鐘欣欣，曹立民，林 洪，史佩玉，隋建新*

酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段的制備及其對(duì)酶活力的抑制性能

鐘欣欣，曹立民，林 洪，史佩玉，隋建新*

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

針對(duì)導(dǎo)致黑色素沉淀的酪氨酸酶，制備了特異性卵黃抗體Fab’片段，研究其對(duì)酶活力的抑制效果并從動(dòng)力學(xué)角度進(jìn)行分析。結(jié)果表明，胃蛋白酶法制備Fab’片段的最適條件為：pH 4.0、反應(yīng)比（卵黃抗體-胃蛋白酶）1∶150（mg/U）、反應(yīng)時(shí)間8 h。經(jīng)免疫親和柱純化后可得理化性質(zhì)穩(wěn)定、純度大于95%的Fab’片段；該片段通過非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制酪氨酸酶活力，IC50為11.16 μmol/L，結(jié)合常數(shù)為5.79×105，抑制效果相比完整的卵黃抗體分子大大提高。本研究可為卵黃抗體Fab’片段作為潛在的酶活力抑制劑在食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用提供理論參考。

酪氨酸酶；卵黃抗體；蛋白酶解；Fab’片段；活性抑制

酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于生物體中，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，通過調(diào)控其活性可以調(diào)控黑色素的生成量，過量的黑色素形成導(dǎo)致人的色素沉著性疾?。ㄈ绾职?、黃褐斑、雀斑等）、果蔬褐變及蝦體黑變等，影響人的美觀與食品的質(zhì)量[1-2]。

卵黃抗體是蛋黃中存在的唯一的免疫球蛋白，具有高的特異性和針對(duì)性，其與抗原物質(zhì)特異性結(jié)合后可有效抑制抗原物質(zhì)的活性，根據(jù)此特性，卵黃抗體已被廣泛應(yīng)用于食品中控制病毒[3-4]、微生物[5-7]及生物酶[8-10]等。然而卵黃抗體分子質(zhì)量較大，遷移速率慢，容易受到基質(zhì)的影響，且常規(guī)提取方法得到的卵黃抗體中針對(duì)目標(biāo)抗原的特異性抗體含量少，在實(shí)際應(yīng)用中為達(dá)到有效抑制效果需要濃度較大的抗體[8-9]。另外卵黃抗體中Fc片段具有一定的免疫原性，對(duì)少數(shù)雞蛋過敏人群存在一定風(fēng)險(xiǎn)[11-12]，上述因素都在一定程度上限制了卵黃抗體在食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)的推廣應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外研究[13-19]表明，在適宜條件下，卵黃抗體可以被胃蛋白酶酶解生成Fab’片段，即抗原結(jié)合片段。Fab類抗體片段具有分子質(zhì)量小、流動(dòng)性及組織穿透能力較高、循環(huán)半衰期短、結(jié)合力高、免疫原性較低、可在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和基因工程操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)[20-21]。

本研究利用高效液相色譜檢測(cè)方法確定胃蛋白酶酶解卵黃抗體制備Fab’片段的最適條件，并對(duì)酶解混合物進(jìn)行免疫親和分離純化，得到高純度的酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段，同時(shí)對(duì)其理化性質(zhì)以及從動(dòng)力學(xué)角度對(duì)酪氨酸酶活力抑制作用進(jìn)行探究，為制備特異性卵黃抗體Fab’片段提供有效方法，為抑制劑抑制酶活力效果、探究影響因素和尋求增效因子提供了思路，可作為新型天然抑制劑抑制酪氨酸酶活力從而抑制黑色素的產(chǎn)生，廣泛用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)中提供了理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪氨酸酶卵黃抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備[22]；胃蛋白酶（酶活力3 000 U/mg）、辣根酶標(biāo)記兔抗雞IgG 美國(guó)Sigma公司；L-多巴 上海源葉生物科技有限公司；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxy succinimide，NHS） 上海浩然生物技術(shù)有限公司；3-巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA） 上海晶純?cè)噭┯邢薰荆贿^氧化氫（30%） 天津百世化工有限公司；硫酸（純度98%） 佳盟化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TSK-GEL SEC分子排阻柱 東曹（上海）生物有限公司；1260高效液相色譜（配有紫外檢測(cè)器） 美國(guó)Agilent公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 芬蘭Labsystems公司；Biosuplar 400 SPR表面等離子體共振儀 天津德尚科技有限公司；0.22 μm水系濾膜 天津市津騰設(shè)備有限公司；酪氨酸酶免疫親和柱由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 方法

1.3.1 胃蛋白酶酶解卵黃抗體條件的建立

從反應(yīng)體系pH值、反應(yīng)比（卵黃抗體-胃蛋白酶）、反應(yīng)時(shí)間3 個(gè)因素[16-19]進(jìn)行酶解條件的建立。卵黃抗體用50 mmol/L的乙酸鈉緩沖液稀釋為1 mg/mL，與胃蛋白酶溶液按表1條件在37 ℃水浴中反應(yīng)，用pH 9.0的Tris溶液將體系pH值調(diào)整到7.5左右，以終止酶解反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)0.22 μm無菌濾膜后進(jìn)行高效液相色譜分析。

表1 卵黃抗體酶解條件的建立Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of egg yolk antibody

1.3.2 高效液相色譜法檢測(cè)酶解反應(yīng)物

參照張茜等[23]的研究方法，具體條件如下：TSKgel G3000 SWXL凝膠色譜柱，流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.0，含0.3 mol/L NaCl）。柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min，上樣量20 μL，在紫外檢測(cè)器280 nm波長(zhǎng)處采集數(shù)據(jù)。

1.3.3 Fab’片段的純化及純度鑒定

參照實(shí)驗(yàn)室前期研究[24]，采用免疫親和柱純化酶解后的Fab’片段：用10 mL 0.01 mol/L的PBS（pH 7.4）平衡柱填料體積為4.5 mL的免疫親和柱，一次上樣4 mL酶解液，10 mL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5，含0.15 mol/L NaCl）洗滌，8 mL 0.2 mol/L甘氨酸溶液（pH 2.7，含0.5 mol/L NaCl）洗脫，收集洗脫液，超濾，經(jīng)0.22 μm無菌濾器除雜進(jìn)行高效液相色譜鑒定。1.3.4 Fab’片段的理化穩(wěn)定性分析

研究酸堿穩(wěn)定性時(shí)，分別用PBS（pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）稀釋酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段至1 mg/mL，室溫放置10 min后，將各溶液pH值調(diào)至中性并稀釋至1 μg/mL，間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法分析Fab’片段活性。研究熱穩(wěn)定性時(shí)，用pH 7.4的PBS稀釋至1 μg/mL，水?。囟?5、30、40、50、60、70、80、90 ℃）孵育10 min，將各孵育溶液冷卻至室溫后，間接ELISA法[23]測(cè)定Fab’片段活性。

1.3.5 Fab’片段對(duì)酪氨酸酶活力抑制分析

酶活力測(cè)定參照Yi Wei等[25]方法并改進(jìn)：將50 μL 0.15 mg/mL酪氨酸酶液和100 μL 0.2 mol/L的PBS（pH 6.8）加入到96 孔板中，加入50 μL 1 mmol/L的L-多巴，492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其在第1、3分鐘的吸光度。每1 mL酶液在1 min內(nèi)吸光度升高0.01定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

酶活力抑制率測(cè)定：0.15 mg/mL酪氨酸酶溶液和不同濃度抗體常溫按照體積比1∶1混合10 min。將50 μL 0.2 mol/L的PBS（pH 6.8）和100 μL混合液加入到96 孔板中，如前述操作測(cè)定酪氨酸酶活力，陰性卵黃抗體作對(duì)照。抑制率計(jì)算公式如下：

為確定酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段對(duì)酪氨酸酶的半抑制率（IC50），測(cè)定不同濃度特異性卵黃抗體Fab’片段（1.11、2.22、4.44、11.11、22.22 μmol/L）對(duì)酪氨酸酶的抑制活性，相同濃度的胰脂肪酶卵黃抗體作陰性對(duì)照，粗提卵黃抗體作陽性對(duì)照。分別計(jì)算特異性卵黃抗體Fab’片段和粗提卵黃抗體的

雙倒數(shù)法作圖分析酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段對(duì)酪氨酸酶活力抑制的類型，不同質(zhì)量濃度Fab’片段（0、0.2、0.5 mg/mL），在不同濃度L-多巴（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L）條件下測(cè)定酪氨酸酶活力，以酶反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖[28]。

1.3.6 Fab’片段與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)測(cè)定

采用表面等離子體共振技術(shù)測(cè)定Fab’片段與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)[29]，純水清洗芯片，4 ℃置于0.01 mol/L MPA浸泡12 h，100%乙醇清洗，室溫下置于EDC-NHS（0.1 mol/L EDC與0.025 mol/L NHS體積比1∶1）浸泡1 h，乙醇清洗晾干。

將經(jīng)處理后的芯片固定于表面等離子體共振儀，以35 μL/min的流速通入PBS采集背景，信號(hào)穩(wěn)定后，通入10 mg/mL酪氨酸酶，信號(hào)穩(wěn)定后通入PBS，信號(hào)穩(wěn)定后通入不同質(zhì)量濃度Fab’片段（0.25、0.5、1.0 mg/mL），不同質(zhì)量濃度粗提卵黃抗體（10、20、30 mg/mL）作對(duì)比，信號(hào)穩(wěn)定后通入PBS溶液沖洗至信號(hào)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，記錄信號(hào)變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶酶解卵黃抗體條件分析

圖1 胃蛋白酶酶解卵黃抗體的動(dòng)態(tài)變化圖Fig. 1 Dynamic changes of egg yolk IgY during pepsin digestion

如圖1所示，在卵黃抗體與胃蛋白酶反應(yīng)體系中，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，完整的卵黃抗體分子逐漸減少，而對(duì)應(yīng)的Fab’片段逐漸增加，除主要的Fab’片段外，隨著酶解的進(jìn)行，一些分子質(zhì)量更小的片段也開始出現(xiàn)。根據(jù)卵黃抗體峰面積的變化，可以定量計(jì)算卵黃抗體的酶解率，比傳統(tǒng)的蛋白檢測(cè)技術(shù)[16-19]（如十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）具有分析速率快、靈敏度高、重復(fù)性高、穩(wěn)定性好、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[30-31]。

圖2 pH值（A）、反應(yīng)比（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）對(duì)酶解產(chǎn)物中卵黃抗體酶解率的影響Fig. 2 Effect of reaction conditions on the hydrolysis eff i ciency of egg yolk IgY

研究發(fā)現(xiàn)，卵黃抗體的酶解率隨著pH值的升高而降低，在pH 3.0～4.0之間酶解率較高，pH值高于5.0后酶解反應(yīng)不再進(jìn)行（圖2A），考慮到低pH值可能對(duì)卵黃抗體活性產(chǎn)生影響，選擇pH 4.0作為最終反應(yīng)體系的pH值；而反應(yīng)比對(duì)酶解率的影響呈先增大后減小的趨勢(shì)，反應(yīng)比在1∶150時(shí)達(dá)到最大且維持不變，直到1∶600后酶解率迅速下降（圖2B）；整個(gè)反應(yīng)在達(dá)到8 h后，所有的卵黃抗體幾乎被完全水解（圖2C）。

因此，本研究最終確定的酶解條件pH 4.0、反應(yīng)比1∶150、反應(yīng)時(shí)間8 h，這與Akita等[13]研究的緩沖液pH 4.2、酶解時(shí)間9 h基本一致；而與張茜等[23]胃蛋白酶與卵黃抗體的質(zhì)量比1∶20、緩沖液pH 4.2、酶解時(shí)間6 h的條件略有差異，這可能主要是由于胃蛋白酶活力的不同所導(dǎo)致。

2.2 Fab’片段純度測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，酶解完成后，反應(yīng)體系中的卵黃抗體分子被完全分解成為不同分子質(zhì)量的片段，經(jīng)免疫親和純化后，許多出峰時(shí)間在12 min以后的小分子片段已經(jīng)去除，僅得到保留時(shí)間在11.6 min的Fab’片段，通過對(duì)比峰面積，計(jì)算純化后的Fab’片段純度達(dá)到95%以上，相比于張茜等[23]經(jīng)凝膠層析分離之后純度達(dá)90%以上，鄒強(qiáng)等[16]利用色譜分析達(dá)到91%的純度，本研究采用親和層析所得Fab’片段純度有所提高。

圖3 Fab’片段純度測(cè)定的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC pro fi les of Fab’ fragment before and after puri fi cation

2.3 Fab’片段的理化穩(wěn)定性分析

圖4 pH值（A）和溫度（B）對(duì)于Fab’片段免疫活性的影響Fig. 4 Effect of pH (A) temperature (B) on immunological activity of Fab’ fragment

酸堿度和溫度往往是限制蛋白質(zhì)類生物制品應(yīng)用的主要因素。pH值穩(wěn)定性結(jié)果表明，酶解得到的酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段在pH 4.0～8.0具有較高的免疫活性，但pH值低于3.0時(shí)免疫活性喪失，高于9.0時(shí)開始下降（圖4A）。同時(shí)其在25～70 ℃溫度范圍內(nèi)具有較高的免疫活性，當(dāng)溫度高于60 ℃時(shí)，免疫活性開始降低（圖4B）。

2.4 Fab’片段對(duì)酪氨酸酶活力的抑制活性

Fab’片段和粗提卵黃抗體對(duì)酪氨酸酶活力的抑制表現(xiàn)出濃度依賴性且存在顯著性差異（P＜0.05），濃度增大，抑制率升高（圖5），計(jì)算得其IC50分別為11.16、29.74 μmol/L。達(dá)到相同的抑制率，所需粗提卵黃抗體的量是Fab’片段的2.66 倍，F(xiàn)ab’片段對(duì)酪氨酸酶的抑制效果要顯著優(yōu)于粗提卵黃抗體，分析原因一是所得Fab’片段分子質(zhì)量小、特異性強(qiáng)、穿透能力高，能夠更好地與酶的結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合，從而起到顯著的抑制作用；二是粗提卵黃抗體特異性抗體含量少，分子質(zhì)量大，由于其自身結(jié)構(gòu)和雜蛋白的存在一定程度上阻礙了其與酶結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。

圖5 卵黃抗體對(duì)酪氨酸酶活力抑制作用Fig. 5 Inhibitory effect of egg yolk antibody on tyrosinase activity

圖6 Fab’片段對(duì)酪氨酸酶的抑制類型Lineweaver-Burk圖Fig. 6 Lineweaver-Burk plot showing non-competitive binding of Fab’to tyrosinase

酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)顯示反應(yīng)速率隨著Fab’片段質(zhì)量濃度的增加而減小，但Km不變（圖6），說明Fab’片段對(duì)酪氨酸酶的抑制屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。在此類抑制中，酶與底物和抑制劑的結(jié)合位點(diǎn)不同，所以酶與抑制劑結(jié)合后還可以與底物結(jié)合，因此推斷Fab’片段對(duì)酪氨酸酶的抑制作用機(jī)制可能是Fab’片段通過抗原抗體的特異性識(shí)別與酪氨酸酶結(jié)合，導(dǎo)致酪氨酸酶構(gòu)象的改變或是在酶的底物結(jié)合中心附近形成空間位阻，影響了酶與底物的結(jié)合，從而降低酶的催化反應(yīng)，發(fā)揮了抑制酶活力的效果。

2.5 Fab’片段與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)

表2 卵黃抗體結(jié)合常數(shù)Table 2 Binding constants of egg yolk antibody and Fab’ fragment

表面等離子體共振技術(shù)技術(shù)相比于傳統(tǒng)的ELISA方法[23]，能更為直觀地揭示抗原抗體的動(dòng)態(tài)結(jié)合和解離過程，量化抗體對(duì)抗原的結(jié)合能力。由表2可看出，酶解后得到的特異性卵黃抗體Fab’片段與酪氨酸酶的結(jié)合常數(shù)KA比粗提卵黃抗體高1 個(gè)數(shù)量級(jí)，表明其與酪氨酸酶的結(jié)合能力要強(qiáng)于粗卵黃抗體，進(jìn)一步顯示了Fab’片段對(duì)酶活力抑制的優(yōu)越性。

3 結(jié) 論

通過優(yōu)化pH值、反應(yīng)比和酶解時(shí)間建立了胃蛋白酶酶解卵黃抗體的最適條件：乙酸鈉緩沖液pH 4.0、卵黃抗體與胃蛋白酶反應(yīng)比1∶150（mg/U）、反應(yīng)時(shí)間8 h；在此條件下水解卵黃抗體并結(jié)合免疫親和柱純化，可得到純度為95%以上的Fab’片段；該片段可通過非競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制酪氨酸酶的活性，IC50為11.16 μmol/L，結(jié)合常數(shù)為5.79×105，且理化性質(zhì)穩(wěn)定。本研究結(jié)果為酪氨酸酶特異性Fab’片段的制備及其酶活力抑制性能研究提供了理論支持，期望下一步為將Fab’片段作為潛在酶活力抑制劑應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥等行業(yè)提供參考。

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Production and Inhibitory Effect of Specif i c Egg Yolk Antibody Fab’ Fragment against Tyrosinase

ZHONG Xinxin, CAO Limin, LIN Hong, SHI Peiyu, SUI Jianxin*
(College of Food Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

The production of Fab’ fragment from specif i c egg yolk antibody against tyrosinase and its inhibitory activity on tyrosinase were investigated in this paper. The optimal conditions were obtained as follows: pH 4.0, ratio of egg yolk antibody to pepsin 1:150 (mg/U), and reaction time 8 h. Fab’ fragment purif i ed by immunoaff i nity column chromatography to a purity of over 95% exhibited good physicochemical stability. It was demonstrated as a non-competitive inhibitor with an IC50value of 11.16 μmol/L and a binding constant of 5.79 × 105, whose inhibitory effect was much higher than that of IgY. The results of this study can provide a theoretical basis for the application of egg yolk antibody Fab’ fragments in food,cosmetics and pharmaceutical industries as a potential enzyme inhibitor.

tyrosinase; egg yolk antibody; enzymatic proteolysis; fragment antigen binding (Fab’ fragment); enzyme activity inhibition

10.7506/spkx1002-6630-201802019

TS201.6

A

1002-6630（2018）02-0119-05

鐘欣欣, 曹立民, 林洪, 等. 酪氨酸酶特異性卵黃抗體Fab’片段的制備及其對(duì)酶活力的抑制性能[J]. 食品科學(xué), 2018,39(2): 119-123.

10.7506/spkx1002-6630-201802019. http://www.spkx.net.cn

ZHONG Xinxin, CAO Limin, LIN Hong, et al. Production and inhibitory effect of specif i c egg yolk antibody Fab’ fragment against tyrosinase[J]. Food Science, 2018, 39(2): 119-123. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802019. http://www.spkx.net.cn

2016-12-04

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（201413061）；山東省農(nóng)業(yè)應(yīng)用創(chuàng)新專項(xiàng)

鐘欣欣（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：zhongxinxin2014@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：隋建新（1981—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：suijianxin@ouc.edu.cn