翟立公，王俊穎，張小雨，孟 欣，崔 葆，趙婉晴，牛 萍

（安徽科技學院食品藥品學院，安徽 滁州 233100）

甲型副傷寒沙門菌特異性基因篩選及PCR檢測體系建立

翟立公，王俊穎，張小雨，孟 欣，崔 葆，趙婉晴，牛 萍

（安徽科技學院食品藥品學院，安徽 滁州 233100）

以甲型副傷寒沙門菌為檢測目標，通過比較基因組和聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）驗證方法篩選到4 個該血清型的特異性基因，其中以gene_3105作為該血清型的檢測靶點設計引物PA23；并結(jié)合沙門菌屬特異性引物139-141，建立一種甲型副傷寒沙門菌的PCR檢測方法。優(yōu)化PCR反應體系，并對該檢測體系的特異性、靈敏度、抗干擾能力及人工污染樣品檢出限等方面進行評價。結(jié)果表明，當樣品中含有甲型副傷寒沙門菌時，該體系能擴增出2 條特異性條帶，含有其他血清型的沙門菌僅能擴增出284 bp條帶，不含沙門菌無擴增條帶產(chǎn)生。靈敏度評價表明，基因組DNA和純菌菌落檢出限分別為32.4 pg/μL和4.3×103CFU/mL；抗干擾能力實驗顯示，當雞肉背景菌群和豬肉背景菌群濃度在106CFU/mL和4.87×107CFU/mL時，檢出限為6.43×104CFU/mL。當無菌的雞肉和豬肉樣品中添加N CFU/25 g甲型副傷寒沙門菌時，經(jīng)10 h增菌，檢測結(jié)果為陽性（0＜N＜10）。實驗建立甲型副傷寒沙門菌PCR檢測方法具有較好的特異性和靈敏度，有很好的應用價值，可在食品安全領域廣泛應用。

甲型副傷寒沙門菌；比較基因組；血清型特異性基因；聚合酶鏈式反應

甲型副傷寒沙門菌（Salmonella Paratyphi A）是傷寒類沙門菌中重要的一種血清型，經(jīng)糞口傳播，臨床表現(xiàn)類似傷寒類癥狀，常出現(xiàn)腹瀉、腸胃炎、發(fā)熱等情況，較嚴重者將出現(xiàn)腸出血和腸穿孔等癥狀[1-3]。據(jù)統(tǒng)計，全球每年引起的傷寒癥狀的患者多達2 200萬 例，其中由甲型副傷寒沙門菌引起的占25%[4-6]。在我國的個別省份內(nèi)也出現(xiàn)過大型的甲型副傷寒沙門菌的暴發(fā)和流行[7-8]。

我國的血清型鑒定和沙門菌的檢測主要參照GB/T 4789.4—2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》的傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，需要5 步：預增菌、選擇性培養(yǎng)、顯示培養(yǎng)、生化鑒定和血清型鑒定[7,9-10]。血清型鑒定主要是通過沙門菌特異的鑒定血清與菌體的O抗原、H抗原和Vi抗原發(fā)生凝集反應，再與Kauffman-White血清表對照鑒定菌株的血清型[11-12]。此方法雖然直觀，但操作較為繁雜，檢測時間需要5 d以上[13]。而且，如果菌體表面的抗原發(fā)生丟失或被破壞將影響抗體對抗原決定簇的識別，沙門菌血清型達2 600多種，如果血清的特異性不強或凝集反應較為遲緩，都會造成分型的錯誤[14]。利用分子檢測可有效彌補以上血清鑒定的不足，但是在基因水平上尋找到不同血清型之間的差異成為制約該技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵[15-16]。因此，血清型特異的檢測靶點的鑒定在分子檢測技術(shù)的發(fā)展扮演著重要的作用。Tennant等[17]以fl iC、sdfⅠ、16S RNA和 fliB- fl iA的間隔區(qū)域為目標，建立了針對沙門菌的腸炎、都柏林、斯坦利維爾、鼠傷寒及其變種血清型的多重聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測系統(tǒng)，經(jīng)實驗證明該多重PCR體系具有較好的特異性。

比較基因組學是對不同物種的基因數(shù)據(jù)進行比較分析，揭示彼此間的相似性和差異性，將有助于了解物種形成的機制和基因或基因組上非編碼區(qū)的功能[18-19]。隨著沙門菌不同血清型基因測序的完成，通過BLAST比對程序，可以篩選到在血清型內(nèi)的不同菌株中具有高度同源性，但對其他血清型差異較大的基因作為血清型特異性基因[18,20]。有研究對腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的全基因組進行分析分別獲得8 個和38 個具有血清型特異的區(qū)域，PCR評估后確定由SEN1392和STM4495兩個基因設計的引物的特異性和靈敏度最好，建立的PCR體系通過12 h富集培養(yǎng)后靈敏度達到2～3 CFU[21-22]。

本研究是利用比較基因組學技術(shù)篩選甲型副傷寒沙門菌的血清型特異性基因，并以此為模板設計甲型副傷寒沙門菌特異性引物與沙門菌屬特異性引物139-141共同構(gòu)建PCR檢測體系，并對其實際應用性進行評估，以期能達到快速檢測食品中甲型副傷寒沙門菌及沙門菌的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉和雞肉樣品 市購。

本實驗所涉及到菌株包括39 株沙門菌分屬31 個不同的血清型，以上菌株與甲型副傷寒沙門菌的同源性較近。實驗中選擇的18 株非沙門菌均是在食品中檢出率較高的食源性致病菌，具體菌株信息見表1。

表1 菌株及PCR檢測結(jié)果Table 1 Strains used in the test of PCR specif i city

續(xù)表1

酵母提取物、胰蛋白胨 英國Oxoid公司；dNTP、DNA凝膠回收試劑盒和Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒、引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；DNA標準分子質(zhì)量DL 2000 Marker、Taq DNA聚合酶和6×loading buffer 廣州東盛生物科技有限公司；2×Taq Master 南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Life Touch PCR擴增儀 杭州博日科技有限公司；JS-780全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；NV3000C微量紫外分光光度計儀 北京凱奧科技發(fā)展有限公司；Ⅱ級生物安全柜 鑫北生物技術(shù)有限公司；HYL-A全溫搖瓶柜 太倉市強樂實驗設備廠；DHZ-D冷凍恒溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠；DK-8 D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司；AY 120電子天平 日本島津公司；單人單面凈化工作臺杭州和欣科技有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 特異性基因篩選

從NCBI（ftp://ftp.ncbi.nih.gov/genbank/genomes/Bacteria/）基因組公共數(shù)據(jù)庫中，獲取甲型副傷寒沙門菌CMCC50973的全基因組序列數(shù)據(jù)。將該株菌的全基因序列的每個基因在NCBI的BLASTN（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）系統(tǒng)中進行比對。在比對過程中，選取與代表菌株基因組同源性較高，即Query cover的值為100%并且匹配期望值E趨近于0（E值＜10），同時與其他非該沙門菌血清型代表菌株基因組不具有同源性的基因作為該沙門菌血清型的準特異性靶點。

1.3.2 引物設計

引物設計通常使用Primer Premier 5.0軟件（PremierBiosoft International Inc.，USA），獲得的引物再通過Oligo 6.0軟件和BLASTN進行分析，選擇二聚體較少、自身無發(fā)夾結(jié)構(gòu)、退火溫度為60 ℃左右及與非模板DNA同源性較低的引物作為該基因的特異性引物并送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。本研究所需引物見表2。

表2 引物序列及擴增片段大小Table 2 Primer sequences and the length of amplif i cation fragments

1.3.3 菌株培養(yǎng)及基因組提取

將菌株接種于LB或BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)。利用熱裂解法提取細菌基因組DNA和Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取所有細菌基因組DNA。

1.3.4 沙門菌DNA濃度測定

將提取好的基因組DNA通過核酸濃度測定儀分析確定基因組DNA的質(zhì)量及基因組DNA的濃度，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.5 引物特異性驗證

以34 株不同血清型的沙門菌和18 株非沙門菌的基因組DNA為模板，與之前設計的甲型副傷寒沙門菌特異性引物進行PCR擴增。在25 μL反應體系所包括物質(zhì)的終濃度分別為：2×PCR Reaction Buffer 12.5 μL、Taq聚合酶0.1 U、引物0.4 μmol/L、DNA模板1 μL和ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；35 個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.3.6 PCR檢測體系的建立

根據(jù)前期篩選和特異性驗證獲得的甲型副傷寒沙門菌特異性基因作為模板設計引物，并且結(jié)合沙門菌屬特異性引物139-141，進行優(yōu)化。最終確定PCR的反應體系為：10×Taq Buffer（Mg2＋free）2.5 μL、dNTP 0.45 mmol/L、MgCl24 mmol/L、Taq聚合酶0.2 U、引物139-141 0.2 μmol/L、引物PA23 1.2 μmol/L、DNA模板2 μL和ddH2O 3 μL。優(yōu)化后的PCR反應條件：94 ℃預變性10 min；35 個循環(huán)，每個循環(huán)94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45s；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.3.7 特異性驗證

用實驗室所保存的甲型副傷寒沙門菌作為陽性菌株，其他血清型的沙門菌和非沙門菌的病原微生物作為陰性樣本，分別提取各菌株的基因組DNA作為模板，應用以上PCR檢測體系及反應參數(shù)進行擴增。

提取甲型副傷寒沙門菌CMCC50001的基因組DNA，并用核酸濃度測定儀分別測定基因組DNA濃度。將獲得的甲型副傷寒沙門菌基因組DNA用無菌水分別進行10 倍的梯度稀釋，每個稀釋度分別取2 μL作為模板分別進行多重PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳判斷相應反應體系的DNA模板靈敏度。

過夜培養(yǎng)甲型副傷寒沙門菌CMCC50001，通過無菌水進行10 倍的梯度稀釋。平板菌落計數(shù)10-6、10-7和10-8的稀釋度，獲得初始菌液的濃度。每個稀釋度分別取1 mL菌液，通過熱裂解法提取基因組DNA分別進行多重PCR擴增，電泳結(jié)果判斷反應體系的菌落靈敏度。

1.3.9 抗干擾能力評估

超市購得雞胸肉和豬肉樣品，經(jīng)標準細菌學方法GB 4789.4—2010驗證無沙門菌。在無菌條件下分別取25 g樣品加入到225 mL LB液體培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。獲得的雞肉背景增菌液和豬肉背景增菌液，通過平板計數(shù)法獲得兩種增菌初始濃度。同時將甲型副傷寒沙門菌標準菌株CMCC50001接種于LB液體培養(yǎng)基中進行過夜培養(yǎng)，平板菌落計數(shù)法獲得菌液的初始濃度，再用無菌水進行梯度稀釋。取500 μL不同稀釋度的甲型副傷寒沙門菌的菌液加入到500 μL的雞肉背景和豬肉背景增菌液中混勻，利用試劑盒法提取混合菌液的基因組DNA，進行PCR擴增，每個濃度3 次重復，同時以無菌水作為空白對照。

1.3.10 人工污染實驗

豬肉和雞肉樣品，每種樣品各稱取3 份，每份25 g，進行巴氏滅菌（75～90 ℃處理15～20 s）。滅菌后的樣品被1 mL較低濃度的甲型副傷寒沙門菌標準菌液CMCC50001進行污染，在均質(zhì)袋內(nèi)混勻，再轉(zhuǎn)入225 mL的LB液體培養(yǎng)基中增菌4～10 h，每隔2 h取1mL的增菌液提取DNA，進行PCR反應，同時以無菌水作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲型副傷寒沙門菌特異性基因驗證

利用BLASTN系統(tǒng)對甲型副傷寒沙門菌CMCC50973的全基因組序列數(shù)據(jù)進行分析，共獲得9個準特異性基因（與甲型副傷寒沙門菌具有同源性與其他微生物不具有同源性）分別gene_3037（321 bp）、gene_3044、gene_3057、gene_3056、gene_3269、gene_3270、gene_3268、gene_3106和gene_3105。將以上基因作為模板，利用Primer 5.0軟件設計引物，退火溫度值均在60 ℃左右，擴增片段大小在1 000 bp以下，并且分別以34 株不同血清型的沙門菌標準菌株和18 株非沙門菌的致病菌的基因組DNA為模板進行PCR驗證。其中3 個基因的PCR結(jié)果無非特異性條帶出現(xiàn)（表1），被認為甲型副傷寒沙門菌特異性基因（表2）。

1.4 衰弱指數(shù)（FI） 明確器官功能缺陷與臨床結(jié)果相關(guān)性 基于健康缺陷理論，測評不健康指標在所有指標中比例，常用于預期壽命計算和流行病學健康評估。FI≥0.25為衰弱，F(xiàn)I≤0.12為無衰弱，0.12～0.25為衰弱前期［14-15］。在一項納入33 706名60歲以上普外科患者的研究顯示，隨著FI增加，傷口發(fā)生率與感染率隨之增加（P＜0.001），并認為FI是急癥手術(shù)患者術(shù)前衰弱評估的有效方法［16］。該評估需要專業(yè)人員進行，在一定程度上限制了臨床應用。

2.2 PCR檢測體系的建立

通過比較分析，PA23和139-141引物同時擴增時沒有非特異性條帶產(chǎn)生。因此，選取PA23引物作為甲型副傷寒沙門菌的特異性引物并與139-141引物共同構(gòu)建PCR檢測的反應體系，引物序列見表2。通過優(yōu)化了兩對引物的濃度、Mg2＋濃度及Taq聚合酶濃度（優(yōu)化過程數(shù)據(jù)沒有呈現(xiàn)），最終反應體系見表3。該反應體系的陽性反應結(jié)果見圖1。

表3 甲型副傷寒沙門菌特異性基因Table 3 Serotype-speci fi c genes of S. Paratyphi A

圖1 檢測S. Paratyphi A的PCR反應陽性結(jié)果Fig. 1 Positive results obtained in the PCR detection of S. Paratyphi A

2.3 PCR檢測體系的特異性評價

通過對表1中菌株的DNA進行PCR檢測，對該體系的特異性進行驗證，結(jié)果見表2，139-141引物對于沙門菌模板均能獲得284 bp的擴增條帶，而對于非沙門菌的菌株無任何條帶；同時甲型副傷寒沙門菌菌株還可以擴增出159 bp的條帶，而該條帶在其他沙門菌和非沙門菌菌株中均無條帶產(chǎn)生。

圖2 S. Paratyphi A基因組DNA靈敏度檢測結(jié)果Fig. 2 Detection DNA sensitivity of S. Paratyphi A

2.4 PCR檢測體系的靈敏度評價

將甲型副傷寒沙門菌CMCC50001過夜培養(yǎng)，提取基因組DNA，測定其質(zhì)量濃度為32.4 ng/μL，用無菌水做10 倍系列梯度稀釋至324 fg/μL，每個稀釋度各取2μL作為模板進行PCR擴增。結(jié)果顯示，當模板濃度為32.4 pg/μL時，該反應體系的兩對引物均可獲得明顯的擴增條帶；當模板質(zhì)量濃度為3.24 pg/μL時，139-141能獲得明顯的擴增條帶，但PA23引物只能獲得較為模糊的電泳條帶，其結(jié)果較難判斷。該結(jié)果表明，該反應體系的DNA靈敏度為32.4 pg/μL，結(jié)果見圖2。

將過夜培養(yǎng)的甲型副傷寒沙門菌CMCC50001菌液，通過梯度稀釋分別獲得濃度為4.3×104CFU、4.3×103、4.3×102、4.3×101CFU/mL和4.3 CFU/mL的稀釋液。每個稀釋度的菌液通過熱裂解法，提取基因組DNA進行PCR驗證。結(jié)果表明，當菌液濃度為4.3×103CFU/mL和4.3×104CFU/mL時，該反應體系可以獲得兩條清晰電泳條帶（PA23和139-141引物）；而當菌液濃度為4.3×101CFU/mL，只有139-141引物擴增出目的條帶，檢測結(jié)果為陰性。因此，認為該反應體系的菌落靈敏度為4.3×103CFU/mL，結(jié)果見圖3。

圖3 S. Paratyphi A菌落靈敏度檢測結(jié)果Fig. 3 Sensitivity of PCR for detection of cells from S. Paratyphi A

2.5 PCR檢測體系的抗干擾能力評價

由超市購得雞胸肉和豬肉樣品，經(jīng)標準細菌學方法GB 4789.4—2008驗證無沙門菌。分別取25 g雞胸肉和豬肉樣品，經(jīng)過夜增菌培養(yǎng)后，獲得雞肉增菌的濃度為6.72×106CFU/mL，豬肉增菌液的濃度為4.87×107CFU/mL。取不同濃度的甲型副傷寒沙門菌分別和兩種增菌液混勻，提取混合菌的基因組DNA，進行PCR反應。如表4所示，當雞肉背景菌群濃度為4.16×106CFU/mL的中混有6.43×104CFU/mL的甲型副傷寒沙門菌時，該反應體系可以有效的擴增2條條帶，檢測結(jié)果為陽性，當甲型副傷寒沙門菌濃度為6.43×103CFU/mL，只有139-141引物獲得擴增條帶，說明樣品中含有沙門菌但不確定所含的沙門菌是甲型副傷寒沙門菌，檢測結(jié)果為陰性。如表5所示，當豬肉背景菌群濃度為4.87×107CFU/mL的中混有6.43×104CFU/mL的甲型副傷寒沙門菌時，該反應體系可以有效的擴增2 條條帶，檢測結(jié)果為陽性。

表4 雞肉背景菌群的存在對甲型副傷寒沙門菌檢測的影響Table 4 Detection of S. Paratyphi A from a natural background fl ora in chicken

表5 豬肉背景菌群的存在對甲型副傷寒沙門菌檢測的影響Table 5 Detection of S. Paratyphi A from a natural background fl ora in pork

2.6 PCR檢測體系的人工污染評價

將不同濃度的甲型副傷寒沙門菌分別接入無菌的雞胸肉和豬肉樣品，混勻后再轉(zhuǎn)入到225 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min增菌6、8、10 h和12 h。每份樣品取1 mL增菌液，提取基因組DNA，進行PCR檢測。在雞肉樣品，甲型副傷寒沙門菌污染的濃度分別7.53×103、7.53×102、7.53×101CFU和7.53 CFU，當增菌培養(yǎng)10 h以后，各個濃度污染的樣品檢出率均為100%。而增菌6 h，只能檢測出初始污染濃度為75.3 CFU/25 g的雞肉樣品，結(jié)果見表6。在豬肉樣品，甲型副傷寒沙門菌污染濃度分別為3.24×103、3.24×102、3.24×101CFU和3.24×100CFU，當增菌培養(yǎng)10 h以后，各個濃度污染的樣品檢出率均為100%。而增菌6 h，只能檢測出初始污染濃度為3.24×102CFU/25 g的豬肉樣品，結(jié)果見表7。綜上所述，對雞肉和豬肉樣品增菌培養(yǎng)10 h，該PCR檢測體系對甲型副傷寒沙門菌的檢出限能達到N CFU/25 g（0＜N＜10）。

表6 甲副傷寒沙門菌的人工污染雞肉樣品的檢測Table 6 Detection of S. Paratyphi A in artif i cially contaminated chicken samples

表7 甲副傷寒沙門菌的人工污染豬肉樣品的檢測Table 7 Detection of S. Paratyphi A in artif i cially contaminated pork samples

3 討 論

根據(jù)沙門菌的流行學特點，針對血清型的分子檢測技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)階段沙門菌檢測的研究熱點，而該檢測手段的關(guān)鍵是尋找特異的檢測靶點[23]。研究表明，可利用O抗原和H抗原的合成基因作為檢測靶點，進行PCR鑒定[2,15,24]。Levy等[25]根據(jù)O抗原、Vi抗原和H抗原的編碼基因作為檢測靶點，建立2 個多重PCR反應體系檢測血液中的傷寒沙門菌、甲型副傷寒沙門菌和乙型副傷寒沙門菌，特異性和靈敏度方面均能達到100%。然而，該方法需要多個檢測靶點才能鑒定某個血清型，而且檢測過程中需要兩個多重PCR反應增加了檢測過程的操作，近而增加了檢測結(jié)果的判斷難度；而且對于親緣關(guān)系比較近的血清型進行鑒定時，將會干擾目標血清型的鑒定，造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。有研究通過擴增STY4220基因，鑒定傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌，但是該擴增目標不能區(qū)分以上兩種血清型[26]。本研究利用比較基因組的方法，篩選了甲型副傷寒沙門菌的特異性基因gene_3268、gene_3270、gene_3106和gene_3105，只存在于該血清型的代表菌株CMCC50973中，設計引物在實驗室保存的甲型副傷寒沙門菌中能獲得正確PCR擴增條帶，但其他菌株中均無擴增條帶。139-141引物的靶點是invA基因，編碼沙門菌吸附和侵襲上皮細胞表面的侵染蛋白[27]。Rahn等[28]將invA基因作為檢測靶點建立了沙門菌檢測PCR反應體系，應用于112 個不同的沙門菌血清型，在643 個已知菌株中檢出率達到99%，對于33 株非沙門菌的腸道菌僅擴增出非目的大小的片段。在歐盟，將invA基因作為沙門菌檢測的標準PCR方法的靶基因[29]。本研究利用實驗保存的菌株特異性驗證表明，只有甲型副傷寒沙門菌的檢測能夠出現(xiàn)兩條擴增條帶，其他沙門菌血清型僅出現(xiàn)一條擴增條帶，非沙門菌無擴增條帶產(chǎn)生。不同DNA濃度的檢測可直接反映出體系中給引物與DNA模板的結(jié)合能力，本研究建立的檢測體系在DNA模板質(zhì)量濃度為32.4 pg/μL時能獲得清晰的2個擴增條帶，與前人建立的多重PCR檢測結(jié)果相似[15-16,30]。Grace等[26]以STY4220基因為靶點同時檢測甲型副傷寒沙門菌和傷寒沙門菌，其特異性能達到100%，菌落靈敏度為4.5×104～5.5×104CFU/mL，該菌落靈敏度低于本研究建立的PCR檢測方法的菌落靈敏度。在豬肉和雞肉這類生鮮樣品中含有大量的非檢測目的菌群，這群微生物的存在將會對該PCR反應體系的檢出限有一定的影響作用。通過抗干擾性評價分析，當豬肉和雞肉的背景菌群的濃度達到106CFU/mL和107CFU/mL時，該反應體系仍能檢測出混有104CFU/mL的甲型副傷寒沙門菌，以上說明該檢測體系具有較強的抗干擾能力。人工污染實驗表明，在雞肉和豬肉樣品中，污染1 CFU/25 g的甲型副傷寒沙門菌經(jīng)過10 h的增菌培養(yǎng)，PCR反應體系可獲得陽性結(jié)果。但是為了保證檢測結(jié)果的準確性，可將增菌時間延長到12 h。

綜上所述，本研究所鑒定的甲型副傷寒沙門菌檢測靶點特異性較好，建立的PCR檢測體系具有較高的靈敏度，能夠有效抵抗背景菌株的干擾，提供檢測的準確性，為甲型副傷寒沙門菌的檢測提供一種快速、靈敏、準確的方法。

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Mining of New Specif i c Molecular Targets and Development of a PCR Assay for Specif i c Detection of Salmonella Paratyphi A

ZHAI Ligong, WANG Junying, ZHANG Xiaoyu, MENG Xin, CUI Bao, ZHAO Wanqing, NIU Ping
(College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Chuzhou 233100, China)

In this study, four serotype-specif i c genes of Salmonella Paratyphi A were identif i ed by comparative genomics and PCR. A PCR assay based on the gene_3105 and invA gene was developed and evaluated for the detection of S. Paratyphi A. The electrophoresis pattern showed only two bright specif i c bands at 284 bp and 384 bp in S. Paratyphi A. The PCR protocol was optimized and the specif i city, sensitivity, anti-jamming capability and limit of detection (LOD) for artif i cially contaminated food were evaluated．The specif i city results showed two bright specif i c bands for S. Paratyphi A, only one specific band at 284 bp for other Salmonella serotypes, no specific bands for non-Salmonella strains. The sensitivity of the PCR assay was 32.4 pg/μL and 4.3 × 103CFU/mL for genomic DNA and pure colonies, respectively. In the presence of natural background fl ora enriched from chicken and pork breast samples, the detection limit was 6.43 × 104CFU/mL.In artif i cially contaminated chicken and pork, the detection limit was N CFU/25 g after 10 h enrichment (0 ＜ N ＜ 10). In conclusion, the PCR assay for the detection of S. Paratyphi A is specif i c and sensitive, and has a good application value and can be widely used in the fi eld of food safety.

Salmonella Paratyphi A; comparative genomics; serotype-specif i c genes; PCR

10.7506/spkx1002-6630-201802024

TS201.6

A

1002-6630（2018）02-0151-07

翟立公, 王俊穎, 張小雨, 等. 甲型副傷寒沙門菌特異性基因篩選及PCR檢測體系建立[J]. 食品科學, 2018, 39(2):151-157.

10.7506/spkx1002-6630-201802024. http://www.spkx.net.cn

ZHAI Ligong, WANG Junying, ZHANG Xiaoyu, et al. Mining of new specif i c molecular targets and development of a PCR assay for specif i c detection of Salmonella Paratyphi A[J]. Food Science, 2018, 39(2): 151-157. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802024. http://www.spkx.net.cn

2017-04-17

安徽高校自然科學研究重點項目（KJ2016A182）；安徽科技學院人才引進項目（SPYJ201602）；

安徽科技學院大學生創(chuàng)新項目（16ZCX34）

翟立公（1983—），男，講師，博士，研究方向為食源性致病菌檢測。E-mail：gavin340@126.com