史佩玉，曹立民，林 洪，隋建新*

表面等離子體共振技術分析卵黃抗體對酪氨酸酶與底物相互作用的影響

史佩玉，曹立民，林 洪，隋建新*

（中國海洋大學食品安全與質量實驗室，山東 青島 266003）

目的：采用表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance，SPR）測定酪氨酸酶與特異性卵黃抗體（IgY）及其與底物L-多巴的親和力，探討特異性IgY對酪氨酸酶與底物親和力的影響。方法：將裸金芯片進行自組裝修飾，以3-巰基丙酸作為基底膜對酪氨酸酶進行固定，SPR實時監(jiān)測特異性IgY及底物L-多巴與酪氨酸酶結合后芯片表面的響應信號變化。將數(shù)據(jù)導入CLAMP分析軟件，進行擬合分析，確定動力學常數(shù)。結果：酪氨酸酶與特異性IgY的結合常數(shù)（4.50×106L/mol）明顯高于其與底物L-多巴的結合常數(shù)（4.95×103L/mol），且酪氨酸酶與特異性IgY結合后，其與底物L-多巴結合常數(shù)明顯下降。結論：相比底物L-多巴，酪氨酸酶更易與特異性IgY結合，而且從結合動力學角度說明特異性IgY可以明顯抑制酪氨酸酶與底物結合從而抑制酶活性。

表面等離子體共振；酪氨酸酶；特異性卵黃抗體；L-多巴；動力學常數(shù)

酪氨酸酶是一種分子質量為75 kDa的含銅氧化還原酶，廣泛分布于動植物、微生物及人體中[1]。具有雙重催化功能，即同時具有單酚酶活性和雙酚酶活性，能夠催化酪氨酸和多巴發(fā)生一系列反應產生黑色素，是生物體合成黑色素的關鍵酶和限速酶[2-3]。酪氨酸酶是導致新鮮果蔬、對蝦等食品發(fā)生酶促褐變的主要酶類，其過量表達也是導致人體色素沉著過度等皮膚問題的主要原因[4]。因此，越來越多的酪氨酸酶抑制劑被開發(fā)用于果蔬、對蝦等食品保鮮，以及治療常見的色素沉著皮膚病如雀斑、黃褐斑等[5-6]。目前常用的酪氨酸酶抑制劑主要有亞硫酸鹽、有機酸等化學抑制劑，以及從動植物體內提取的黃酮類、多酚類、糖苷類、醛類等活性物質，但這些抑制劑在操作性、安全性、效果、成本上等方面都存在一定的缺陷[7-8]。

卵黃抗體（IgY）是禽類卵黃中存在的唯一一種免疫球蛋白，是禽類B淋巴細胞在特定抗原刺激下產生并轉移到卵黃中形成的多克隆抗體[9-10]，具有純度高、含量大、易提取、特異性高、穩(wěn)定性好、耐酸耐熱、無毒無害等優(yōu)點[11]，而且不激活哺乳動物及人體的補體系統(tǒng)、不結合類風濕因子，可有效避免檢測中出現(xiàn)假性結果[12]，此外特異性IgY與免疫抗原特異性結合后，能顯著抑制免疫抗原的活性[13]，針對這些特性，IgY在免疫檢測、功能性食品開發(fā)、疾病的診斷與防治等方面有著廣泛應用[14]。

本實驗室的前期研究證實，酪氨酸酶特異性IgY能夠顯著抑制酪氨酸酶的活性，但對于抗原和抗體之間的結合是通過免疫吸附技術間接測定的，沒有直觀分析抗原抗體之間的相互作用。而表面等離子體共振技術（surface plasmon resonance，SPR）可通過檢測附著在傳感芯片表面的介質層的折射率與厚度改變而引起反射光的折射率等光譜變化來分析檢測生物分子相互作用[15]。自1983年Liedberg等[16]引入SPR技術進行免疫分析，SPR技術因具有樣品用量少、靈敏度高、樣品無需標記、實時快速、對分析物活性無影響等突出優(yōu)點[17]而迅速發(fā)展，目前已廣泛應用于醫(yī)學免疫檢測、環(huán)境監(jiān)測、藥物開發(fā)和食品安全檢驗等多個領域[18]。

本研究利用SPR技術直觀分析酪氨酸酶與特異性IgY結合的動力學過程，并探究特異性IgY對于酪氨酸酶與底物作用的影響，為特異性IgY作為新型酪氨酸酶抑制劑的應用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪氨酸酶、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、鹽酸乙醇胺 美國Sigma公司；過氧化氫（30%）、硫酸（98%）、2-N-嗎啡啉乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MES）、3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA）、無水乙醇上海晶純試劑有限公司；酪氨酸酶特異性IgY由本實驗室制備并經免疫親和純化得到。

1.2 儀器與設備

Biosuplar 400 SPR儀 德國Mivitec公司；BT100-2型微量蠕動泵 保定齊力恒流泵有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

酪氨酸酶、特異性IgY用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 7.4）配制成一系列質量濃度的溶液；EDC、NHS用MES（pH 6.0）緩沖液配制，濃度分別為0.2、0.05 mol/L，使用時二者按體積比1∶1混合；98%濃硫酸與30%過氧化氫按體積比3∶1配制為芯片洗液。所有溶液均使用超純水配制，0.22 μm濾膜過濾處理，使用前超聲脫氣。

1.3.2 芯片自組裝處理與酪氨酸酶的偶聯(lián)固化

采用自組裝膜技術，將芯片洗液浸泡處理的裸金芯片用0.3% MPA的無水乙醇溶液4 ℃條件下過夜處理12 h，在金膜表面自組裝一層巰基單分子膜[19]，然后通過0.2 mol/L的EDC溶液和0.05 mol/L的NHS溶液等體積混合溶液常溫活化1 h。活化后的芯片安裝入儀器，設定流速為35 μL/min，通入20 mg/mL酪氨酸酶在活化的傳感片表面進行偶聯(lián)固定，然后用0.25 mol/L鹽酸乙醇胺封閉未反應的活化酯，再用PBS洗去非共價吸附的酪氨酸酶及乙醇胺。以相同活化條件下表面沒有固定酪氨酸酶的芯片作為空白參比。

1.3.3 動力學測定

PBS（pH 7.4）作為流動緩沖液以恒定流速（流速35 μL/min）流過傳感片表面，測定相互動力學時，分別將對應的特異性IgY或底物L-多巴用PBS（pH 7.4）稀釋成不同質量濃度，分別通入到已固定酪氨酸酶的傳感片上。每個循環(huán)包括PBS背景采集、抗體結合和抗體解離3個階段。測定每一質量濃度后，用再生溶液pH 2.7的甘氨酸-鹽酸溶液再生傳感片，然后進行下一次測定[20]。

同樣方法測定酪氨酸酶與特異性IgY復合物與底物L-多巴的相互作用動力學。反應在25 ℃、pH 7.4、流速35 μL/min條件下進行，實驗所得的實時傳感曲線，導入到分析處理軟件CLAMP進行擬合，得相互作用的動力學參數(shù)。

2 結果與分析

2.1 芯片自組裝處理與酪氨酸酶的偶聯(lián)固定

SPR被廣泛應用于研究分子間相互作用，平面偏振光以合適角度入射到棱鏡表面的金膜，即兩種不同折射率的介質界面，發(fā)生全反射，滲透到金膜內的消失波引發(fā)金屬中的自由電子產生表面等離子體，當二者的頻率和波數(shù)相等時產生共振，光能被吸收，反射光能量急劇下降，出現(xiàn)反射強度最低值（即共振峰），此入射角即為SPR共振角[21]。金膜表面被修飾后折射率發(fā)生變化，共振峰的位置（SPR共振角）將發(fā)生改變，從而獲得被測物在芯片表面結合反應的信息[22]。

圖1 芯片表面修飾與酪氨酸酶固定原理示意圖Fig. 1 Schematic demonstration of chip modif i cation and tyrosinase immobilization

SPR芯片主要由玻璃基片、金膜以及偶聯(lián)在上面的探針構成，本研究所使用的裸金芯片，只在玻璃基片上蒸鍍一層50 nm的金膜，表面疏水性強，難以直接偶聯(lián)蛋白質分子，通過含硫化合物可以在金膜表面自組裝形成薄而有序的單分子層[23-24]。以MPA對裸金片進行12 h的自組裝，MPA以Au—S鍵共價結合在金膜上，而另一端的羧基（—COOH）經活化劑活化后，可與蛋白質分子的氨基（—NH2）發(fā)生脫水反應形成酰胺鍵，從而將蛋白質分子牢固地偶聯(lián)在芯片表面[23]（圖1）。芯片修飾前后的SPR響應如圖2所示，可以明顯看出，芯片修飾后的共振角與SPR響應信號都明顯增大，表明裸金片表面已經成功固定MPA。

嚴格來說，此次參與的車型并非都是超級跑車。其中，阿斯頓·馬丁Vantage就更適合長時間在歐洲大陸的公路上進行巡航，而非是在賽道上左搖右擺。嚴格意義上來說，它仍舊屬于傳統(tǒng)的運動跑車范疇。除此之外，奧迪R8 RWS也有類似的問題。即將面臨換代的奧迪R8似乎吸引力并沒有那么大，但回憶以往R8帶給我們的豐富樂趣，我們又不愿意將這輛R8 RWS留在出發(fā)地的停車場，讓它獨享寂寞。

圖2 芯片修飾前后SPR圖譜Fig. 2 SPR curves of sensor chip before and after modif i cation

圖3 芯片表面固定酪氨酸酶SPR實時傳感圖Fig. 3 SPR real-time curve for tyrosinase immobilized on the sensor chip surface

本研究擬固定的酪氨酸酶本身是一種蛋白質，可通過其自身氨基與芯片表面羧基的縮合反應固定在修飾后的芯片上，固定過程如圖3所示。酪氨酸酶在芯片表面固定后，PBS流過芯片表面時，信號有一定程度的下降，這是由于芯片表面物理吸附或結合不牢固的物質被洗脫下來所導致的，因此在每次測定結合反應之前，需先用PBS流經芯片，獲得平穩(wěn)基線后再進行實驗測定。酪氨酸酶固定穩(wěn)定后SPR響應信號上升了約60 RU，根據(jù)Stenberg等[25]結論，對蛋白來說，SPR信號響應值增加1 000 RU，相當于表面固定量增加1 ng/mm2。因此計算可得本實驗中固定的酪氨酸酶量約為0.06 ng/mm2。

2.2 動力學測定結果

2.2.1 酪氨酸酶與特異性IgY及底物L-多巴的動力學分析

圖4 酪氨酸酶與不同質量濃度特異性IgY的SPR結合曲線Fig. 4 SPR curves of tyrosinase binding to different concentrations of specif i c IgY

圖5 酪氨酸酶與不同質量濃度L-多巴的SPR結合曲線Fig. 5 SPR curves of tyrosinase binding to different concentrations of L-dopa

固定后的酪氨酸酶可與特異性IgY通過抗原抗體的特異性識別產生結合，同樣也可與L-多巴通過底物識別產生結合，SPR動態(tài)測定其結合過程如圖4、5所示。每個反應過程都包含結合、平衡、解離3 個階段，無論是特異性IgY還是L-多巴，隨著反應質量濃度的增加，結合信號也逐漸升高，說明結合量增大。對比可發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶與特異性IgY的結合量比與底物L-多巴的結合量更大，且相同結合量所用的特異性IgY質量濃度（0.1 mg/mL）比L-多巴的質量濃度（4.5 mg/mL）要小的多。

本實驗采用微量蠕動泵作為傳輸系統(tǒng)，各種溶液可以以恒定流速（35 μL/min）流過芯片表面，因此流經芯片表面的特異性IgY和L-多巴質量濃度可以認為保持恒定，其與固定的酪氨酸酶的相互作用可以看作是一級反應，符合下列反應方程式[26]：

式中：ka為結合速率常數(shù)/（L/（mol·s））；kd為解離速率常數(shù)/s-1；c為溶液中樣品的濃度/（mol/L）；Rmax為酪氨酸酶的表面最大結合容量/RU；R為時間t時的SPR信號/RU。

結合常數(shù)KA和解離常數(shù)KD可以由結合和解離速率常數(shù)[27]求得：

將所得的實時SPR傳感圖，分別導入到分析軟件Clamp XP，選擇相互作用分子比為1∶1 Langmuir的作用模式，對濃度測定計算方法進行擬合。所得的擬合結果動力學常數(shù)ka和kd、親和常數(shù)KA和KD見表1。

表1 特異性IgY和底物L-多巴與酪氨酸酶相互作用的動力學常數(shù)Table 1 Kinetic constants for the interaction of tyrosinase with speci fi c IgY and the substrate L-dopa

2.2.2 IgY對酪氨酸酶結合底物能力影響的動力學分析

實驗室前期研究表明，特異性IgY與酪氨酸酶結合后，能顯著抑制酪氨酸酶的活性，通過測定酪氨酸酶與特異性IgY結合后，再與底物L-多巴結合常數(shù)的變化，可從動力學角度分析特異性IgY對酪氨酸酶活性的抑制性能。

本研究分析了不同質量濃度的特異性IgY對酪氨酸酶與底物L-多巴親和力的影響，考慮特異性IgY以及最低質量濃度L-多巴結合信號的可觀測性，特異性IgY質量濃度范圍選擇0.05～0.25 mg/mL之間。由圖6可以看出，酪氨酸酶與特異性IgY結合后，其與底物L-多巴的結合受到顯著影響，且隨著特異性IgY質量濃度的增加，底物L-多巴的結合量逐漸變小，以最高質量濃度的L-多巴為例，其結合量由未結合IgY時的120 RU依次下降為100、85、70、55、40 RU。這表明IgY與酪氨酸酶特異性結合后能顯著影響酶與底物的識別，從而發(fā)揮抑制酶活性的作用。

圖6 酪氨酸酶與不同質量濃度特異性IgY復合物與不同質量濃度底物L-多巴SPR結合曲線Fig. 6 SPR curves of tyrosinase complexes with different concentrations of speci fi c IgY in the presence of different concentrations of the substrate L-dopa

將所得的實時SPR傳感圖，分別導入到分析軟件Clamp XP，按上述方法進行擬合，所得酪氨酸酶與不同質量濃度特異性IgY結合后與底物L-多巴的動力學常數(shù)及計算所得的親和常數(shù)如表2所示。

表2 酪氨酸酶與不同質量濃度特異性IgY復合后與底物L-多巴的相互作用動力學常數(shù)Table 2 Kinetic constants for the interaction of tyrosinase complexes with different concentrations of speci fi c IgY with L-dopa

從表2結合動力學和親和常數(shù)可以得出，特異性IgY的加入致使酪氨酸酶與底物L-多巴的結合速率（ka）降低，解離速率（kd）增大，所以導致二者的結合常數(shù)（KA）值明顯降低，隨著特異性IgY質量濃度的逐漸增大，KA值從4.95×103L/mol逐漸降低至183 L/mol，降低了約4 個數(shù)量級，進一步確證了特異性IgY對酶活性的抑制作用，這與傳統(tǒng)酶活性測定方法的檢測結果一致[8]。唯一不同的是采用傳統(tǒng)方法測定，0.5 mg/mL的IgY才能對酶活性產生抑制作用，0.1 mg/mL的IgY檢測不到其對酶活性的抑制作用；而本研究采用SPR技術在IgY質量濃度為0.1 mg/mL即可明顯檢測到酶與底物結合能力的變化，檢測靈敏度大大提高，這可能是因為SPR所用的Au-S體系自組裝膜的化學修飾法比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定利用物理吸附直接固定法具有更高的穩(wěn)定性和更好的特異性[30]。

3 結 論

本實驗利用SPR技術從動力學角度分析IgY與酪氨酸酶的相互作用及其對抗原活性的抑制效應，通過擬合分析得到的動力學常數(shù)研究了特異性IgY對酪氨酸酶與其底物相互作用的影響，從動力學角度實時分析IgY對酪氨酸酶活性的抑制效應，結果表明，SPR技術與傳統(tǒng)的酶活性檢測方法結果一致，方法的靈敏度較傳統(tǒng)酶活性測定方法大大提高，且能夠實時、快速監(jiān)測反應過程，可作為一種有效分析抗原抗體相互作用的手段應用與IgY的相關性質研究，為下一步IgY的性質鑒定和分子改造提供了重要的分析測試手段。

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Impact of Specif i c IgY on the Interaction between Tyrosinase and Its Substrate Analyzed by Surface Plasmon Resonance

SHI Peiyu, CAO Limin, LIN Hong, SUI Jianxin*
(Food Safety and Quality Laboratory, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Aim: Surface plasmon resonance (SPR) was used to investigate the impact of specif i c egg yolk immunoglobulin(IgY) on the interaction between tyrosinase and its substrate L-dopa. Methods: Bare gold chip was modified by selfassembly. 3-Mercaptopropionic acid (MPA) was used as the basement membrane to immobilize tyrosinase, and the SPR response signals of tyrosinse binding to specif i c IgY and L-dopa were monitored in real time. The CLAMP software was used to fi t the experimental data to determine the kinetic constants. Results: The aff i nity constant of tyrosinase to specif i c IgY (4.50 × 106L/mol) was higher than that to L-dopa (4.95 × 103L/mol), and after binding to specif i c IgY, the binding constant between tyrosinase and L-dopa was decreased significantly. Conclusion: Compared with the substrate L-dopa,tyrosinase was more likely to specifically bind to IgY, and the specific IgY could significantly inhibit the binding of tyrosinase to its substrate and consequently inhibited the enzyme activity on the basis of binding kinetics.

surface plasmon resonance (SPR); tyrosinase; specif i c IgY; L-dopa; kinetic constants

10.7506/spkx1002-6630-201802025

TS201.1

A

1002-6630（2018）02-0158-05

史佩玉, 曹立民, 林洪, 等. 表面等離子體共振技術分析卵黃抗體對酪氨酸酶與底物相互作用的影響[J]. 食品科學,2018, 39(2): 158-162.

10.7506/spkx1002-6630-201802025. http://www.spkx.net.cn

SHI Peiyu, CAO Limin, LIN Hong, et al. Impact of specif i c IgY on the interaction between tyrosinase and its substrate analyzed by surface plasmon resonance[J]. Food Science, 2018, 39(2): 158-162. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802025. http://www.spkx.net.cn

2017-01-12

山東省農業(yè)應用創(chuàng)新專項（931566010）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項（201413061）

史佩玉（1992—），女，碩士，研究方向為水產品質量控制。E-mail：shipeiyudecom@163.com

*通信作者簡介：隋建新（1981—），男，副教授，博士，研究方向為水產品安全質量控制。E-mail：suijianxin@ouc.edu.cn