarcia公司；其他試劑均為國產分析純。

1.1.2 指示菌與培養(yǎng)基

蠟樣芽孢桿菌（A S 1.1 8 4 6）、大腸桿菌（ATCC25922）、熒光假單胞菌（AS1.1802）、腸炎沙門菌（CICC21527）、生孢梭菌（CICC10385）、藤黃微球菌（C M C C（B）2 8 0 0 1）、串珠鐮刀菌（CCCCM30174）和黃曲霉（CICC2062）為本實驗室保存。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g、NaCl 10.0 g、pH 7.0，蒸餾水定容至1 L；121 ℃、20 min滅菌備用，固體培養(yǎng)基另加1.5%～2%的瓊脂。

菌株鑒定用培養(yǎng)基：在菌株鑒定中所用到的營養(yǎng)瓊脂半固體培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基等均參照東秀珠等[14]的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》配制。

1.2 儀器與設備

Orion 3 STAR pH計 美國Thermo公司；Sartious電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；TOMY-SX-700全自動高壓滅菌鍋 日本Tomy公司；Centrifuge 5804R冷凍高速離心機 德國Eppendorf公司；PTC-100TMPCR儀 美國MJ Research公司；PowPacTMHC164-5052高電流電泳儀、Mini Protein-II型垂直電泳儀美國Bio-Rad公司；JS-380C全自動數碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)、Hitrap QFF離子交換層析柱 美國GE Healthcare公司；恒溫干燥箱、PYX-DHS-50X65隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；DBS-100電腦自動部分收集器 上海滬西分析儀器公司；基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS） 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離

在無菌條件下，用剪刀將臘肉樣品剪成5 g的小塊放入裝有100 mL生理鹽水和玻璃珠的250 mL三角瓶中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)30 min。然后將樣品進行梯度稀釋，選擇10-3、10-4、10-5、10-6CFU/mL 4 個濃度梯度各100 μL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h。隨機挑取單菌落，在LB固體培養(yǎng)基上進行劃線分離純化，最后挑取形態(tài)單一的單菌落貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 產抗菌蛋白菌株的初篩

產抗菌蛋白菌株的初篩選用瓊脂塊抑菌法[15]。將分離得到的菌株分別劃線于LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)36 h后，使用滅菌打孔器于生長菌落旁取出直徑為5 mm的瓊脂塊，然后將瓊脂塊分別擺放于混合有蠟樣芽孢桿菌和熒光假單胞菌的指示菌瓊脂平板表面，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后測量抑菌圈直徑。1.3.3 產抗菌蛋白菌株的復篩

將經初篩具有抗菌活性的菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min發(fā)酵24 h。12 000 r/min離心10 min，上清液經0.22 μm孔徑的細菌濾器過濾，采用瓊脂孔擴散法進行抑菌活性測定。將100 mL LB固體培養(yǎng)基中混入1 mL指示菌（大腸桿菌、藤黃微球菌和腸炎沙門菌）培養(yǎng)液，平板倒好后用直徑為5 mm的無菌打孔器在抑菌平板上打孔，然后取50 μL過濾后的發(fā)酵上清液注入瓊脂孔中，指示細菌37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察并測量抑菌圈直徑大小。

1.3.4 菌株鑒定

1.3.4.1 生理生化鑒定

主要從菌落形態(tài)及菌體觀察、硝酸鹽實驗、檸檬酸鹽實驗、V-P實驗、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、甲基紅實驗、吲哚實驗、H2S產生實驗和尿素實驗等對菌株進行形態(tài)和生理生化鑒定，具體方法參照《伯杰細菌鑒定手冊》（第八版）[16]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]。

1.3.4.2 基于16S rDNA基因的分子生物學鑒定

目標菌株基因組DNA提?。簩⒕暌?%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，取5 mL菌液9 000 r/min離心2 min后棄上清液后收集菌體，利用TE緩沖液再離心洗滌2 次后，按照細菌基因組提取試劑盒說明書提取細菌總DNA。16S rDNA基因的PCR擴增和序列測定：采用原核生物16S rDNA擴增的通用引物（由上海生工生物公司合成），正向引物：fD1 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物：rP1 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’[17]。PCR反應體系：10×PCR buffer，5 μL；10 mmol/L MgCl2，3 μL；2.0 μmol/L dNTP，4 μL；10 μmol/L fD1，3 μL；10 μmol/L rP1，3 μL；1.0 μmol/L DNA模板，1 μL，5 U/μL TaqTMDNA聚合酶，1 μL；ddH2O，30 μL；總反應體系50 μL。PCR擴增得到的目的片段與T載體連接轉化到大腸桿菌DH5α中，挑取轉化子送南京金斯瑞生物公司測序，將得到的16S rDNA基因序列，在美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）上的GenBank序列數據庫進行分析，在基因數據庫中進行同源性搜索比對。

1.3.5 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將菌株的16S rDNA基因序列和GenBank上的同源序列在應用BLAST程序比對的基礎上，通過Clustal X1.85軟件比對后利用MEGA 5.05軟件以鄰位相連法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，應用bootstrap程序分析，重復次數為1 000 次[18]。

1.3.6 抗菌蛋白的分離純化

將發(fā)酵液4 ℃、12 000 r/min離心10 min，除去菌體，上清液加入硫酸銨粉末至飽和度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%，攪拌后置于4 ℃冰箱放置8 h，然后9 000 r/min離心10 min分別收集沉淀和上清液，沉淀經去離子水復溶后，用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH值至6.5，分別檢測抗菌活性確定硫酸銨鹽析的最佳飽和度。將最終收集的沉淀經透析脫鹽后，獲得抗菌蛋白的粗提物利用QFF離子交換層析柱和AKTA蛋白純化系統(tǒng)進行層析純化。純化條件為流速2 mL/min、最高柱壓0.3 MPa、收集體積為1 mL，洗脫體積為5 個柱體積，平衡體積為5 個柱體積，進樣體積2 mL。分別用0.10、0.25、0.40、1.00 mol/L NaCl溶液（pH 8.5的Tris-HCl作為緩沖液）進行梯度洗脫。280 nm波長處檢測各蛋白洗脫組分的吸光度，經蒸餾水透析脫鹽后檢測其抑菌活性。收集得到的抑菌活性組分利用Sephadex G-75凝膠層析進行進一步純化。Sephadex G-75凝膠溶脹后裝柱（70 cm×2.6 cm），預先用0.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）平衡過夜。將透析脫鹽后的抗菌蛋白粗溶液進行超濾濃縮，取2 mL濃縮樣品上樣，以相同的緩沖液洗脫，洗脫流速為0.3 mL/min，每管收集3 mL，280 nm波長處檢測各個洗脫組分，PEG 20000濃縮后分別做抑菌實驗，收集抑菌活性組分-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 抗菌蛋白分子質量的測定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）測定菌株抗菌蛋白分子質量[19]。利用Mini Protein-II型垂直電泳儀電泳2 h。電泳結束后利用考馬斯亮藍染色過夜，7.5%冰醋酸固定后，置于脫色搖床振蕩脫色30～60 min至背景干凈，條帶清晰。

1.3.8 MALDI-TOF-MS/MS分析

電泳檢測為單一條帶的樣品經胰蛋白酶酶解后通過MALDI-TOF-MS/MS進行質譜分析獲得該蛋白的肽指紋圖譜，NCBI數據庫檢索和比對。質譜條件為紫外激光波長355 nm，加速電壓為20 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據，將PMF強度最大的幾個峰進行串聯(lián)質譜分析；譜圖用肌紅蛋白酶解肽段進行外標校正，所獲得圖譜使用GPS V3.6軟件進行分析，蛋白質質譜數據通過MASCOT 2.1軟件進行蛋白質數據庫檢索并鑒定分離得到的蛋白質。

1.3.9 抗菌蛋白抑菌活性測定

采用經Sephadex G-75純化獲得的抗菌蛋白活性組分，利用瓊脂孔擴散法測定抗菌蛋白的抑菌活性，指示菌株包括蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、腸炎沙門菌、藤黃微球菌、生孢梭菌、串珠鐮刀菌和黃曲霉。

2 結果與分析

2.1 抗菌活性菌株的分離篩選結果

以湖南傳統(tǒng)農家自制臘肉為篩選樣品，通過瓊脂塊法進行初篩，共篩選獲得79 株對蠟樣芽孢桿菌和熒光假單胞菌具有較好抑制活性的菌株。通過瓊脂擴散法進行抑菌活性的復篩，確定19 株菌具有較好的抑菌效果，對指示菌的抑菌效果見表1。其中菌株HLR13的抑菌效果最好，對5 株指示菌（蠟樣芽孢桿菌、熒光假單胞菌、大腸桿菌、藤黃微球菌和腸炎沙門菌）均具有較好的抑制作用，對蠟樣芽孢桿菌的抑菌圈直徑達到了19 mm，如圖1所示。因此本研究選取菌株HLR13為后續(xù)實驗菌株。

表1 菌株發(fā)酵液對指示菌的抑菌作用Table 1 Antibacterial activity of cell-free supernatant of 19 isolated strains

圖1 菌株HLR13對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果Fig. 1 Inhibitory effect of strain HLR13 on Bacillus cereus

2.2 菌株生理生化和分子生物學鑒定結果

經革蘭氏染色和鏡檢觀察菌株形態(tài)確定該菌株為革蘭氏陽性，菌體呈直桿狀，兩端鈍圓，可形成卵圓形芽孢，芽孢孢囊膨大，中生至次端生。菌落在LB瓊脂培養(yǎng)基上生長菌落大小直徑約為0.3～0.5 mm，不產色素，菌落呈淡黃色，近圓形，表面光滑，無明顯褶皺，邊緣整齊，黏稠，微凸起，有光澤。菌株生理生化結果如表2所示，硝酸鹽實驗、檸檬酸鹽實驗、V-P實驗、接觸酶實驗和淀粉水解實驗等呈陽性，甲基紅實驗、吲哚實驗、H2S實驗和尿素實驗呈陰性。結合以上菌落培養(yǎng)特征和生理生化特征，初步將菌株HLR13鑒定為枯草芽孢桿菌。

表2 菌株HLR13生理生化鑒定結果Table 2 Physiological and biochemical identif i cation of strain HLR13

利用16S rDNA引物進行PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到一條約1 600 bp的特異性條帶。將擴增產物回收后進行測序，菌株HLR13 16S rDNA序列長度為1 579 bp。將所測序列經校對和拼接后利用NCBI的BLAST程序與GenBank數據庫中的核酸數據進行同源性比對，發(fā)現菌株HLR13與枯草芽孢桿菌的相似性達到99%。選擇相似性較高的菌株及芽孢菌屬內相關菌株的16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖2。結合形態(tài)學特征、生理生化實驗以及16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹結果最終確定菌株HLR13在細菌分類學上屬于枯草芽孢桿菌斯皮茲仁亞種（B. subtilis subsp. spizienii）。

圖2 菌株HLR13的系統(tǒng)發(fā)育樹關系圖Fig. 2 Phylogenetic tree of strain HLR134 based on 16S rRNA sequence

2.3 抗菌蛋白的分離純化

將發(fā)酵液經過高速冷凍離心后收集無細胞上清液，首先采用硫酸銨進行鹽析。對鹽析后的上清液和經透析脫鹽、聚乙二醇濃縮后的抗菌粗蛋白分別測定抗菌活性。由表3可知，不同飽和度硫酸銨鹽析后的抑菌活性差異較大，硫酸銨飽和度為80%時獲得沉淀的抑菌活性最強，為了達到最佳鹽析效果，選用飽和度為80%的硫酸銨溶液作為沉淀抗菌蛋白的最佳硫酸銨濃度。由圖3可知，濃縮后的抗菌蛋白粗提液經QFF離子交換層析，得到2 個未被吸附的蛋白組分和4 個被吸附的蛋白洗脫組分（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），抑菌活性檢測后發(fā)現，0.1 mol/L NaCl洗脫液洗脫下的組分Ⅰ具有抑菌活性，其余組分均無抑菌活性，說明采用該離子交換層析可以有效地將其他雜質和抗菌蛋白分開。合并收集抑菌活性組分Ⅰ，濃縮后采用Sephadex G-75凝膠層析進一步純化。經洗脫后得到2 個蛋白洗脫組分S1和S2（圖4）。經抑菌活性檢測，發(fā)現S2蛋白洗脫峰具有抑菌活性，將S2抑菌活性組分濃縮后4 ℃保存用于下一步分析。

表3 枯草芽孢桿菌HLR13發(fā)酵上清液硫酸銨沉淀后抑菌活性Table 3 Antibacterial activity of cell-free culture supernatant of strain HLR13 salted out with ammonium sulfate

圖3 枯草芽孢桿菌HLR13產抗菌蛋白的離子交換層析洗脫曲線Fig. 3 Elution curve of antimicrobial protein from Bacillus subtilis HLR13 on Q Sepharose Fast Flow

圖4 枯草芽孢桿菌HLR13產抗菌蛋白的Sephadex G-75洗脫曲線Fig. 4 Elution curve of the antimicrobial protein on Sephadex G-75 gel

2.4 分子質量測定結果

凝膠層析純化后的抗菌蛋白SDS-PAGE檢測結果，如圖5所示，經凝膠層析純化后，抗菌蛋白電泳顯示為單一條帶，表明抗菌蛋白的純化達到電泳純，根據標準分子質量蛋白可得到該抗菌蛋白的表觀分子質量約為29.8 kDa。

圖5 枯草芽孢桿菌HLR13抗菌蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE pattern of the antimicrobial protein

2.5 MALDI-TOF-MS/MS分析結果

經SDS-PAGE得到的單一條帶樣品進行MALDI-TOFMS/MS質譜分析，結果見圖6a，將其中信號較強的4 個分子質量為1 030、1 191、1 589 Da和1 685 Da的解離肽段進行二級質譜分析，結果見圖6b～6e。將質譜測得的蛋白肽指紋圖譜及解離肽段的二級質譜數據通過Mascot軟件在線檢索NCBI數據庫得知，蛋白得分最高者為188 分，是一種枯草芽孢桿菌產的假定蛋白。經Mascot軟件檢索NCBI數據庫細菌全庫，通過計算得分超過78 分以上，檢索結果具有顯著性（P＜0.05），且分數越高，說明蛋白的相似性及比對結果的可信度也更高。因此，根據比對結果可以初步確定該抗菌蛋白為枯草芽孢桿菌假定蛋白，可能為一種新抗菌蛋白，測得該蛋白的分子質量為31 494 Da，與純化的蛋白條帶在分子質量上較為相近。

圖6 抗菌蛋白的肽段質譜圖Fig. 6 MALDI-TOF-MS/MS of peptide fragments with different molecular weights from trypsin digestion of the antimicrobial protein

2.6 抗菌蛋白的抑菌活性

圖7 枯草芽孢桿菌HLR-13產抗菌蛋白的抑菌活性Fig. 7 Inhibitory activity of the antimicrobial protein

由圖7可知，經Sephadex G-75凝膠層析純化得到的抗菌蛋白對食品中常見的一些致病菌和腐敗菌具有顯著的抑制作用，包括蠟樣芽孢桿菌、大腸桿菌、熒光假單胞菌、腸炎沙門菌、生孢梭菌、藤黃微球菌、串珠鐮刀菌和黃曲霉。

3 討 論

本實驗從湖南傳統(tǒng)農家臘肉中篩選得到1株具有較強抑菌活性的菌株，經過對菌株的生理生化鑒定和分子生物學鑒定，最終將該菌株確定為枯草芽孢桿菌。關于臘肉中篩選獲得發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株的研究報道較多，如于華等[20]從四川臘肉中篩選鑒定得到1株產脂肪酶能力較強的團青霉；王海燕等[21]從湖南臘肉中篩選鑒定獲得產香能力較強的模仿葡萄球菌S52；栗桂蓉等[22]從湖南臘肉中篩選鑒定得到高產丁二酮的地衣芽孢桿菌BCL-8。而從臘肉中篩選抗菌活性菌株的研究報道較少且都以乳酸菌為主，如魯晶晶[23]從湖南湘西臘肉中篩選鑒定得到1株植物乳桿菌LJ-3，該菌株對大腸桿菌、沙門菌和枯草芽孢桿菌具有較好抑菌作用；胡逸敏等[24]從湖南臘肉中篩選鑒定得到對單核細胞性李斯特菌具有較好抑制作用的屎腸球菌。許多芽孢桿菌可以產生抗菌蛋白，但是以前研究報道的大部分產抗菌蛋白的芽孢桿菌菌株都分離自土壤中，且抗菌蛋白大多應用于農業(yè)生物防治中。例如劉剛等[25]從農田土壤中分離得到的枯草芽孢桿菌Loq18產的抗菌蛋白主要應用于采后草莓和葡萄灰霉病的防治；于杰等[26]從香蕉根部土壤分離得到的枯草芽孢桿菌B25產的抗菌蛋白對幾種熱帶植物病原真菌具有較好的抑制作用；秦楠等[19]從玉米田土壤中分離得到的解淀粉芽孢桿菌HRH317產的抗菌蛋白對引起小麥赤霉病和玉米莖基腐病的禾谷鐮孢菌具有較好的抑制作用；姚烏蘭等[27]從水稻根際土壤中分離得到的多黏類芽孢桿菌WY110菌株產的抗菌蛋白對水稻稻瘟病菌具有較好的抑制作用。因此，從天然發(fā)酵食品中篩選獲得抗菌蛋白的芽孢桿菌生產菌株，并將天然抗菌蛋白應用于食品防腐保鮮領域具有一定的科學研究意義。

微生物發(fā)酵液中一般含有多種次生代謝產物，為了對抗菌蛋白進行分離純化，首先需要對發(fā)酵液進行粗提取。目前，粗提取的方法主要有硫酸銨沉淀和有機溶劑沉淀。后者容易引起蛋白質變性，前者成本低且不易引起蛋白質變性，因此芽孢桿菌所產的抗菌蛋白大多采用硫酸銨沉淀法進行粗提取，并與逐步層析等方法相結合進行進一步的分離純化[28-30]。牛煥杰等[31]利用枯草芽孢桿菌E1R-j獲得了分子質量為115 kDa且對蘋果樹腐爛病菌具有抑制活性的抗菌蛋白，楊麗榮等[32]利用解淀粉芽孢桿菌YN-1菌株獲得了分子質量約為31 kDa且對黃瓜灰霉病菌具有抑制活性的抗菌蛋白，Zhao Jing等[10]利用枯草芽孢桿菌PBT1獲得了分子質量約為25 kDa且對甘藍根腫菌具有較強抑制活性的抗菌蛋白。本研究中枯草芽孢桿菌菌株HLR13發(fā)酵液經硫酸銨沉淀，Q Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephadex G-75凝膠層析純化得到一種對食品中常見的腐敗菌和致病菌具有較好抑制作用的抗菌蛋白，經過質譜鑒定和NCBI數據庫比對，初步將其確定為一種枯草芽孢桿菌產的假定蛋白，分子質量為31 494 Da，此前未有研究報道該分子質量相同的蛋白具有抗菌活性，因此，該蛋白可能為枯草芽孢桿菌產生的一種新型蛋白類抗菌物質。由于本實驗中抗菌物質的分離是根據蛋白質特性進行分離純化的，且經過硫酸沉淀后上清液仍具有殘留的抑菌活性，因此該菌株可能還同時產生其他種類的抗菌物質。因此可以采用薄層色譜法和高效液相色譜法等方法對該菌株可能產生的其他物質進行分離純化，對該菌株進行充分的開發(fā)利用。

4 結 論

本研究從湖南傳統(tǒng)臘肉中篩選鑒定得到1株枯草芽孢桿菌HLR13，從該菌株發(fā)酵液中分離純化得到一種分子質量為31 494 Da的新型抗菌蛋白，其對食品中常見的一些致病菌和腐敗菌具有顯著的抑制作用。以后研究中可以選擇不同地域的臘肉食品為篩選樣品，期望獲得更多不同種屬的優(yōu)良抗菌蛋白生產菌株。此外，鑒于本研究中枯草芽孢桿菌HLR13產的抗菌蛋白對食品中常見的腐敗菌和致病菌具有較好抑制作用，下一步可以對抗菌蛋白的編碼基因、表達調控及抑菌機理等方面進一步地進行分析，為開發(fā)新型的天然抗菌蛋白在食品工業(yè)中的應用提供理論依據和技術支撐。

[1] 劉穎, 張彬彬, 孫冰玉, 等. 枯草芽孢桿菌高產中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J]. 食品科學, 2014, 35(13): 166-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201413032.

[2] STEIN T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specif i c functions[J]. Molecular Microbiology, 2005, 56(4): 845-857.DOI:10.1111/j.1365-2958.2005.04587.X.

[3] YáNEZ-MENDIZáBAL V, VINAS I, USALL J, et al. Formulation development of the biocontrol agent Bacillus subtilis strain CPA-8 by spray-drying[J]. Journal of Applied Microbiology, 2012, 112(5): 954-965. DOI:10.1111/j.1365-2672.2012.05258.X.

[4] 張杰, 葛武鵬, 陳瑛, 等. 納豆激酶高產菌株的選育及固態(tài)發(fā)酵技術[J].食品科學, 2016, 37(3): 151-156. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603028.

[5] NIKIFOROVA O A, KLYKOV S, VOLSKI A, et al. Subtilosin A production by Bacillus subtilis KATMIRA1933 and colony morphology are inf l uenced by the growth medium[J]. Annals of Microbiology, 2016,66(2): 661-671. DOI:10.1007/s13213-015-1149-3.

[6] JI S, LI W, BALOCH A R, et al. Improved production of sublancin via introduction of three characteristic promoters into operon clusters responsible for this novel distinct glycopeptide biosynthesis[J]. Microbial Cell Factories, 2015, 14(1): 1-10. DOI:10.1186/s12934-015-0201-0.

[7] BR?TZ H, BIERBAUM G, REYNOLDS P E, et al. The lantibiotic mersacidin inhibits peptidoglycan biosynthesis at the level of transglycosylation[J]. European Journal of Biochemistry, 1997, 246(1):193-199.

[8] LUO C, LIU X, ZHOU H, et al. Nonribosomal peptide synthase gene clusters for lipopeptide biosynthesis in Bacillus subtilis 916 and their phenotypic functions[J]. Applied & Environmental Microbiology,2015, 81(1): 422-431. DOI:10.1128/AEM.02921-14.

[9] YANG C, HO Y, PANG J, et al. Cloning and expression of an antifungal chitinase gene of a novel Bacillus subtilis isolate from Taiwan potato fi eld[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(3): 1454-1458. DOI:10.1016/j.biortech.2008.07.039.

[10] ZHAO J, WU Y X, HO H H, et al. PBT1, a novel antimicrobial protein from the biocontrol agent Bacillus subtilis XF-1 against Plasmodiophora brassicae[J]. European Journal of Plant Pathology,2016, 145(3): 583-590. DOI:10.1007/s10658-016-0905-y.

[11] 黃娜, 周莉質, 費丹, 等. 枯草芽胞桿菌胞外抗菌蛋白的初步分離及性質的研究[J]. 植物保護, 2015(6): 49-54. DOI:10.3960/j.issn.0529-1542.2015.06.008.

[12] 樊陳, 高兆建, 陳宏偉, 等. 一株抗菌蛋白產生菌的篩選鑒定及其純化[J]. 食品科學, 2013, 34(13): 213-217. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201313045.

[13] 楊勝遠, 韋錦, 李云, 等. 一株產抗菌活性物質解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定[J]. 食品科學, 2010, 31(21): 208-212.

[14] 蔡妙英, 東秀珠. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M]. 北京: 科學出版社,2001: 349-386.

[15] 賈銳, 陸兆新. 原桃膠中1 株芽孢桿菌的分離鑒定及其主要抗菌物質[J]. 食品科學, 2016, 37(21): 136-143. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621024.

[16] BUCHANAN R E, GIBBONS N E. 伯杰細菌鑒定手冊[M]. 8版. 中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組, 譯. 北京:科學出版社, 1984: 729-736.

[17] DENG Y, LU Z, LU F, et al. Study on an antimicrobial protein produced by Paenibacillus polymyxa JSa-9 isolated from soil[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27(8): 1803-1807. DOI:10.1007/s11274-010-0638-6.

[18] MAO S, LU Z, ZHANG C, et al. Purification, characterization, and heterologous expression of a thermostable β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus altitudinis YC-9[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology,2013, 169(3): 960-975. DOI:10.1007/s12010-012-0064-3.

[19] 秦楠, 郝林, 李鑫. 解淀粉芽胞桿菌HRH317抗菌蛋白的分離純化及其抗菌作用[J]. 植物保護學報, 2015, 42(5): 813-819. DOI:10.13802/j.cnki.zwbhxb.2015.05.017.

[20] 于華, 黃丹, 陳卓, 等. 四川臘肉中產脂肪酶霉菌篩選及產酶條件研究[J]. 中國食品添加劑, 2016(12): 78-83. DOI:10.3969/j.issn.1006-2513.2016.12.005.

[21] 王海燕, 馬長偉, 李平蘭. 傳統(tǒng)湖南臘肉中產香葡萄球菌的篩選及鑒定[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(5): 45-49. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2006.05.012.

[22] 粟桂蓉, 周璐璐, 易浪波, 等. 一株高產丁二酮菌株的篩選與鑒定[J].吉首大學學報(自然科學版), 2016, 37(2): 38-42. DOI:10.3969/j.cnki.jdxb.2016.02.010.

[23] 魯晶晶. 臘肉源廣譜抑菌產生菌的分離及抑菌物質研究[D]. 長沙:湖南農業(yè)大學, 2014: 55-56.

[24] 胡逸敏, 林仲儀, 馬靜, 等. 產細菌素乳酸菌的篩選及鑒定[J]. 食品工業(yè)科技, 2013, 34(20): 212-215. DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.20.064.

[25] 劉剛, 楊雪, 梅雪然, 等. 枯草芽孢桿菌Loq18抗菌蛋白的分離純化及其對灰葡萄孢的抑制活性[J]. 四川師范大學學報(自然科學版),2015, 38(1): 119-125. DOI:10.3969/j.issn.1001-8395.2015.01.020.

[26] 于杰, 張榮意, 譚志瓊, 等. 枯草芽孢桿菌B25抗真菌作用及抗菌蛋白的分離純化[J]. 基因組學與應用生物學, 2016, 35(3): 629-634.DOI:10.13417/j.gab.035.000629.

[27] 姚烏蘭, 王云山, 韓繼剛, 等. 水稻生防菌株多粘類芽孢桿菌WY110抗菌蛋白的純化及其基因克隆[J]. 遺傳學報, 2004, 31(9): 878-887.

[28] LUO Y, SUN L, ZHU Z, et al. Identif i cation and characterization of an anti-fungi Fusarium oxysporum f. sp. cucumerium protease from the Bacillus subtilis strain N7[J]. Journal of Microbiology, 2013, 51(3):359-366. DOI:10.1007/s12275-013-2627-6.

[29] SENOL M, NADAROGLU H. Purification of chitinase enzymes from Bacillus subtilis bacteria TV-125, investigation of kinetic properties and antifungal activity against Fusarium culmorum[J].Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials, 2014, 13(1): 1-7.DOI:10.1186/s12941-014-0035-3.

[30] 陳夕軍, 李娟, 孫啟利, 等. 水稻內生枯草芽孢桿菌G87抗菌蛋白的分離純化及理化特性[J]. 微生物學報, 2010, 50(10): 1353-1357.DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.2010.10.014.

[31] 牛煥杰, 李輝, 王娜娜, 等. 蘋果樹腐爛病菌拮抗枯草芽孢桿菌E1R-j抗菌蛋白的分離純化[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版),2016, 44(9): 135-142. DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.09.018.

[32] 楊麗榮, 王正軍, 薛保國, 等. 解淀粉芽孢桿菌YN-1抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表達[J]. 基因組學與應用生物學, 2010, 29(5):823-828. DOI:10.3969/gap.029.00823.

Screening and Identif i cation of a Strain with Broad-Spectrum Antimicrobial Activity and Isolation and Purif i cation of Antimicrobial Protein

ZHAO Shengming, ZHAO Yanyan, MA Hanjun, HE Hongju
(School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

A new strain with broad-spectrum antimicrobial activity, named as HLR-13, was isolated from traditional smoked bacon from Hunan province. The cell-free supernatant produced by the strain HLR-13 showed a high inhibitory activity towards many foodborne pathogenic bacteria and fungi such as Bacillus cereus, Pseudomonas fluorescens,Mirococcus luteus, and Salmonella enteritidis. Based on its morphological, physiological and biochemical characteristics as well as 16S rDNA sequence analysis, the strain HLR-13 was identified as Bacillus subtilis subsp. spizienii. Then the antimicrobial protein produced by the strain was isolated and purified through ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography (Q Sepharose FF) and gel fi ltration chromatography (Sephadex G-75). Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) revealed a single band and the antimicrobial protein was preliminary identif i ed as a hypothetical protein with molecular weight of 31 494 Da by matrix-assisted laser desorption ionization timeof-f l ight tandem mass spectrometry (MALDI-TOF-MS/MS) analysis through comparison with NCBI non-redundant (NR)protein database. This research can provide a theoretical basis for developing new biological preservatives.

Bacillus subtilis subsp. spizienii; antimicrobial protein; strain identif i cation; isolation; purif i cation

10.7506/spkx1002-6630-201802027

TS252.54

A

1002-6630（2018）02-0170-07

趙圣明, 趙巖巖, 馬漢軍, 等. 1 株廣譜抗菌活性菌株的篩選鑒定及其抗菌蛋白的分離純化[J]. 食品科學, 2018, 39(2):

170-176. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802027. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Shengming, ZHAO Yanyan, MA Hanjun, et al. Screening and identification of a strain with broad-spectrumantimicrobial activity and isolation and purif i cation of antimicrobial protein[J]. Food Science, 2018, 39(2): 170-176. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802027. http://www.spkx.net.cn

2017-02-16

河南省重大科技專項（161100110600）；河南省高等學校重點科研項目（17A550001）；

河南科技學院高層次人才科研啟動項目（2016018；2016019；2015015）

趙圣明（1985—），男，講師，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：zhaoshengming2008@126.com