陳文炳，邵碧英，繆婷玉，彭 娟，陳 彬，張志燈，江樹勛

多基因DNA條形碼鑒定6 個(gè)鰻魚物種

陳文炳，邵碧英，繆婷玉，彭 娟，陳 彬，張志燈，江樹勛

（福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

建立6 種鰻魚的物種多基因DNA條形碼精準(zhǔn)鑒定方法。以鰻魚DNA為模板，采用3 對通用引物對6 種鰻魚的3 個(gè)基因（16S rRNA、Cyt b、COⅠ）部分DNA片段進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增、測序，結(jié)果6 種鰻魚各獲得3 條16S rDNA（638～643 bp）、Cyt b（464～466 bp）、COⅠ（705～707 bp）基因部分DNA序列，從中選取各物種序列同源的片段設(shè)計(jì)3 對新引物對6 種鰻魚的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因部分DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物大小分別為504～507、400、609 bp，再從各片段中篩選出具有6 種鰻魚物種特異性強(qiáng)的、堿基數(shù)分別為262、280、300 bp的3 條DNA片段序列，作為6 種鰻魚物種的3 個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，應(yīng)用DNAMAN V6軟件進(jìn)行同源性分析，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫的比對驗(yàn)證，制定了供檢測實(shí)踐用的同源率判別指標(biāo)，建立鰻魚物種的多基因條形碼檢測方法。應(yīng)用該方法對30 個(gè)待檢鰻魚樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，各樣品基于3 個(gè)基因DNA條形碼的比對，符合同源率指標(biāo)，物種判別結(jié)果互相吻合，從而精準(zhǔn)判別樣品的所屬物種。該方法穩(wěn)定、精準(zhǔn)、易于操作，可應(yīng)用于6 種鰻魚的物種鑒定，值得推廣。

16S rRNA基因；Cyt b基因；COⅠ基因；多基因DNA條形碼；鰻魚物種鑒定

我國是鰻魚養(yǎng)殖與加工出口大國，每年烤鰻與活鰻出口量達(dá)數(shù)萬噸，貨值達(dá)數(shù)十億美元，主要出口國有日本、美國、俄羅斯、德國、韓國等。由于鰻魚加工成熟食以后及進(jìn)口鰻苗體積細(xì)小，難以從形態(tài)上辨別其種類。一方面不同種類的鰻魚產(chǎn)品與鰻苗價(jià)格不同，另一方面，歐洲鰻（Anguilla anguilla）被自然保護(hù)國際聯(lián)盟組織列為極度瀕危物種[1-2]，所有的歐洲鰻國際貿(mào)易都需要獲得瀕危物種貿(mào)易許可證。我國鰻魚產(chǎn)品出口時(shí)，被進(jìn)口國要求提供鰻魚物種鑒定報(bào)告，如果產(chǎn)品物種屬于歐洲鰻，又未能提供貿(mào)易許可證，將被視為非法貿(mào)易而被強(qiáng)行銷毀處理。另外，近年來時(shí)有發(fā)現(xiàn)不良商家用在我國氣候條件下無法正常生長成成品鰻的莫桑比克鰻苗冒充“南美鰻”，給養(yǎng)殖企業(yè)造成巨大損失。為了維護(hù)企業(yè)與消費(fèi)者利益以及正常市場秩序，應(yīng)企業(yè)與執(zhí)法部門要求，建立鰻魚種類的精準(zhǔn)鑒定方法，對我國鰻魚養(yǎng)殖業(yè)與加工出口外貿(mào)易具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增技術(shù)在食品中魚類物種成分的鑒別已有較多研究與應(yīng)用[3-7]，在鰻魚中的應(yīng)用主要是基于PCR的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA遺傳多樣性分析與物種鑒別探討的研究[8-12]，但在檢驗(yàn)檢疫中實(shí)踐應(yīng)用，缺乏穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。DNA條形碼是指生物體內(nèi)能夠代表該物種的，種間存在足夠變異，種內(nèi)相對穩(wěn)定，易于PCR擴(kuò)增、適當(dāng)長度的DNA片段。最早由加拿大生物學(xué)家Hebert等[13]研究發(fā)現(xiàn)利用線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ）基因一段長度為648 bp的片段，能夠在DNA水平上成功的區(qū)分物種，提供一種快速、簡便、可信的分類方法，并命名為DNA條形碼技術(shù)。近年來，隨著基因條形碼技術(shù)的發(fā)展，除了COⅠ基因DNA序列作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼應(yīng)用于物種鑒別[13-15]外，存在物種特異性的線粒體16S rRNA、Cyt b基因、COⅡ基因等的DNA序列，也被作為DNA條形碼應(yīng)用于物種鑒別和遺傳多樣性分析[16-21]，國內(nèi)有關(guān)于鰻魚線粒體DNA的COⅠ與COⅡ基因序列分析及其系統(tǒng)分類的研究[22-24]報(bào)道。國外有人將鰻魚COⅠ基因序列的DNA條形碼與GenBank中鰻魚DNA序列比對，而判定非法貿(mào)易的歐洲鰻物種，但該方法往往存在待測樣品與GenBank中多個(gè)鰻魚物種同源率相同，難以準(zhǔn)確判斷其所屬具體物種[25-26]。目前國內(nèi)外鮮見利用多基因DNA條形碼進(jìn)行鰻魚物種鑒定的研究報(bào)道。本研究在基于16S rRNA基因部分DNA片段建立的DNA條形碼（243 bp）鑒定美洲鰻（Anguilla rostrata）、歐洲鰻（A. anguilla）、日本鰻（A. japonica）3 種鰻魚的基礎(chǔ)[27]上，延長16S rRNA基因部分DNA片段為262 bp并篩選除了Cyt b基因與COⅠ基因等多基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，建立了美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻、莫桑比克鰻（A. mossambica）、花鰻（A. marmorata）、太平洋雙色鰻（A. bicolor pacifica）6 種鰻魚的多基因DNA條形碼物種精準(zhǔn)鑒定方法。為維護(hù)企業(yè)與消費(fèi)者利益以及正常市場秩序，避免貿(mào)易壁壘，提供技術(shù)保障，對我國鰻魚養(yǎng)殖業(yè)與加工出口對外貿(mào)易具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

日本鰻、美洲鰻、歐洲鰻樣品，由福建省三明市華晟食品公司提供，莫桑比克鰻、花鰻（A. marmorata）、太平洋雙色鰻樣品由福州郊區(qū)鰻魚養(yǎng)殖企業(yè)提供。用于方法應(yīng)用實(shí)驗(yàn)的待測鰻魚樣品系企業(yè)委托實(shí)驗(yàn)室留樣與鰻魚養(yǎng)殖企業(yè)提供，制作成模擬盲樣供實(shí)驗(yàn)。

十六烷基三甲基溴化銨 上海博亞生物技術(shù)有限公司；2×Taq PCR Master Mix、蛋白酶K、DNA MarkerⅠ 天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖英國Oxoid公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultrospec 1100 pro核酸蛋白分析儀 瑞典Amersham公司；T-Gradient梯度PCR儀 德國Biometra公司；Power Pac 1000電泳儀 美國Bio-Rad公司；GL212 PRO凝膠成像儀 美國Carestream公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)

16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因的3 個(gè)DNA部分片段PCR擴(kuò)增通用引物序列[28-30]與自主設(shè)計(jì)的DNA條形碼引物序列（16S rDNA 504、Cyt b 400、COⅠ609）、退火溫度與PCR產(chǎn)物長度見表1，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 通用PCR引物與自主設(shè)計(jì)的引物序列、退火溫度及PCR產(chǎn)物Table 1 Primer sequences for PCR amplif i cation of 16S rDNA, Cyt b,and COⅠ genes, annealing temperatures and PCR product size

1.3.2 DNA的提取及濃度、純度測定

參照文獻(xiàn)[27]方法進(jìn)行。1.5 mL離心管中加入約50 mg樣品粉末或鮮樣100 mg，加200 μL TE溶液（pH 8.0），旋渦混勻；加入400 μL裂解液，旋渦混勻；加600 μL Tri-飽和酚-氯仿-異戊醇溶液（25∶24∶1，V/V），劇烈振蕩，12 000×g離心10 min；取上清液，加入等體積的氯仿-異戊醇溶液（24∶1，V/V），劇烈振蕩，12 000×g離心10 min；取上清液，加0.8 倍體積異丙醇，12 000×g離心10 min；取沉淀，加入400 μL NaCl溶液（1 mol/L）于65 ℃溫浴中溶解，再加入5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），5 μL Rnase A（10 μg/mL），劇烈振蕩30 s以上，37 ℃溫浴1 h，期間定期晃動(dòng)。加等體積的水飽和酚-氯仿-異戊醇溶液（25∶24∶1，V/V），振蕩，12 000 r/min離心15 min，重復(fù)該步驟1～2 次，直到蛋白質(zhì)去除干凈為止。取上清液，加2 倍體積的無水乙醇，輕微晃動(dòng)，12 000 r/min離心10 min。取沉淀，70%乙醇溶液清洗2 次，干燥，加100 μL TE（pH 8.0）溶解。每個(gè)樣品設(shè)2 個(gè)重復(fù)。

樣品DNA用核酸蛋白分析儀測定波長260 nm和280 nm處的OD，分別計(jì)算DNA純度與質(zhì)量濃度，計(jì)算公式如下：DNA純度=OD260nm/OD280nm，比值在1.7～2.0之間較為理想；雙鏈DNA質(zhì)量濃度/（μg/mL）＝50×OD260nm值。

1.3.3 PCR反應(yīng)熱循環(huán)參數(shù)的設(shè)置與PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min。94 ℃變性30 s，50～62 ℃（各對引物相應(yīng)溫度見表1）退火時(shí)間30 s，72 ℃延伸60 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。4 ℃保存。反應(yīng)體系為：10×Taq buffer 2.5 μL，Taq酶1.0 U，模板DNA 200 ng，MgCl23.5 mmol/L，dNTPs 300 μmol/L，上游引物0.5 μmol/L，下游引物0.5 μmol/L，用ddH2O將總體積補(bǔ)至25 μL。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測

用0.5×TBE電泳緩沖液制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠。將8～10 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與1～2 μL的6×加樣緩沖液（電泳前沿指示劑）混合后，在凝膠板上的孔中點(diǎn)樣。用分子質(zhì)量大小適當(dāng)?shù)腄NA Marker做分子質(zhì)量標(biāo)記。選擇合適的電壓（80～90 V），電泳時(shí)間為50～60 min。用凝膠成像儀觀察、拍照、記錄與分析。

1.3.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA測序與分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托鉑尚（Biosune）生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行雙向測序，各基因片段序拷貝在word格式文檔中，序列首尾各用相應(yīng)的8 個(gè)堿基小片段作為查找的引子，截取特異性目的片段，作為各鰻魚物種標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，供比對鑒定。用DNAMAN V6（中文版）進(jìn)行DNA序列整理，以*.seq格式輸出，然后進(jìn)行同源性比對與同源樹構(gòu)建，比對結(jié)果與同源樹以*.emf格式輸出。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰻魚的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因片段PCR引物篩選及其產(chǎn)物序列分析

采用3 對通用引物（表1）對6 種鰻魚的3 個(gè)基因（16S rRNA、Cyt b、COⅠ）部分DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物雙向測序，6 種鰻魚各獲得3 條16S rDNA、Cyt b、COⅠ基因部分DNA序列，片段長度分別為638～643、464～466、705～707 bp，在GenBank數(shù)據(jù)庫中BLAST比對，分別與數(shù)據(jù)庫中的美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻、莫桑比克鰻、花鰻、太平洋雙色鰻的相應(yīng)基因序列的同源率均為99%，序列ID號見表2。基于各基因的6 條序列的同源性比對，Cyt b基因部分圖見圖1（16S rRNA與COⅠ基因圖略），排除序列中存在堿基缺失部分與不具差異的區(qū)間，選取各物種序列同源的片段（圖1，下劃黑線部分）用于設(shè)計(jì)新引物（16S rDNA 504、Cyt b 400、COⅠ609，表1）。

圖1 6 種鰻魚Cyt b基因部分DNA片段（464～466 bp）序列比對Fig. 1 Sequence (464–466 bp) alignment of Cyt b gene fragments among 6 eel species

表2 6 種鰻魚的16S rDNA、Cyt b、COⅠ基因通用引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列在GenBank中對應(yīng)的同源率最高的DNA序列號Table 2 GenBank DNA sequence accession numbers with the highest homology to PCR amplif i ed products with universal primers of the 16S rDNA, Cyt b and COⅠ genes of six eel species

2.2 鰻魚DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列的篩選與在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對（BLAST）分析

圖 2 6 種鰻魚16S rRNA基因（A）、Cyt b基因（B）和COⅠ基因（C）的3 條DNA片段（504～507、400、609 bp）PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 PCR amplif i ed results of three DNA fragments (504–507, 400, and 609 bp) of 16S rRNA (A), Cyt b (B) and COⅠ(C) gene in 6 species of eel

應(yīng)用自主設(shè)計(jì)的3 對引物16S rDNA 504、Cyt b 400、COⅠ609（表1）對6 種鰻魚進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測序，如圖2所示，從各序列中篩選、截取6 種鰻魚間堿基序列同源性低、物種特異性強(qiáng)、不存在堿基缺失或插入的片段，作為6 種鰻魚的16S rRNA、Cyt b 、COⅠ3個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，片段長度分別為262、280、300 bp，如圖3所示，各物種序列相同的首尾下劃線部分8 個(gè)堿基為截取目的片段的引子，用于在word文檔中“編輯-查找”（參照文獻(xiàn)[27]）。6 個(gè)鰻魚物種各3 個(gè)基因共18 條DNA條形碼堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索比對（BLAST）的結(jié)果（按同源率高低排序顯示出100 條），如表3所示。除太平洋雙色鰻外，日本鰻、美洲鰻、歐洲鰻、莫桑比克鰻、花鰻的DNA序列匹配（同源）率除了個(gè)別情況，均為99%～100%。在16S rDNA條形碼堿基序列比對中，歐洲鰻樣品的DNA條形碼在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對與一個(gè)A. rostrata（KJ564271.1）片段同源率為100%，可能是序列提供者提交時(shí)弄錯(cuò)種名。樣品莫桑比克鰻的Cyt b（280 bp）DNA條形碼比對中，出現(xiàn)與一個(gè)印度洋雙色鰻（A. bicolor bicolor）（AB021780.1）片段同源率是100%，也可能是序列提供者提交了錯(cuò)誤的種名。另外，在供試樣品太平洋雙色鰻的3 個(gè)基因DNA條形碼與GenBank數(shù)據(jù)庫比對中發(fā)現(xiàn)，供試樣品與印度洋雙色鰻物種親緣關(guān)系非常接近，16S rDNA條形碼堿基序列比對中，同源率為100%的，排序前面100 條片段中，前6 個(gè)片段是太平洋雙色鰻，接在后面的是82 條印度洋雙色鰻，同源率為99%的12 條也都是印度洋雙色鰻；在Cyt b（280 bp）DNA條形碼比對中，同源率為100%的16 個(gè)片段都是太平洋雙色鰻，同源率99%的57 條中，太平洋雙色鰻占23 條，印度洋雙色鰻占34 條，余下同源率98%的27 條也均為印度洋雙色鰻；在樣品太平洋雙色鰻的COⅠ（300 bp）DNA條形碼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫比對中發(fā)現(xiàn)，同源率為100%的只有1 條片段（A. bicolor pacifica，AP007237.3），其他99 條均是同源率為98%的印度洋雙色鰻。綜合上述分析結(jié)果，本研究歸納出6 個(gè)鰻魚物種的3 個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列應(yīng)用于鰻魚物種鑒別實(shí)踐的同源率判斷指標(biāo)如表4所示。例如，某盲樣3 個(gè)基因的序列與美洲鰻標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼同源率均為99%～100%，可判定該樣品為美洲鰻，如果與莫桑比克鰻（A. mossambica）標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼16S rDNA（262 bp）與Cyt b（280 bp）的同源率均為99%～100%，與COⅠ（300 bp）的同源率為100%，樣品可判定為莫桑比克鰻；某盲樣3 個(gè)基因的序列與太平洋雙色鰻（A.bicolor pacif i ca）標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼同源率均為100%，可判定該樣品為太平洋雙色鰻。

圖3 6 種鰻魚的16S rRNA基因（A）、Cyt b基因（B）和COⅠ基因（C）的3 條DNA條形碼（262、280、300 bp）標(biāo)準(zhǔn)序列Fig. 3 Three standard DNA barcode sequences (262, 280, and 300 bp)based on 16S rRNA (A), Cyt b (B) and COⅠ(C) gene fragments in 6 species of eel

表3 6 個(gè)鰻魚物種的3 個(gè)基因共18 條DNA條形碼堿基序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對的結(jié)果Table 3 Alignment of 18 DNA barcode sequences from 3 genes in 6 eel species with the GenBank database

表4 6 個(gè)鰻魚物種的18 條標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列應(yīng)用判斷指標(biāo)Table 4 Homology of 18 standard DNA barcode sequences for identif i cation of 6 eels species

2.3 DNA條形碼鑒定方法的建立與應(yīng)用

2.3.1 DNA條形碼鑒定方法的建立

樣品制作、DNA提取、DNA質(zhì)量檢測、PCR擴(kuò)增與測序均按照1.2.2～1.2.5節(jié)進(jìn)行。以鰻魚DNA為模板，采用表1中自主設(shè)計(jì)的3 對引物，進(jìn)行16S rRNA、Cyt b、COⅠ編碼基因的部分DNA片段序列的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA測序，大小分別為504～507、400、609 bp，在word頁面上用圖3中下劃線部分8 個(gè)堿基作為引子從各片段中截取出具有6 種鰻魚物種特異性強(qiáng)的、堿基數(shù)分別為262、280、300 bp的3 條DNA片段序列，作為6 種鰻魚物種的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。用同樣方法，截取待檢鰻魚樣品的3 個(gè)基因DNA片段，借助DNAMAN V6軟件，待檢鰻魚樣品的3 個(gè)基因DNA片段與相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼進(jìn)行序列同源性比對，3 條DNA條形碼比對結(jié)果互相驗(yàn)證，與某物種同源率符合表4中的指標(biāo)，即可判別待測樣品為某物種，從而精準(zhǔn)鑒定待檢鰻魚樣品的所屬物種。如果不符合表4中的指標(biāo)，可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索比對（BLAST）。

2.3.2 DNA條形碼鑒定方法在鰻魚物種鑒定中的應(yīng)用

表5 DNA條形碼技術(shù)在30 個(gè)鰻魚樣品物種鑒定中的應(yīng)用Table 5 Application of DNA barcoding method in species identif i cation of 30 eel samples

圖4 6 種待測樣品16S rRNA基因（A）、Cyt b基因（B）和COⅠ基因（C）的3 條DNA條形碼與6 種鰻魚對應(yīng)基因標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼（262、280、300 bp）的比對同源樹Fig. 4 Homology tree based on three DNA barcode sequences (262,280, and 300 bp) from 16S rRNA (A), Cyt b (B) and COⅠ (C) gene fragments among 6 samples and 6 known species of eel

如表5所示，各樣品3 個(gè)基因的DNA序列與相應(yīng)DNA標(biāo)準(zhǔn)條形碼的同源率均為100%（圖4，其他樣品圖略）。其中，8 個(gè)樣品判定為美洲鰻、5 個(gè)樣品為歐洲鰻，3 個(gè)樣品為日本鰻，4 個(gè)樣品為莫桑比克鰻，5 個(gè)樣品為花鰻，5 個(gè)樣品為太平洋雙色鰻。

3 討論與結(jié)論

Hebert等[13]最早提出DNA條形碼的定義，以COⅠ基因部分DNA序列作為物種分類指標(biāo)，種內(nèi)遺傳距離一定要小于種間距離，種間遺傳距離在2%以上，且是種內(nèi)的10 倍以上。COⅠ、COⅡ基因序列應(yīng)用于鰻魚系統(tǒng)發(fā)育與分類的研究，發(fā)現(xiàn)種內(nèi)個(gè)體間也存在遺傳距離[21-25]，雖然比種間距離小，但在其他物種存在種內(nèi)與種間距離重疊的現(xiàn)象[21]，即有時(shí)種內(nèi)距離大于種間。由于種間界限不夠明顯，存在模糊地帶，因此，DNA條形碼選擇，關(guān)系到物種間界限明了與否，能否準(zhǔn)確判斷待檢樣品所屬具體物種。Vandamme[25]與Stein[26]等應(yīng)用COⅠ基因序列鑒別非法貿(mào)易的瀕危物種歐洲鰻，結(jié)果因存在待測樣品同時(shí)與GenBank數(shù)據(jù)庫中2 個(gè)以上物種序列同源率相同的問題，即種間界限不明顯，無法做出判定，只能借助其他數(shù)據(jù)庫（如BOLD（The Barcode of Life Data System））收錄的DNA序列加以比對，做出綜合判定，主要原因是所用的DNA片段太長，堿基數(shù)太多，序列同源性比對時(shí)，難以將物種間的同源率距離拉開。最理想的物種鑒定DNA條形碼指標(biāo)，應(yīng)該是物種間堿基序列差異大、同源率低的DNA序列?？梢姡鳛槲锓N特異指標(biāo)的條形碼DNA片段選擇至關(guān)重要。

隨著基因條形碼技術(shù)的發(fā)展，除了COⅠ基因DNA序列作為標(biāo)準(zhǔn)條形碼[11-13]外，作為重要條形碼的線粒體16S rRNA、Cyt b等基因的DNA序列，近年也越來越多地被應(yīng)用于物種鑒別和遺傳多樣性分析[14-20]。本研究在應(yīng)用基于16S rRNA基因部分DNA片段建立的DNA條形碼（2 4 3 b p）鑒定美洲鰻、歐洲鰻、日本鰻3 種鰻魚的基礎(chǔ)上[27]，先采用3 對通用引物對6 種鰻魚的3 個(gè)基因（16S rRNA、Cyt b、COⅠ）部分D N A片段進(jìn)行P C R擴(kuò)增、測序，6 種鰻魚各獲得3 條16S rDNA（638～643 bp）、Cyt b（464～466 bp）、COⅠ（705～707 bp）基因的DNA片段。但由于通用引物適用于許多物種，往往不同物種，在PCR產(chǎn)物靶DNA片段首尾兩端引物位置，PCR擴(kuò)增常常堿基配對不好，影響PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果，重復(fù)性不好，不宜作為條形碼序列，因此從通用引物的PCR產(chǎn)物序列中選出穩(wěn)定的、各供試物種同源性相同的區(qū)域，設(shè)計(jì)了3 對新引物，對6 種鰻魚的16S rRNA、Cyt b、COⅠ基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物大小分別為504～507、400、609 bp，再從各片段中截取出具有6 種鰻魚物種特異性強(qiáng)的、堿基數(shù)分別為262、280、300 bp的3 條DNA片段，作為6 種鰻魚物種3 個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼，應(yīng)用DNAMAN V6軟件進(jìn)行同源性分析，建立了鰻魚物種的多基因條形碼檢測方法。本研究之所以要用3 個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼鑒定物種，是因?yàn)? 個(gè)基因的條形碼組合使用，可以砌高物種間的界限“圍墻”，能更清晰區(qū)分物種，也為有效區(qū)分尚未收集到的鰻魚物種與已知供試6 個(gè)物種，提供基因數(shù)據(jù)“圍墻”，避免可能存在種間界限模糊的問題。

在3 個(gè)基因16S rRNA（262 bp）、Cyt b（280 bp）與COⅠ（300 bp）各6 條標(biāo)準(zhǔn)條形碼在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對的基礎(chǔ)上，建立了應(yīng)用于鰻魚物種鑒別實(shí)踐的同源率判斷指標(biāo)（表4）。待測鰻魚樣品獲得的3 條條形碼與本方法建立的3 條標(biāo)準(zhǔn)條形碼之間的同源率符合表4的判定指標(biāo)時(shí)，就能判定其所屬物種，不存在待測樣品同時(shí)與GenBank中多個(gè)物種DNA序列同源率相同而無法進(jìn)行物種判定的問題。本方法可能還存在缺陷，應(yīng)用者如有檢測結(jié)果不符合表4的各項(xiàng)指標(biāo)，可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中加以比對驗(yàn)證，再作判斷。

本研究建立的方法在30 個(gè)待檢鰻魚模擬盲樣的物種鑒定中應(yīng)用，結(jié)果表明：各樣品中獲得的3個(gè)基因的DNA片段與相應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼進(jìn)行序列同源性比對，同源率均為100%，獲得的物種判別結(jié)果互相吻合，從而精準(zhǔn)判別鰻魚樣品所屬的物種，與預(yù)期結(jié)果完全一致，表明該方法穩(wěn)定、精準(zhǔn)、易于操作，可應(yīng)用于6 種鰻魚的物種鑒定，值得推廣。目前還只收集到6 個(gè)物種，將收集更多的鰻魚物種樣品進(jìn)行進(jìn)一步研究，建立適合于更多鰻魚物種的檢測方法。

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Identif i cation of Six Eel Species Using Polygenic DNA Barcoding

CHEN Wenbing, SHAO Biying , MIAO Tingyu, PENG Juan, CHEN Bin, ZHANG Zhideng, JIANG Shuxun
(Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research, Inspection and Quarantine Technology Center,Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Fuzhou 350003, China)

This paper develops an accurate method to identify six eel species including Anguilla rostrata, A. anguilla, A.japonica, A. mossambica, A. marmorata, and A. bicolor pacif i ca using polygenic DNA barcoding. Three pairs of universal primers were used to amplify partial fragments of the 16S rRNA, Cyt b and COⅠgenes of the eel species with the total genomic DNA from eel as a template and the amplif i ed products were sequenced. As a result, 16S rDNA (638–643 bp), Cyt b(464–466 bp) and COⅠ(705–707 bp) gene fragments were obtained for each species. Homologous sequences of these genes were found. Three new primer pairs were designed to amplify 638–643, 400 and 609 bp fragments of the 16S rRNA,Cyt b and COⅠ genes by PCR, respectively. The specif i c 16S rRNA, Cyt b and COⅠfragments of 262, 280 and 300 bp were selected as standard DNA barcodes for the identification of eel species. Homology analysis was performed using DNAMAN software (version 6) and the homology for species discrimination was developed by aligning the DNA barcodes with the GenBank database. Analysis of 30 samples from six eel species by the developed method showed that the species were consistently identif i ed using the DNA barcodes. In conclusion, the method is stable, precise and easy to operate and can be applied to the identif i cation of six species of eels.

16S rRNA; Cyt b; COⅠ; polygenic DNA barcode; identif i cation of eel species

10.7506/spkx1002-6630-201802026

S917.4；Q78

A

1002-6630（2018）02-0163-07

陳文炳, 邵碧英, 繆婷玉, 等. 多基因DNA條形碼鑒定6 個(gè)鰻魚物種[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2): 163-169.

10.7506/spkx1002-6630-201802026. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wenbing, SHAO Biying, MIAO Tingyu, et al. Identif i cation of six eel species using polygenic DNA barcoding[J]. Food Science,2018, 39(2): 163-169. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802026. http://www.spkx.net.cn

2017-06-02

福建省科技計(jì)劃農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性項(xiàng)目（2015N0016）

陳文炳（1962—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品、食品分子生物學(xué)檢測技術(shù)。E-mail：621213wbc@163.com