王 燦，莫湘濤，張 峰，吳柳娟，李 躺，夏立秋*

抗腫瘤靶向工程菌的高密度發(fā)酵及菌粉研制

王 燦，莫湘濤，張 峰，吳柳娟，李 躺，夏立秋*

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，微生物分子生物學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

為獲得侵襲性抗腫瘤靶向工程菌株EcNA高菌體濃度的培養(yǎng)基配方，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)菌體濃度影響最顯著的因素為酵母抽提物、K2HPO4用量，對(duì)顯著影響因素進(jìn)行中心組合試驗(yàn)響應(yīng)面分析。結(jié)果表明最佳培養(yǎng)基成分為：可溶性淀粉2 g/L、酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO414.26 g/L、KH2PO43 g/L、MgSO40.3 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量3%。發(fā)酵后溶液中菌體OD600nm達(dá)到7.602，菌體生物量達(dá)到2.96×109CFU/mL，比優(yōu)化前提高了78.3%。以凍干保護(hù)劑在冷凍干燥過(guò)程中對(duì)工程菌株的保護(hù)效果為研究對(duì)象，通過(guò)正交試驗(yàn)得到制成菌粉的最佳保護(hù)劑配方為脫脂乳14.25 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、抗壞血酸鈉3 g/100 mL，優(yōu)化后菌體凍干粉存活率可達(dá)86.32%，利于制成延長(zhǎng)貯存期的口服菌粉膠囊。

抗腫瘤靶向工程菌；高密度發(fā)酵；響應(yīng)面分析法；凍干保護(hù)劑；菌粉制劑

近年來(lái)，細(xì)菌靶向治療腫瘤已成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)，利用沙門菌工程菌進(jìn)行腫瘤治療[1]、雙歧桿菌作為靶向治療載體[2]、產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒素作為潛在腫瘤靶向藥物[3]等細(xì)菌靶向治療腫瘤的研究都有相關(guān)報(bào)道。大腸桿菌Nissle 1917（Escherichia coli Nissle 1917，EcN）作為腸道益生菌而被廣泛使用[4-5]，具有治療傳染性腹瀉尤其是嬰幼兒腹瀉[6]、防止新生兒消化道內(nèi)病原菌定殖[7-8]、緩解炎癥性腸炎[9-10]、調(diào)節(jié)免疫[11]等功能。通過(guò)綠色熒光蛋白追蹤技術(shù)，發(fā)現(xiàn)EcN對(duì)實(shí)體腫瘤具有很好的靶向性[12]，EcN不僅可以在腫瘤富集區(qū)聚集，還可以在腫瘤低氧區(qū)和壞死區(qū)定植，受腫瘤大小及腫瘤微環(huán)境等因素的限制較小。EcN進(jìn)行遺傳改造得到的EcNA菌株，對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞和4T1乳腺癌細(xì)胞具有很好的侵襲活性，其表達(dá)的天青蛋白對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞、4T1乳腺癌細(xì)胞和HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的靶向性抑制作用，因此EcNA具有顯著的靶向抗腫瘤效果[13]?；谏鲜鎏匦?，本室構(gòu)建的能分泌天清蛋白的抗腫瘤靶向工程菌株EcNA，呈現(xiàn)出潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值[14]。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化EcNA菌株的培養(yǎng)基配方，既有利于菌株的高密度發(fā)酵、提高工程菌菌體濃度，又能推遲菌體老化時(shí)間、延緩抗腫瘤靶向工程菌株的功能，同時(shí)還能減少培養(yǎng)體積，縮短生產(chǎn)周期，減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本。工程菌EcNA在原始發(fā)酵液狀態(tài)下不宜直接服用，同時(shí)需要解決短存放期與貨架期等問(wèn)題。采用真空冷凍干燥技術(shù)將工程菌制成固體菌粉，后續(xù)加工制成口服膠囊劑，有利于其運(yùn)輸及貨架期的延長(zhǎng)。在冷凍干燥過(guò)程中添加保護(hù)劑，可以有效改變冷凍干燥時(shí)菌體細(xì)胞所處的物理、化學(xué)環(huán)境，以此減輕或防止冷凍干燥對(duì)菌體細(xì)胞的損害，使工程菌最大程度保持原有的理化特性和生物活性，從而利于保持抗腫瘤菌體藥物的功能作用。研究表明，單一保護(hù)劑保護(hù)效果有限[15-17]，致使其保護(hù)作用不理想，研制復(fù)合型保護(hù)劑是提高菌體存活率的重要方法[18]。本研究采用抗腫瘤靶向工程菌高密度發(fā)酵，并優(yōu)化菌體粉劑保護(hù)劑配方，期望得到顯著提高菌體功能及其存活率的復(fù)合型保護(hù)劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

EcN工程菌EcNA為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建表達(dá)Azurin的工程菌[13]，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、NaCl、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇（均為分析純）、葡聚糖（生化試劑）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸鈉（分析純） 上海笛柏生物科技有限公司；海藻糖（分析純） 美國(guó)Sigma公司；胰蛋白胨、酵母抽提物、瓊脂粉 英國(guó)Oxoid公司；脫脂乳 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Format 900 series超低溫冰箱 美國(guó)Thermo公司；SmartspecTM3000分光光度計(jì) 美國(guó)Bio-Rad公司；ZWY-C2112培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；FD-1干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子復(fù)壯

取菌種保藏液10 μL，劃線涂布于含有氯霉素和卡那霉素的LB平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h。

1.3.2 種子培養(yǎng)

從復(fù)壯的LB平板上挑取單菌落接種于20 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、170 r/min的恒溫振蕩器上培養(yǎng)10 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將種子液以3%（V/V）的接種量接入裝有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。

1.3.4 菌體濃度的測(cè)定

采用光密度（optical density，OD）表征菌體濃度，即從培養(yǎng)瓶中取菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其OD600nm，重復(fù)3 次。

1.3.5 菌粉的制備

將發(fā)酵液轉(zhuǎn)移至離心管中，6 000 r/min離心10 min，收集菌體。加入等體積生理鹽水洗滌，6 000 r/min離心10 min，收集菌體，重復(fù)洗滌3次。對(duì)洗滌后的菌體收集物，加入等體積保護(hù)劑并攪拌均勻，置于-80 ℃冰箱預(yù)凍2 h，隨后立即轉(zhuǎn)入超低溫真空冷凍干燥機(jī)凍成干粉狀。

1.3.6 菌體存活率的測(cè)定

向菌粉中加入與凍干前相等體積的生理鹽水進(jìn)行復(fù)水，再稀釋涂布活菌計(jì)數(shù)，測(cè)定凍干存活率，重復(fù)3 次。

1.3.7 培養(yǎng)基組分及菌粉配方優(yōu)化

1.3.7.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)

分別加入4 g/L的可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖和甘露醇至酵母抽提物15 g/L、MgSO40.25 g/L、K2HPO42.3 g/L、KH2PO41.5 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量2%的無(wú)碳源培養(yǎng)基中，篩選出較適發(fā)酵碳源；分別加入25 g/L的酵母抽提物、牛肉膏、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和棉籽粉至可溶性淀粉4 g/L、MgSO40.25 g/L、K2HPO42.3 g/L、KH2PO41.5 g/L、微量元素母液2 mL/L、接種量2%的無(wú)氮源培養(yǎng)基中，篩選出較適氮源。參考重組大腸桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化的研究[19-21]，選擇磷酸鹽、MgSO4、微量元素等作為初始發(fā)酵培養(yǎng)基組成部分，然后進(jìn)行單因素試驗(yàn)確定各因素的較適范圍。

1.3.7.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從可溶性淀粉、酵母抽提物、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、微量元素母液用量、接種量中篩選出對(duì)工程菌生物量有顯著性影響的因素，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平（1，-1），以O(shè)D600nm作為目標(biāo)值。Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in Plackett-Burman design

1.3.7.3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇酵母抽提物和KH2PO4這兩種培養(yǎng)基組分進(jìn)行中心組合試驗(yàn)優(yōu)化。中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of factors used in central composite design

1.3.7.4 凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化

根據(jù)文獻(xiàn)[13-15]，在菌粉制作的過(guò)程中，選取抗壞血酸鈉、葡聚糖、海藻糖、甘露醇、脫脂乳、蔗糖6 種凍干保護(hù)劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到各因素的較適質(zhì)量濃度范圍，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表3所示。

表3 凍干保護(hù)劑單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Levels of factors used in one-factor-at-a-time design

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取抗壞血酸鈉、脫脂乳和蔗糖作為復(fù)合凍干保護(hù)劑組分。為獲得復(fù)合保護(hù)劑最佳保護(hù)效果，最后通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到各組分的最適用量。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 碳源及氮源的篩選結(jié)果

圖1 不同碳源（A）及氮源（B）對(duì)工程菌EcNA菌體濃度的影響Fig. 1 Effects of different carbon sources (A) and nitrogen sources (B)on EcNA concentration

由圖1A可知，在發(fā)酵抗腫瘤靶向工程菌EcNA的過(guò)程中，培養(yǎng)基內(nèi)加入可溶性淀粉對(duì)菌體濃度提高的效果最顯著。從圖1B可以看出，酵母抽提物是幾種主要氮源中最適合EcNA發(fā)酵的氮源。故選擇可溶性淀粉與酵母抽提物進(jìn)行下一步的試驗(yàn)。

2.1.2 培養(yǎng)基組分單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2 培養(yǎng)基中各組分用量對(duì)工程菌EcNA菌體濃度的影響Fig. 2 Effects of different medium components on EcNA concentration

由圖2可知，隨酵母抽提物、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、微量元素母液用量及接種量的升高，發(fā)酵后的菌體濃度均有上升。其中隨著可溶性淀粉用量的升高，發(fā)酵后的菌體濃度呈下降趨勢(shì)，當(dāng)可溶性淀粉質(zhì)量濃度超過(guò)8 g/L時(shí)，菌體濃度開始回升，但低于2 g/L時(shí)的菌體濃度，綜合考慮發(fā)酵成本，選擇2 g/L作為可溶性淀粉的較適質(zhì)量濃度。

低質(zhì)量濃度時(shí)，OD600nm隨酵母抽提物、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、微量元素用量及接種量的升高而增加，用量過(guò)高后，OD600nm開始下降。加入高濃度的酵母抽提物，培養(yǎng)基的黏度增大，不利于工程菌的發(fā)酵。過(guò)量的磷酸鹽會(huì)促進(jìn)乙酸等發(fā)酵抑制物的生成，阻礙正常發(fā)酵。高質(zhì)量濃度的MgSO4會(huì)使菌體內(nèi)的滲透壓升高，不利于工程菌的生長(zhǎng)。而高濃度含重金屬離子的微量元素會(huì)導(dǎo)致菌體損傷，影響高密度發(fā)酵。從圖2可知，40 g/L酵母抽提物、3 g/L KH2PO4、12 g/L K2HPO4、0.3 g/L MgSO4、2 mL/L微量元素母液、3%接種量均能得到較高的OD600nm值。

2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及回歸分析

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Plackett-Burman design with experimental results

利用Design-Expert 8.06軟件對(duì)表4的結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析，得到表5所示的Plackett-Burman試驗(yàn)中各因素回歸分析結(jié)果。由表5可知，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的7 種考察因素中，酵母抽提物用量的P值小于0.01，對(duì)工程菌株OD600nm的影響是極顯著的，且E為正值，說(shuō)明酵母抽提物在高水平時(shí)對(duì)該菌株高密度發(fā)酵有利。K2HPO4的P值小于0.05，對(duì)工程菌株OD600nm的影響是顯著的，其E為負(fù)值，說(shuō)明K2HPO4用量在低水平時(shí)利于工程菌的發(fā)酵。酵母抽提物和K2HPO4用量為發(fā)酵培養(yǎng)基的兩個(gè)重要影響因素。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)中各因素的回歸分析Table 5 Regression analysis of Plackett-Burman design

2.3 中心組合試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出來(lái)的顯著影響因素酵母抽提物和K2HPO4用量，對(duì)這兩個(gè)因素編碼并進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，其設(shè)計(jì)如表6所示。以培養(yǎng)16 h后工程菌株發(fā)酵液的OD600nm為響應(yīng)值。試驗(yàn)中各組均設(shè)置3 個(gè)平行，中心組合試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

通過(guò)方差分析，可得到二次多項(xiàng)式回歸方程為：Y=7.46＋0.07X1-0.16X2＋0.4X1X2-2.08-1.07。由表7可知，該模型的F值為93.14，P值小于0.000 1，說(shuō)明該模型是顯著的。模型的失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型穩(wěn)定性較好。模型的決定系數(shù)R2為0.985 2，說(shuō)明模型對(duì)響應(yīng)值的預(yù)測(cè)是準(zhǔn)確的。相關(guān)調(diào)整系數(shù)為0.974 6，說(shuō)明97.46%的數(shù)據(jù)可以由這個(gè)方程解釋。因此，該二次方程能夠較好地?cái)M合真實(shí)的響應(yīng)面，可用來(lái)預(yù)測(cè)工程菌株菌體濃度的變化。

表6 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Central composite design with experimental results

表7 中心組合試驗(yàn)中各因素的回歸分析Table 7 Regression analysis of central composite design

等高線圖中兩因素作用構(gòu)成的圖形越橢圓，交互作用越強(qiáng)，由圖3可知，酵母抽提物和K2HPO4在工程菌EcNA的發(fā)酵過(guò)程中存在交互作用。由響應(yīng)面圖可以看出，該模型存在極大值。對(duì)所得二次多項(xiàng)式回歸方程取一階偏導(dǎo)等于零，聯(lián)立方程求解可得：當(dāng)酵母抽提物用量50.3 g/L、K2HPO4用量14.26 g/L時(shí)，能得到OD600nm的預(yù)測(cè)極大值為7.467。按此配方進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，測(cè)得OD600nm為7.602，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明了該方程的擬合性好。采用梯度稀釋平板計(jì)數(shù)法，測(cè)得該條件下工程菌株的實(shí)際濃度為2.96×109CFU/mL。

圖3 酵母抽提物與K2HPO4用量對(duì)工程菌EcNA菌體濃度影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 3 Response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast extract and dipotassium phosphate on EcNA concentration

2.4 凍干保護(hù)劑的優(yōu)化

2.4.1 凍干保護(hù)劑單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖4 4 種凍干保護(hù)劑對(duì)EcNA菌體存活率影響Fig. 4 Effects of four cryoprotectants on survival rate of EcNA

海藻糖和甘露醇在各種質(zhì)量濃度下，菌體凍干存活率均小于1%。脫脂乳、蔗糖、葡聚糖、抗壞血酸鈉作為保護(hù)劑，菌體凍干存活率如圖4所示，可看出運(yùn)用蔗糖、抗壞血酸鈉和脫脂乳作為凍干保護(hù)劑能得到較高的菌體存活率。故選擇蔗糖、抗壞血酸鈉和脫脂乳進(jìn)行下一步的正交試驗(yàn)。

2.4.2 凍干保護(hù)劑正交試驗(yàn)及方差分析

表8 L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析Table 8 Experimental results and range analysis of L9 (34) orthogonal array design

采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)研究了凍干保護(hù)劑對(duì)抗腫瘤靶向工程菌體存活率的影響，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析如表8所示，其方差分析結(jié)果如表9所示。對(duì)表8進(jìn)行數(shù)學(xué)擬合可得方程：Y=-30.71-61.02A＋29.34B＋7.68C＋5.68A2-1.03B2＋3.42C2。由方程可知，當(dāng)A=3、B=14.245 8、C=3時(shí)，Y取得極大值。這與正交試驗(yàn)極差分析得到的較優(yōu)組合A1B2C3，即A=3、B=15、C=3吻合。由表9可知，蔗糖、脫脂乳、抗壞血酸鈉均對(duì)凍干菌粉存活率有顯著影響，且影響因素順序?yàn)椋嚎箟难徕c質(zhì)量濃度＞蔗糖質(zhì)量濃度＞脫脂乳質(zhì)量濃度。

表9 正交試驗(yàn)方差分析Table 9 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮稱量誤差，最終選定最優(yōu)水平為蔗糖質(zhì)量濃度3 g/100 mL、脫脂乳質(zhì)量濃度14.25 g/100 mL、抗壞血酸鈉質(zhì)量濃度3 g/100 mL，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。此條件下，凍干菌粉的存活率達(dá)到（86.32±3.04）%。

3 討 論

合理的培養(yǎng)基組成是高密度發(fā)酵的前提，直接影響工程菌的生長(zhǎng)增殖及目的基因的表達(dá)。本研究中，利用本室構(gòu)建的抗腫瘤靶向工程菌株EcNA[13]，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出兩種對(duì)工程菌株菌體濃度影響顯著的成分為酵母抽提物、K2HPO4。酵母抽提物富含氨基酸、多肽、呈味核苷酸、B族維生素、生長(zhǎng)因子和微量元素，被廣泛用于微生物培養(yǎng)[22]，是發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)質(zhì)天然營(yíng)養(yǎng)源[23-24]。K2HPO4等磷酸鹽能調(diào)節(jié)工程菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)物代謝[25]，是微生物生長(zhǎng)代謝不可或缺的營(yíng)養(yǎng)成分，對(duì)菌體內(nèi)滲透壓和微生物代謝酶系的活力[26]有重要影響，因此控制適宜的K2HPO4用量對(duì)高密度發(fā)酵具有極其重要的意義。

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，選取酵母抽提物、K2HPO4進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，建立了二次擬合回歸模型，根據(jù)模型得到了這兩個(gè)成分的最佳比例為酵母抽提物50.3 g/L、K2HPO414.26 g/L，發(fā)酵后菌體濃度OD600nm達(dá)到7.602，生物量達(dá)到2.96×109CFU/mL，比優(yōu)化前提高了78.3%。

菌粉制劑通過(guò)除去水分，降低了水分遷移對(duì)貨架期的影響，有利于延長(zhǎng)貨架期[27]，而真空冷凍干燥法是菌粉制作中最安全高效的方法之一[28]。實(shí)驗(yàn)完成對(duì)抗腫瘤靶向工程菌EcNA的發(fā)酵條件優(yōu)化，顯著提高菌體的生物量后，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了工程菌冷凍干燥過(guò)程中保護(hù)劑的配比，研制了含有抗壞血酸鈉、蔗糖、脫脂乳的復(fù)合保護(hù)劑。其中脫脂乳能穩(wěn)定細(xì)胞膜，提供細(xì)胞保護(hù)衣以免細(xì)胞損傷[29]。蔗糖能干擾高度黏稠或玻璃態(tài)的鹽以免細(xì)胞流體凍結(jié)[30]?？箟难猁}能減少環(huán)境中氧氣對(duì)凍干菌粉的影響[31]。獲得的最佳保護(hù)劑配方為脫脂乳14.25 g/100 mL、蔗糖3 g/100 mL、抗壞血酸鈉3 g/100 mL，凍干后菌粉中菌體存活率可達(dá)86.32%。

本研究通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化法大幅提高了工程菌的產(chǎn)量，同時(shí)也提高天青蛋白的比生產(chǎn)率（單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量）以及單位體積的抗腫瘤活性，通過(guò)菌粉的制備，簡(jiǎn)化了高活力菌體的保藏與運(yùn)輸條件，推動(dòng)了靶向抗腫瘤藥物的發(fā)展，有利于長(zhǎng)貨架期的抗腫瘤靶向活菌膠囊劑的研制。但該抗腫瘤工程菌粉藥物的臨床效果與安全性還需進(jìn)一步研究。

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High Cell Density Fermentation of Tumor-Targeting Engineered Strain and Development of Lyoprotectant Formulation for Its Freeze-Drying

WANG Can, MO Xiangtao, ZHANG Feng, WU Liujuan, LI Tang, XIA Liqiu*
(Hunan Provincial Key Laboratory of Microbial Molecular Biology, State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish,College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China)

The present study aimed to optimize the medium formulation for high cell density culture of an invasive tumortargeting engineered strain, EcNA. Using one-factor-at-a-time method and a Plackett-Burman design, yeast extract and dipotassium phosphate were found to be the most important factors affecting cell concentration. The optimal medium,as determined using central composite design and response surface methodology, was composed of soluble starch 2 g/L,yeast extract 50.3 g/L, K2HPO414.26 g/L, KH2PO43 g/L, MgSO40.3 g/L, and trace element stock solution 2 mL/L, and the inoculum amount was 3%. The optical density at 600 nm (OD600nm) of the bacterial culture obtained using the optimized medium reached 7.602 and the biomass was 2.96 × 109CFU/mL, which was 78.3% higher than that before optimization. Moreover,using orthogonal array design, a lyoprotectant formulation consisting of skim milk 14.25 g/100 mL, sucrose 3 g/100 mL, VC-Na 3 g/100 mL was found to be optimal for the freeze-drying of the strain. The survival rate of the engineered bacterium was up to 86.32% during freeze-drying using the lyoprotectant, being benef i cial for of prolonged storage life of oral capsules.

tumor-targeting engineered strain; high cell density fermentation; response surface analysis; cryoprotectant;bacterial powder

10.7506/spkx1002-6630-201802017

TS201.3

A

1002-6630（2018）02-0105-07

王燦, 莫湘濤, 張峰, 等. 抗腫瘤靶向工程菌的高密度發(fā)酵及菌粉研制[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2): 105-111.

10.7506/spkx1002-6630-201802017. http://www.spkx.net.cn

WANG Can, MO Xiangtao, ZHANG Feng, et al. High cell density fermentation of tumor-targeting engineered strain and development of lyoprotectant formulation for its freeze-drying[J]. Food Science, 2018, 39(2): 105-111. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802017. http://www.spkx.net.cn

2017-01-10

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃）項(xiàng)目（2012CB722301）；

湖南省生物發(fā)育工程及新產(chǎn)品研發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心項(xiàng)目（20134486）

王燦（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镄滤幇l(fā)酵。E-mail：453519284@qq.com

*通信作者簡(jiǎn)介：夏立秋（1955—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)槲⑸镄滤幇l(fā)酵。E-mail：xialq@hunnu.edu.cn