陳 穩(wěn)，李由然，顧正華，丁重陽，張 梁，石貴陽*

白絲北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的異源表達及酶學(xué)性質(zhì)分析

陳 穩(wěn)，李由然，顧正華，丁重陽，張 梁，石貴陽*

（江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

為實現(xiàn)從L-谷氨酸到α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）的高效生物轉(zhuǎn)化，將來源于白絲北里孢菌（Kitasatospora setae KM-6054）的L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，LGOX）在大腸桿菌（Escherichia coli）中實現(xiàn)異源表達，并研究其酶學(xué)特性。根據(jù)LGOX的氨基酸序列和大腸桿菌系統(tǒng)偏好性合成LGOX全基因序列，并通過pET28a（＋）/DE3系統(tǒng)在大腸桿菌中實現(xiàn)了功能表達。誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）終濃度為0.1 mmol/L，20 ℃誘導(dǎo)18 h，重組大腸桿菌粗酶液酶活力可達49.10 U/mL。親和層析獲得酶比活力為45.98 U/mg純酶，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳條帶顯示蛋白分子質(zhì)量大小約為70 kDa。酶學(xué)性質(zhì)研究表明：其最適反應(yīng)溫度和pH值分別為40 ℃和6.0；Km值為1.23 mmol/L，Vmax值為76.24 μmol/（min·mg），L-谷氨酸為該酶的最適底物。本研究確定了LGOX在E. coli BL21中的異源表達及酶學(xué)特性，為生物轉(zhuǎn)化合成α-KG提供了新的參考途徑。

白絲北里孢菌；L-谷氨酸氧化酶；α-酮戊二酸；異源表達；酶學(xué)性質(zhì)

α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid，α-KG）作為三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝中重要的二元氨基酸，在氨基酸形成和氮代謝中起關(guān)鍵作用。它也廣泛用于各種醫(yī)藥和食品領(lǐng)域，如用作化學(xué)合成藥物的前體物質(zhì)[1]、膳食補充劑[2]、注射室化合物和創(chuàng)傷恢復(fù)性化合物等[3]。α-KG和三醇（丙三醇、1,2,4-丁三醇、1,2,6-已三醇）中的任意一個發(fā)生熱縮聚反應(yīng)形成聚三醇-α-酮戊二酸化合物可能在生物醫(yī)學(xué)中有潛在的應(yīng)用[4]。微生物體內(nèi)主要在三羧酸循環(huán)途徑中形成α-KG，外源碳源物質(zhì)進入細胞后，經(jīng)糖酵解形成丙酮酸，再由丙酮酸轉(zhuǎn)化成α-KG，α-KG又在酮戊二酸脫氫酶系作用下代謝成琥珀酸輔酶A，進入下一碳代謝節(jié)點；此外，α-KG可經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用形成L-谷氨酸進入氮代謝，在某些微生物中L-谷氨酸也可被氧化形成α-KG，但絕大多數(shù)微生物群體內(nèi)或體外都不積累α-KG。目前，工業(yè)上生產(chǎn)α-KG主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和生物轉(zhuǎn)化法。其中化學(xué)合成法生產(chǎn)過程中有毒化合物和有毒溶劑會對環(huán)境產(chǎn)生巨大危害，不符合綠色生物制造的發(fā)展趨勢[5]；微生物發(fā)酵法（細菌和酵母）由于合成路線長，伴隨多個電子傳遞和能量傳遞過程，受調(diào)控復(fù)雜，收率低，很難達到工業(yè)化的生產(chǎn)要求[6-8]；而生物轉(zhuǎn)化法通過酶轉(zhuǎn)化和細胞轉(zhuǎn)化合成目的產(chǎn)物[9-10]，相較于前兩種方式生產(chǎn)條件更為簡單、溫和，且生產(chǎn)過程中基本無副產(chǎn)物的積累，便于后續(xù)分離提取，是最具應(yīng)用前景的生產(chǎn)方式。

L-谷氨酸氧化酶（L-glutamate oxidase，LGOX）可催化L-谷氨酸生成α-KG，它是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸（f l avin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD）為輔酶的黃素酶，但因其本身含有一個非共價結(jié)合的FAD，因此又能在不加外源性輔助因子FAD條件下完成催化反應(yīng)[11-12]。LGOX對催化反應(yīng)底物有著很強的底物專一性，且催化效率高，反應(yīng)條件溫和，因此利用LGOX生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG引起了廣大研究者的興趣[13]。同時，LGOX也可被用于臨床實驗檢測γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性[14]，及用于測定肌酐、血氨等含量[15]。生物傳感器中也經(jīng)常使用LGOX測定L-谷氨酸含量[16]。

1983年，Kamei等[17]從Streptomyces violascens中發(fā)現(xiàn)LGOX，并確定了其催化反應(yīng)后所生成產(chǎn)物，將其歸納為黃素酶類。目前，現(xiàn)有LGOX的報道都來自鏈霉菌屬：Kusakabe等[18]率先從Streptomyces sp. X-119-6中發(fā)現(xiàn)較強底物專一性的LGOX，但粗酶液酶活力僅為0.056 U/mg；為進一步提高LGOX的表達量，Arima等[11]將Streptomyces sp. X-119-6來源的LGOX基因在大腸桿菌（Escherichia coli）JM109中實現(xiàn)重組表達并分析其蛋白結(jié)構(gòu)，獲得2.42 U/mg的粗酶液，酶比活力比原始菌中提高了43.2 倍，但熱穩(wěn)定性迅速降低，該重組酶在pH 7.4、30 ℃溫浴0.5 h僅剩50%酶活力；2013年，盧嬋等[19]又將該來源的基因連接至pET28a表達載體上，實現(xiàn)了在E. coli BL21中的重組表達，并發(fā)現(xiàn)該重組酶在50 ℃保溫10 min，酶活力迅速降為原來的15%，說明該酶的穩(wěn)定性較差。為尋找一株熱穩(wěn)定性良好、可實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用的菌株，Niu等[10]將來自Streptomyces ghanaensis ATCC14672的LGOX基因在E. coli BL21中表達，經(jīng)HisTrapTMFF親和層析柱純化后其酶比活力達到9.54 U/mg，熱穩(wěn)定性研究顯示該重組酶在50 ℃溫浴1 h后，其酶活力亦迅速降為原來的30%。綜上LGOX酶學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，來源于鏈霉菌的LGOX普遍存在酶學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定或表達量低等問題，難以滿足利用該酶工業(yè)化生產(chǎn)α-KG的條件。

白絲北里孢菌（Kitasatospora setae）是一類放線菌，是1982年由Omura等[20]發(fā)現(xiàn)的一個新屬，其生理特征、遺傳特性及蛋白結(jié)構(gòu)與鏈霉菌有諸多不同，其主要特征是菌體細胞壁同時含有L,L-二氨基庚二酸和meso-二氨基庚二酸兩個組分，并含有甘氨酸和半乳糖，可產(chǎn)生多種抗生素[21]，而對該菌株產(chǎn)酶及其基因來源酶類的異源表達鮮有報道。本研究將來源于K. setae的LGOX，根據(jù)E. coli系統(tǒng)合成該基因，經(jīng)重組轉(zhuǎn)化到E. coli BL21中過量表達LGOX，經(jīng)親和層析純化后，研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)該酶具有突出的熱穩(wěn)定性，具備應(yīng)用于α-KG生物轉(zhuǎn)化的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

E. coli JM109為本實驗中質(zhì)粒構(gòu)建和保藏菌株，E. coli BL21（DE3）為過表達目的基因的宿主菌，質(zhì)粒pET-28a（＋）為含有T7強啟動子的異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)型表達質(zhì)粒，上述菌株與質(zhì)粒均由本實驗室保藏。

DNA片段純化、膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒 北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司；TA克隆載體、T4 DNA連接酶、Pyrobest DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等工具酶 寶生物工程（大連）有限公司；標準分子質(zhì)量蛋白 美國Thermo Scientific公司；蛋白胨、酵母粉 英國Oxiod公司；十二烷基硫酸鈉、卡那霉素（kanamycin，Kan）、瓊脂糖、IPTG、牛血清蛋白美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、Chemi Doc XRS＋凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；AB204-N分析天平 梅特勒-托利多有限公司；CF16RXⅡ型冷凍離心機、CT15RE型臺式微量高速離心機 日本Hitachi公司；AF100雪花制冰機 意大利Scotsman公司；pHS-3TC型pH計 德國賽多利斯股份公司；MLS-3750型全自動高壓滅菌鍋 日本Sanyo公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；VC750型超聲波細胞破碎儀 美國Sonics公司；DYY-6B凝膠水平電泳儀 北京市六一儀器廠；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；HYL-C多功能組合式搖床 太倉市強樂實驗設(shè)備廠；SF-CJ-2超凈工作臺 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LGOX密碼子優(yōu)化合成

參照NCBI中來源于K. setae菌屬的LGOX的氨基酸序列（Accession編號：BAJ32332），根據(jù)E. coli系統(tǒng)密碼子偏好性及使用頻率，在不改變氨基酸序列的前提下減少序列中可能存在的穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)區(qū)域，防止終止子使轉(zhuǎn)錄提前終止，同時在序列的5’端和3’端分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點，利用利用密碼子優(yōu)化軟件GeneOptimizer對LGOX基因進行優(yōu)化，交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成LGOX基因，連接至pUC57-T載體上，命名為pUC57T-LGOX。

1.3.2 LGOX表達載體的構(gòu)建

用NdeⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切pUC57T-LGOX質(zhì)粒、pET-28a（＋）質(zhì)粒。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收1 830 bp的目的片段，與雙酶切后的pET-28a（＋）質(zhì)粒載體經(jīng)T4連接酶過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli BL21感受態(tài)細胞，涂布Kan平板37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR和酶切驗證獲得重組表達載體pET28a-LGOX，同時將含有上述重組載體的重組菌命名為E. coli BL21/pET28a-LGOX。

1.3.3 重組LGOX在E. coli中的誘導(dǎo)表達

將含有重組表達載體pET28a-LGOX的重組菌接入LB培養(yǎng)基中過夜活化后，轉(zhuǎn)接3%的接種量至TB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，至OD600nm約為1.2時，分別加入不同濃度的IPTG，于不同溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)不同時間，探討了誘導(dǎo)劑IPTG終濃度（0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2、1.5、2 mmol/L）、誘導(dǎo)時間（3、6、9、12、15、18、21 h）和誘導(dǎo)溫度（20、25、30、37 ℃）對重組LGOX表達影響。

1.3.4 重組蛋白的純化

12 000 r/min離心2 min收集經(jīng)發(fā)酵誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細胞，用20 mmol/L pH 7.4的磷酸緩沖液洗滌菌體2 次，最后用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲破碎6 min（工作1 s，間歇2 s），冷凍離心收集上清液。采用HisTrapTMFF親和層析柱純化重組蛋白，用A液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L NaCl，100 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白，用B液（20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.4）洗下目的蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測蛋白純度。

1.3.5 LGOX活力測定[22]

反應(yīng)體系中包括12 mmol/L L-谷氨酸、0.2 mmol/L 4-氨基安替比林、1 mmol/L N,N-二甲基苯胺、2 U/mL辣根過氧化物酶，總反應(yīng)體系為3 mL（pH 7.0）。加入100 μL稀釋后的酶液，于37 ℃反應(yīng)10 min后，立即測定其在550 nm波長處的吸光度。1 個酶活力單位的定義為：37 ℃條件下反應(yīng)1 min生成1 μmol過氧化氫所需的酶量。

式中：A550nm為550 nm波長處的吸光度；14.3為每毫摩爾醌亞胺混合物的消光值；3.1為總反應(yīng)液體積/mL；0.1為酶液體積/mL；10為反應(yīng)時間/min；C為稀釋倍數(shù)。

1.3.6 LGOX純酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.6.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

將等量的純酶于4、20、25、30、37、40、45、50、55、60、70、80 ℃條件下測定酶活力，以反應(yīng)所測的最高酶活力為100%，計算其他不同溫度下的相對酶活力，探討溫度對LGOX活力影響。

將等量酶液分別于4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃條件下恒溫放置1 h后，測定酶活力，以反應(yīng)所測的最高酶活力為100%，考察LGOX在不同溫度的熱穩(wěn)定性。

1.3.6.2 最適反應(yīng)pH值及pH值穩(wěn)定性

將等量的酶置于0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5），0.1 mol/L磷酸鈉鹽緩沖液（pH 6.0、6.5、7.0、7.5），0.1 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 8.0、8.5、9.0）中，于37 ℃反應(yīng)測定酶活力，以所測的最高酶活力為100%，計算其他pH值條件下的相對酶活力，考察該酶在不同pH值條件下的酶活力影響。

將等量的純酶分別于pH 3.0～9.0、4 ℃放置12 h后，測定酶活力，以所測最高酶活力為100%，考察不同pH值條件下LGOX的pH值穩(wěn)定性。

1.3.6.3 底物特異性

用不同氨基酸溶液替代L-谷氨酸，測定LGOX活力，以L-谷氨酸為底物測定的活性定義為100%，獲得其他不同底物的相對活性。

1.3.6.4 外源金屬離子對LGOX活力影響

向反應(yīng)體系中加入2 mmol/L的不同金屬離子（Ni＋、K＋、Ba2＋、Mg2＋、Cu2＋、Zn2＋、Ca2＋、Mn2＋、Co＋），測定LGOX活力，以不加金屬離子測定的酶活力為100%，獲得相應(yīng)的添加金屬離子后的相對酶活力。

1.3.6.5 動力學(xué)參數(shù)測定

在最適反應(yīng)溫度與pH值條件下，測定不同L-谷氨酸底物濃度（0.5～15 mmol/L）條件下的反應(yīng)速率，計算其Km與Vmax值。

1.3.7 酶液中蛋白含量的測定

蛋白含量測定采用Bradford法[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 K. setae來源的LGOX氨基酸序列分析及密碼子優(yōu)化

將K. setae來源的LGOX的610個氨基酸序列，提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行序列比對，MEGA 5軟件繪制進化樹（圖1）發(fā)現(xiàn)該酶的氨基酸序列與來源于鏈霉菌同類酶的同源性較低，約為40%，進化樹表明兩者具有同一根，不同節(jié)點，都屬放線菌科，兩類LGOX進化枝長相差較大，可能是因為隨著時間的進化，保守區(qū)域變化不大，非保守區(qū)的部分氨基酸序列發(fā)生了不定向進化，引起蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域部分變化，而影響酶的部分催化特性[24]。

圖1 鏈霉菌與北里孢菌來源的LGOX氨基酸序列進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of LGOX from streptomycete and Kitasatospora

在網(wǎng)站http://www.kazusa.or.jp/codon/上查詢大腸桿菌主要具有UAG、UGA、CUA、CGA、CGG、AUA、AGA、AGG等稀有密碼子，優(yōu)化后密碼子幾乎全是大腸桿菌所偏好的，LGOX基因序列比對（圖2）發(fā)現(xiàn)合成基因序列中GC含量從原始菌的45.3%提高到53.6%，兩者具有77.76%的同源性，其中替換了407 個堿基和371 個密碼子，密碼子替換比例達60.8%。合成的序列連接至pUC57-T載體上，獲得含目的基因的重組質(zhì)粒pUC57T-LGOX。

將克隆載體pUC57T-LGOX經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，割膠回收1 830 bp的LGOX基因片段與經(jīng)相同酶切的pET28a（＋）表達載體連接并轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3），轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒經(jīng)NdeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，獲得5 331 bp及1 830 bp兩條DNA條帶，與DNA序列分析結(jié)果一致，獲得重組載體pET28a-LGOX，及重組菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-LGOX，驗證結(jié)果如圖3所示。

圖2 LGOX基因序列比對圖Fig. 2 Sequence alignment between original and synthetic LGOX gene

2.2 重組表達載體的構(gòu)建

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-LGOX雙酶切Fig. 3 Identif i cation of recombinant plasmid pET28a-LGOX by double enzyme digestion and PCR

2.3 重組LGOX的表達

重組菌誘導(dǎo)發(fā)酵，超聲破碎，經(jīng)SDS-PAGE蛋白條帶檢測（圖4），在2、4泳道中70 kDa附近有一明顯目的條帶，而對照組1、3泳道中則無明顯蛋白條帶，說明重組菌在大腸桿菌實現(xiàn)部分可溶性表達；本研究中胞外蛋白濃度較低，SDS-PAGE檢測5、6泳道未顯示明顯條帶。

圖4 重組LGOX在E. coli BL21（DE3）中過表達后的SDS-PAGE驗證Fig. 4 SDS-PAGE analysis of overexpression of recombinant LGOX in E. coli BL21 (DE3)

2.4 誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化

圖5 IPTG濃度（A）、誘導(dǎo)時間（B）和誘導(dǎo)溫度（C）對重組LGOX的影響Fig. 5 Effect of IPTG concentration (A), induction time (B) and temperature (C) on recombinant LGOX activity

按照前述方法中所述發(fā)酵重組菌E. coli BL21（DE3）/pET28a-LGOX，加入不同終濃度的IPTG，20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)15 h后測定酶活力，結(jié)果如圖5A所示。在IPTG終濃度為0.1 mmol/L時誘導(dǎo)效果最佳。此外，在不添加IPTG誘導(dǎo)時，也能表達出一定的酶活力，這一本底表達的存在表明實驗條件下，阻遏蛋白不能完全抑制T7聚合酶的表達。故確定0.1 mmol/L IPTG為最佳誘導(dǎo)劑濃度，以此條件為基礎(chǔ)，改變誘導(dǎo)時間，結(jié)果如圖5B所示，隨著誘導(dǎo)時間的延長，單位酶活力也相應(yīng)增加，當誘導(dǎo)18 h時，酶活力基本達到穩(wěn)定，故綜合考慮，誘導(dǎo)時間為18 h時最佳。接著，以此條件為基礎(chǔ)，改變誘導(dǎo)溫度為20、25、30、37 ℃，結(jié)果如圖5C所示，隨著溫度升高，酶活力逐漸降低。據(jù)相關(guān)報道重組E. coli能高表達重組蛋白的誘導(dǎo)溫度為15～42 ℃，降低溫度有利于重組酶的表達同時減少包涵體的產(chǎn)生[25-26]，本實驗結(jié)果也間接證實了這一結(jié)論，當誘導(dǎo)溫度為20 ℃時，酶活力最佳。故最終確定誘導(dǎo)條件為0.1 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)時間18 h、誘導(dǎo)溫度20 ℃，獲得酶活力為（49.10±2.26）U/mL粗酶液，比活力為19.56 U/mg。

2.5 重組LGOX的純化

圖6 重組LGOX分 離純化過程SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis in the puri fi cation process of recombinant LGOX

由于本實驗所采用的pET28a（＋）為含有T7強啟動子的IPTG誘導(dǎo)型表達載體，且本身自帶有組氨酸標簽，可采用HisTrapTMFF親和層析柱純化重組蛋白，達到快速、便捷、高效的目的[27]。如圖6所示，粗酶液經(jīng)HisTrapTMFF親和層析柱純化后得到單一的目的蛋白條帶，純化后的酶比活力達到45.98 U/mg，是純化前的2.35 倍。

2.6 LGOX純酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.6.1 溫度及pH值對重組LGOX影響

圖7 溫度（A）和pH值（B）對重組LGOX活力影響Fig. 7 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of recombinant LGOX

從圖7A可以看出，該酶的最適溫度為40 ℃，最適溫度范圍在30～50 ℃之間，其能維持90%以上酶活力，當溫度達60 ℃時，具有60%的活力，說明該酶的作用溫度較為廣泛，能滿足工業(yè)化酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG要求。80 ℃反應(yīng)時，該酶活力幾乎完全喪失。此外，將該酶分別在4、10、20、30、40、50、60、70、80 ℃保溫1 h后測定酶活力，發(fā)現(xiàn)該酶在70 ℃及以下溫度保溫1 h后，還能維持其50%以上的酶活力，80 ℃保溫1 h后，酶活力基本喪失。

由圖7B可知，pH值為6.0時，酶活力最高，為該酶的最適反應(yīng)pH值，最適pH值范圍為5～6，當pH值高于6.0時，酶活力降低較為顯著，pH值為9.0時，酶活力基本完全喪失。同時，將該酶分別在pH值為3、4、5、6、7、8、9條件下，4 ℃放置12 h后，測定酶活力，發(fā)現(xiàn)該酶在pH值為5～6.5時，該酶活力基本穩(wěn)定，能維持將近80%以上的酶活力，當pH值高于7.0時，酶活力迅速較為50%以下，而pH值為9.0時，酶活力基本喪失。

2.6.2 底物特異性

表1 重組LGOX底物特異性分析Table 1 Substrate specif i city of recombinant LGOX

由表1可知，LGOX的最適底物為L-谷氨酸，還對L-谷氨酰胺和L-組氨酸有微弱作用外，對其他氨基酸無作用，這與Kamei等[17]的研究結(jié)果類似。較強的底物專一性，顯示了該酶一定的應(yīng)用前景。

2.6.3 金屬離子對LGOX活力影響

由圖8可知，在酶活力測定反應(yīng)體系中加入2 mmol/L的不同外源金屬離子時，K＋、Ba2＋、Mn2＋均對該酶起了一定的促進作用，其中尤以Mn2＋促進效果最為明顯，與不加外源離子的對照組相比，酶活力提高了10%以上，同時，Ni＋、Cu2＋、Zn2＋、Ca2＋、Co＋、Mg2＋對LGOX有不同程度的抑制效果，其中，又以Zn2＋最為突出，幾乎能完全抑制其酶活力。

圖8 金屬離子對重組LGOX活力影響Fig. 8 Effect of different metal ions on the activity of recombinant LGOX

2.6.4 動力學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果

按照酶活力標準測定方法，在最適溫度40 ℃和最適pH 6.0條件下，測定不同底物濃度（0.5、1、3、6、9、12、15 mmol/L）的酶活力，計算出反應(yīng)速率，得到該重組LGOX的Km值為1.23 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為76.24 μmol/（min·mg）。

3 討 論

表2 不同來源LGOX的特征Table 2 Characters of the LGOX from different sources

α-KG在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域存在巨大的應(yīng)用價值，一方面，α-KG與精氨酸等氨基酸復(fù)配，能幫助運動員快速補充能量，另一方面，α-KG能減輕腎病患者腎臟負擔[1]，此外，α-KG還在魚類營養(yǎng)及腸道代謝中存在巨大應(yīng)用價值[28]，而目前工業(yè)上生產(chǎn)α-KG存在各種弊端，因此，利用LGOX高效生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)食品添加劑α-KG是一極具應(yīng)用情景選擇。表2顯示，目前大部分的LGOX研究均來源于鏈霉菌屬，Arima等[29]將Streptomyces sp. X-119-6來源的LGOX基因在E. coli JM109中實現(xiàn)重組表達，該重組酶在pH 7.4、30 ℃溫浴0.5 h僅剩50%酶活力；Niu等[10]將來自Streptomyces ghanaensis ATCC14672的LGOX基因在E. coli BL21中表達，重組酶45 ℃溫浴1 h酶活力不到50%，酶活力下降明顯，穩(wěn)定性較差。直接由野生菌分泌的LGOX表達量低，且分離純化較為困難，不適宜大規(guī)模制備。為尋找出一種穩(wěn)定性能良好、作用條件溫和的LGOX，同時獲得一株能高效表達該酶的重組菌株，發(fā)現(xiàn)來源于北里孢屬的LGOX表達量高，熱穩(wěn)定性能良好，70 ℃放置1 h還有50%的酶活力，最適反應(yīng)溫度及pH值較為溫和，適用于工業(yè)化轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG。

根據(jù)來源于北里孢的LGOX的氨基酸序列，合成了上述來源的LGOX基因，并將其克隆至pET28a表達載體，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21中，獲得高效表達。并通過對誘導(dǎo)條件的探索，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)產(chǎn)酶時，影響外源基因的表達除了載體和宿主外，誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)溫度等都會在不同程度上影響重組菌的表達。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度誘導(dǎo)劑IPTG（濃度0.1 mmol/L）即可誘導(dǎo)重組菌的表達，濃度過高，由于其本身的毒性作用，會抑制菌體生長而影響活性蛋白的表達；在不添加IPTG誘導(dǎo)時，也能表達出一定的酶活，說明這一本底表達的存在表明實驗條件下，阻遏蛋白不能完全抑制T7聚合酶的表達。在一定的誘導(dǎo)時間內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，其酶活力也逐漸上升，當誘導(dǎo)時間為18 h時，達到最佳誘導(dǎo)效果；溫度對誘導(dǎo)蛋白的表達影響效果顯著，當溫度在1～42 ℃時，溫度升高，菌體生長過快，導(dǎo)致蛋白合成過快，沒有足夠時間進行正確折疊，而形成不溶解的包涵體，導(dǎo)致酶活力急劇下降[25]。

酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)該重組酶底物特異性強，除對L-谷氨酸有強烈作用外，僅對L-組氨酸和L-谷氨酰胺有微弱作用；熱穩(wěn)定性能良好，70 ℃溫浴1 h，還能維持50%以上的活力，而目前已有報道的LGOX，熱穩(wěn)定性普遍偏低，其中以Kusakabe等[18]所報道的LGOX熱穩(wěn)定性最佳，在0.1 mol/L pH 5.5緩沖劑中75 ℃以下維持15 min還具100%酶活力，但其表達量低，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)制備要求；本研究中的重組LGOX在pH 5～6.5時，能維持80%以上的活力，說明該重組酶耐酸性較強，符合工業(yè)化生產(chǎn)制備的要求，為工業(yè)化生產(chǎn)α-KG提供參考依據(jù)；同時，本研究還發(fā)現(xiàn)外源添加一定濃度的Mn2＋能促進LGOX活力，可為工業(yè)上酶轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-KG提供一定的參考。

對來源K. setaed的LGOX異源表達及酶學(xué)性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)該酶作用條件溫和，且穩(wěn)定性能良好，為今后通過生物轉(zhuǎn)化L-谷氨酸生產(chǎn)α-KG研究提供了理論支持。

4 結(jié) 論

研究來源于K. setaed的LGOX在大腸桿菌中異源表達及催化特性，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)劑IPTG終濃度為0.1 mmol/L時，20 ℃誘導(dǎo)18 h，重組大腸桿菌粗酶液酶活力最佳為49.10 U/mL，其催化特性結(jié)果顯示該重組酶在溫度為40 ℃和pH 6.0時，酶活力最佳，此外，該酶在70 ℃及以下溫度保溫1 h后，能維持其50%以上的酶活力，熱穩(wěn)定性良好，在pH 5～6.5時，能維持將近80%以上的酶活力，底物專一性強，外源加入Mn2＋能促進重組LGOX活力，可為工業(yè)生產(chǎn)α-KG提供借鑒。

[1] MATZI V, LINDENAMN J, MUENCH A, et al. The impact of preoperative micronutrient supplementation in lung surgery. A prospective randomized trial of oral supplementation of combined α-ketoglutaric acid and 5-hydroxymethylfurfural[J]. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery, 2007, 32(5): 776-782. DOI:10.1016/j.ejcts.2007.07.016.

[2] UR-REHMAN S, FOX P F. Effect of added α-ketoglutaric acid,pyruvic acid or pyridoxal phosphate on proteolyis and quality of Cheddar cheese[J]. Food Chemistry, 2002, 76(1): 21-26. DOI:10.1016/S0308-8146(01)00242-4.

[3] CHEMYAVSKAYA O G, SHISHKANOVA N V, II’CHENKO A P, et al. Synthesis of α-ketoglutaric acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2000,53(2): 152-158. DOI:10.1007/s002530050002.

[4] BARRETT D G, YOUSAF M N. Poly (triol α-ketoglutarate) as biodegradable, chemoselective, and mechanically tunable elastomers[J].Macromolecules, 2008, 41(17): 6347-6352. DOI:10.1021/ma8009728.

[5] STOTTMEISTER U, AURICH A, WILDE H, et al. White biotechnology for green chemistry: fermentative 2-oxocarboxylic acids as novel building blocks for subsequent chemical syntheses[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2005, 32(11/12): 651-664. DOI:10.1007/s10295-005-0254-x.

[6] OTTO C, YOVKOVA V, BARTH G. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(4): 689-695. DOI:10.1007/s00253-011-3597-4.

[7] ASAI T, AIDA K, SUGISAKI Z, et al. On α-ketoglutaric acid fermentation[J]. The Journal of General and Applied Microbiology,1955, 1(4): 308-346. DOI:10.2323/jgam.1.308.

[8] ZHOU J, YIN X, MADZAK C, et al. Enhanced α-ketoglutarate production in Yarrowia lipolytica WSH-Z06 by alteration of the acety L-CoA metabolism[J]. Journal of Biotechnology, 2012, 161(3):257-264. DOI:10.1016/j.jbiotec.2012.05.025.

[9] HOSSAIN G S, LI J, SHIN H, et al. Bioconversion of L-glutamic acid to α-ketoglutaric acid by an immobilized whole-cell biocatalyst expressing L-amino acid deaminase from Proteus mirabilis[J].Journal of Biotechnology, 2014, 169(1): 112-120. DOI:10.1016/j.jbiotec.2013.10.026.

[10] NIU P, DONG X, WANG Y, et al. Enzymatic production of α-ketoglutaric acid from L-glutamic acid via L-glutamate oxidase[J].Journal of Biotechnology, 2014, 179(1): 56-62. DOI:10.1016/j.jbiotec.2014.03.021.

[11] ARIMA J, TAMURA T, KUSAKABLE H, et al. Recombinant expression, biochemical characterization and stabilization through proteolysis of an L-glutamate oxidase from Streptomyces sp. X-119-6[J].Journal of Biochemisty, 2003, 134(6): 805-812. DOI:10.1093/jb/mvg206.

[12] 畢春元, 李玲, 李敬龍. L-谷氨酸氧化酶的研究進展[J]. 生命科學(xué),2012, 24(2): 169-173.

[13] SUKHACHEVA M V, ZHURAVLEVA N I. Properties of and prospects for practical use of extracellular L-glutamate oxidase of Streptomyces sp. Z-11-6[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2004, 40(2): 146-150. DOI:10.1023/B:ABIM.0000018917.04795.d9.

[14] KAMEI T, ASANO K, NAKAMURA S. Determination of serum glutamate oxaloacetate transaminase and glutamate pyruvate transaminase by using L-glutamate oxidase[J]. Chemical &Pharmaceutical Bulletin, 1986, 34(1): 409-412. DOI:10.1248/cpb.34.409.

[15] 鄭強, 嚴衛(wèi)民, 徐東, 等. L-谷氨酸氧化酶的來源和特性及其在生化檢驗中的應(yīng)用[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)教育, 2003, 10(2): 32-35.

[16] 李玲, 畢春元, 李敬龍. L-谷氨酸氧化酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 中國釀造, 2012, 31(1): 140-143. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2012.01.042.

[17] KAMEI T, ASANO K, SUZUKI H, et al. L-Glutamate oxidase from Streptomyces violascens.Ⅰ. Production, isolation and some properties[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1983, 31(4):1307-1314. DOI:10.1248/cpb.31.1307.

[18] KUSAKABE H, MIDORIKAWA Y, KUNINAKA A, et al. Occurrence of a new enzyme, L-glutamate oxidase in a wheat bran culture extract of Streptomyces sp. X-119-6[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1983, 47(1): 175-177. DOI:10.1271/bbb1961.47.179.

[19] 盧嬋, 鄭璞, 孫志浩. L-谷氨酸氧化酶的克隆表達, 純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 中國生物工程雜志, 2013, 33(6): 38-44.

[20] OMURA S, TAKAHASHI Y, IWAI Y, et al. Kitasatosporia, a new genus of the order Actinomycetales[J]. Journal of Antibiotics, 1982,35(8): 1013-1019.

[21] JCHIKAWA N, OGUCHI A, IKEDA H, et al. Genome sequence of Kitasatospora setae NBRC 14216T: an evolutionary snapshot of the family Streptomycetaceae[J]. DNA Research, 2010, 17(6): 393-406.DOI:10.1093/dnares/dsq026.

[22] ALLAIN C C, POON L S, CHAN C S G, et al. Enzymatic determination of total serum cholesterol[J]. Clinical Chemistry, 1974,20(4): 470-475.

[23] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1/2): 248-254.

[24] SIEVERS F, HUGHES G M, HIGGINS D G. Systematic exploration of guide-tree topology effects for small protein alignments[J]. BMC Bioinformatics, 2014, 15(1): 338. DOI: 10.1186/1471-2105-15-338.

[25] KIM M H, LEE J K, KIM H K, et al. Overexpression of cyclodextrin glycosyltransferase gene from Brevibacillus brevis in Escherichia coli by control of temperature and mannitol concentration[J].Biotechnology Techniques, 1999, 13(11): 765-770. DOI:10.1023/A:1008909105229.

[26] 曹思碩, 許文濤, 冉文君, 等. 大腸桿菌中表達Cry1C基因及其重組表達產(chǎn)物的純化及復(fù)性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(7): 211-215.

[27] 王水興, 李燕萍, 許楊, 等. 基因工程菌E. coli BL21/pET-DsbA-MalQ發(fā)酵產(chǎn)麥芽糖轉(zhuǎn)糖基酶的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(8): 285-289.

[28] 徐奇友, 位瑩瑩, 李晉南, 等. α-酮戊二酸在魚類營養(yǎng)學(xué)上潛在應(yīng)用價值[C]//第九屆世界華人魚蝦營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會論文集. 世界華人魚蝦營養(yǎng)學(xué)術(shù)研討會, 2013.

[29] ARIMA J, SASAKI C, SAKAGUCHI C, et al. Structural characterization of L-glutamate oxidase from Streptomyces sp. X-119-6[J]. FEBS Journal,2009, 276(14): 3894-3903. DOI:10.1111/j.1742-4658.2009.07103.x.

[30] WACHIRATIANCHAI S, BHUMIRATANA A, UADOMSOPAGIT S. Isolation, purif i cation, and characterization of L-glutamate oxidase from Streptomyces sp. 18G[J]. Electronic Journal of Biotechnology,2004, 7(3): 9-10. DOI:10.2225/vol7-issue3-fulltext-14.

[31] B?HMER A, MüLLER A, PASSARGE M, et al. A novel L-glutamate oxidase from Streptomyces endus[J]. European Journal of Biochemistry, 1989, 182(2): 327-332. DOI:10.1111/j.1432-1033.1989.tb14834.x.

Heterologous Expression and Characterization of Recombinant L-Glutamate Oxidase from Kitasatospora setae

CHEN Wen, LI Youran, GU Zhenghua, DING Zhongyang, ZHANG Liang, SHI Guiyang*
(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to achieve eff i cient bioconversion of L-glutamic acid to alpha ketoglutaric acid (α-KG), the L-glutamate oxidase (LGOX) gene from Kitasatospora setae KM-6054 was expressed in Escherichia coli BL21. According to the known LGOX sequence from K. setae and the codon bias of E. coli, the optimized LGOX gene sequence was synthesized and cloned into the pET28a (+) vector, which was then transferred into E. coli BL21(DE3) to obtain a recombinant LGOX.And enzymatic properties of the recombinant LGOX were also investigated. Results showed that the recombinant LGOX activity could reach 49.10 U/mL after induction at an IPTG concentration of 0.1 mmol/L at 20 ℃ for 18 h. Subsequently, the recombinant LGOX was purif i ed by aff i nity column chromatography to a specif i c activity of 45.98 U/mg and its molecular weight was about 70 kDa as determined by SDS-PAGE analysis. The enzymatic properties showed that the optimal reaction temperature and pH value were 40 ℃ and 6.0, respectively. The Michaelis-Menten constant Kmwas 1.23 mmol/L, and the maximum reaction rate Vmaxwas 76.24 μmol/(min·mg). L-Glutamic acid was the optimal substrate for the LGOX. The heterologous expression and characterization of recombinant L-glutamate oxidase in this study can provide a new way for biosynthesis of α-KG.

Kitasatospora setae; L-glutamate oxidase; α-ketoglutaric acid; heterologous expression; enzymatic properties

10.7506/spkx1002-6630-201802010

Q814

A

1002-6630（2018）02-0058-08

陳穩(wěn), 李由然, 顧正華, 等. 白絲北里孢菌L-谷氨酸氧化酶的異源表達及酶學(xué)性質(zhì)分析[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2): 58-65.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802010. http://www.spkx.net.cn

CHEN Wen, LI Youran, GU Zhenghua, et al. Heterologous expression and characterization of recombinant L-glutamate oxidase from Kitasatospora setae[J]. Food Science, 2018, 39(2): 58-65. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802010. http://www.spkx.net.cn

2017-01-05

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31401674）；“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFD0401404）

陳穩(wěn)（1992—），男，碩士，研究方向為工業(yè)微生物學(xué)與酶工程。E-mail：chenwenjnu@126.com

*通信作者簡介：石貴陽（1963—），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：gyshi@jiangnan.edu.cn