王 遠(yuǎn)，鄭 雯，蔡珺珺，袁田青，宮興文*

辣木葉黃酮結(jié)構(gòu)分析及其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

王 遠(yuǎn)，鄭 雯，蔡珺珺，袁田青，宮興文*

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018）

對(duì)辣木葉中黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并測(cè)定其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用及抑制作用類型。以70%乙醇溶液為提取溶劑，用微波輔助提取法提取辣木葉黃酮，提取率達(dá)到（5.53±0.11）%；用聚酰胺層析柱對(duì)獲得的粗提物進(jìn)行純化，冷凍干燥得到樣品粉末，測(cè)定其總黃酮含量為（661.10±9.20）mg/g。借助超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)純化后的辣木葉黃酮結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，共鑒定出11 個(gè)黃酮類化合物。以對(duì)硝基苯丁酸酯為底物，測(cè)定了辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制活性，結(jié)果表明純化后的辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶有較好的抑制作用，半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.94 mg/mL，通過Lineweaver-Burk法測(cè)定出其抑制作用類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

辣木葉黃酮；超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜；胰脂肪酶；抑制作用

辣木（Moringa oleifera Lam.）又叫鼓槌樹，為辣木科辣木屬熱帶植物，起源于印度西北部的喜馬拉雅山南麓，全世界共有14 個(gè)種[1]。辣木于20世紀(jì)60年代開始引入我國(guó)，目前已經(jīng)在廣東、廣西、云南等西南省份成功種植并逐步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[2]。辣木作為一種功能性植物，不僅可以食用，而且具有巨大的藥用價(jià)值。在印度和越南等東南亞國(guó)家，辣木的種子、葉、皮、根都是傳統(tǒng)的民間藥物，被用來治療多種疾病，故被稱作“神奇之樹”[3]。辣木葉于2012年被我國(guó)衛(wèi)生部門公布為新資源食品，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，含有多種礦質(zhì)元素、維生素以及蛋白質(zhì)，而且含有黃酮類、多酚類、有機(jī)酸類等多種功能性成分[4]。黃酮類化合物是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，普遍存在于植物各個(gè)部位，如根、心材、樹皮、葉、果實(shí)、花等，種類繁多，具有抗氧化、抑菌、降血糖、抗腫瘤、降血脂等多種生理活性[5]。

隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，由能量過高攝入而引發(fā)的慢性疾病逐漸增多，比如肥胖、Ⅱ型糖尿病、高血脂、心血管疾病等，嚴(yán)重危害到人類的健康[6]。人體的胰脂肪酶是由胰臟分泌的降解體內(nèi)甘油三酯的關(guān)鍵酶，利用胰脂肪酶抑制劑可以降低其活性，從而減少甘油三酯進(jìn)入新陳代謝，是治療肥胖癥的有效策略[7-8]。奧利司他是目前市場(chǎng)上治療肥胖最為暢銷的藥物之一，但是有較多的副作用，如油性斑點(diǎn)、便秘、腹瀉等[9]。因此，從種類多樣、低毒的天然產(chǎn)物中篩選胰脂肪酶抑制劑，成為目前人們研究的熱點(diǎn)。

四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀將四極桿離子選擇和靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜離子掃描結(jié)合，可以對(duì)復(fù)雜物質(zhì)中多種痕量組分進(jìn)行分析鑒定、定性確認(rèn)，全掃描模式下采集的數(shù)據(jù)可以反復(fù)調(diào)用，是分析復(fù)雜成分的有力工具之一[10]。本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助提取、聚酰胺層析柱純化辣木葉黃酮，借助超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbital trap mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)純化后的辣木葉黃酮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析和鑒定，并且研究了其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用，為開發(fā)預(yù)防和治療肥胖的藥物提供理論基礎(chǔ)，也為相關(guān)保健食品的研究與開發(fā)提供了新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣木葉采摘于云南省昆明市東川區(qū)，采摘時(shí)間為10月份。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)食品藥品檢定研究院；聚酰胺樹脂（60～100 目） 浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠；甲醇、乙腈、甲酸（色譜級(jí)） 阿拉丁生化科技股份有限公司；脂肪酶（豬胰腺） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；奧利司他 重慶華森制藥制藥有限公司；無水乙醇、石油醚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、對(duì)硝基苯丁酸酯（p-nitrophenyl butyrate，PNPP）、對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，PNP）、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FW80萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；XH-300UL-2雙頻超聲波微波紫外光組合催化合成儀北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；N-I 100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；FD-1C-50冷凍干燥機(jī) 博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Dionex Ultimate 3000 UPLC儀、Q-Orbitrap MS儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木葉黃酮的提取

預(yù)處理：稱取干燥辣木葉粗粉末50 g于圓底燒瓶中，加入石油醚400 mL，磁力攪拌，70 ℃水浴回流8 h，以除去脂肪、色素等雜質(zhì)。最后抽濾烘干，粉碎過篩，得到粒徑為100～200 目的辣木葉粉末，備用。

微波輔助提取：稱取5 g預(yù)處理過的辣木葉粉末置于三口燒瓶中，加入250 mL 70%乙醇溶液，于提取儀中進(jìn)行微波提取，微波功率300 W、提取時(shí)間300 s、提取溫度50 ℃，最后抽濾得到辣木葉黃酮提取液。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用顯色法測(cè)定提取液中總黃酮含量[11]。稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，用70%乙醇溶液溶解，定容至100 mL，配成0.20 mg/mL的母液。分別取母液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于25 mL具塞比色管中，加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻放置6 min，加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻放置6 min，再加入10 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，最后加入70%乙醇溶液定容至25 mL，搖勻放置10 min。以70%乙醇溶液作空白參比，于506 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程為Y=0.012 04X-0.016 75，R2=0.999 4。

總黃酮提取率的測(cè)定：取適量辣木葉黃酮提取液于比色管中，按照上述顯色法測(cè)定吸光度，對(duì)照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算總黃酮提取率如公式（1）所示：

式中：C為標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的提取液總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液的體積/mL；m為辣木葉的質(zhì)量/g。

1.3.3 辣木葉黃酮的提取純化

樣品溶液的制備：用微波輔助提取辣木葉黃酮，重復(fù)3 次，取平均值。提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，得到濃縮液，加蒸餾水稀釋至所需的濃度，即為樣品溶液。

聚酰胺層析柱純化辣木葉黃酮：稱取預(yù)處理過的聚酰胺樹脂30 g（體積約為60 mL），以濕法裝柱裝入層析柱（20 mm×400 mm）。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，聚酰胺層析柱純化辣木葉黃酮的最優(yōu)條件為上樣質(zhì)量濃度為4 mg/mL，上樣流速為1.5 BV/h（BV為床體積，下同），上樣體積為1 BV，洗脫液為70%乙醇溶液，洗脫液流速為1.5 BV/h，洗脫液體積為3 BV。將純化得到的洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，冷凍干燥得到辣木葉黃酮樣品粉末。稱取20 mg樣品粉末用70%乙醇溶液溶解并定容至10 mL，然后測(cè)定其中黃酮濃度，并計(jì)算辣木葉黃酮的純度。

1.3.4 辣木葉黃酮結(jié)構(gòu)分析

樣品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取純化后的辣木葉黃酮粉末0.100 g，用70%甲醇溶液溶解并定容于10 mL容量瓶，再過0.22 μm有機(jī)濾膜，備用。

色譜條件：色譜柱為Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm），樣品盤溫度設(shè)為5 ℃，色譜柱溫度設(shè)為30 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器在進(jìn)樣前后均用200 μL 70%甲醇溶液洗滌2 次。流動(dòng)相：A相為乙腈，B相為0.1%甲酸溶液，進(jìn)樣體積為5 μL，流速為0.3 mL/min。洗脫程序?yàn)?～5 min，A：15%～50%；5～25 min，A：50%～95%；25～30 min，A：95%～5%。

質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源，采用負(fù)離子掃描模式，電壓為-3 kV；一級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)置為70 000，m/z 200；二級(jí)質(zhì)譜分辨率設(shè)置為35 000，m/z 200；電探頭蒸發(fā)器溫度設(shè)定為250 ℃；掃描質(zhì)量范圍均為m/z 100～1 000；一級(jí)質(zhì)譜阱填充時(shí)間設(shè)定為250 ms，自動(dòng)增益控制設(shè)定為1×106；二級(jí)質(zhì)譜阱填充時(shí)間設(shè)定為120 ms，自動(dòng)增益控制設(shè)定為2×105。標(biāo)準(zhǔn)化碰撞能設(shè)定為25 eV；階梯能量設(shè)定為40%；根據(jù)物質(zhì)一級(jí)質(zhì)譜的離子強(qiáng)度來進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜到二級(jí)質(zhì)譜之間的切換。

1.3.5 對(duì)胰脂肪酶的抑制作用1.3.5.1 PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取0.070 g PNP用磷酸鹽緩沖液（0.067 mol/L，pH 7.38，下同）溶解并定容至100 mL，得到5 mmol/L PNP母液，再稀釋得到濃度分別為0.200、0.150、0.100、0.075、0.050 mmol/L的PNP溶液。取各個(gè)濃度的PNP溶液200 μL于96 孔板中，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以PNP濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程為Y=3.344 21X＋0.018 77，R2=0.999 8。

1.3.5.2 胰脂肪酶抑制活性的測(cè)定

溶液的配制：稱取辣木葉黃酮粉末，用緩沖液配成質(zhì)量濃度為0.10、0.25、0.50、1.00、1.50 mg/mL的樣品溶液；稱取奧利司他用少量二甲基亞砜溶解，再加適量緩沖液超聲，取上清液，制得質(zhì)量濃度分別為0.03、0.06、0.12、0.18、0.24 mg/mL的奧利司他溶液，二甲基亞砜質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在1%以內(nèi)；稱取0.05 g胰脂肪酶用緩沖液溶解定容至50 mL，8 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋得0.25 mg/mL胰脂肪酶溶液；稱取0.156 g PNPP溶解于0.25 mL N,N-二甲基甲酰胺，用緩沖液定容至100 mL，得到11.2 mmol/mL的底物溶液。

測(cè)定方法：參考Liang Linfu等[12]的方法，并加以修改。反應(yīng)體系如表1所示，先將緩沖液、樣品溶液和胰脂肪酶溶液加入96 孔板，37 ℃溫育10 min，再加入PNPP底物溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，37 ℃溫育20 min后，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。與抑制劑反應(yīng)的胰脂肪酶活力降低，PNP的產(chǎn)生量減少，吸光度降低，再對(duì)照PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出樣品對(duì)胰脂肪酶的抑制率，計(jì)算公式見式（2）：

式中：A為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的吸光度；a為對(duì)照空白組的吸光度；B為樣品實(shí)驗(yàn)組的吸光度；b為樣品空白組的吸光度。

表1 胰脂肪酶反應(yīng)體系Table 1 Reaction systems for measuring the inhibition of pancreatic lipase activity

1.3.5.3 抑制作用類型的測(cè)定

用Lineweaver-Burk法來判斷辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶抑制作用的類型[13]。固定酶液質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL，純化后的辣木葉黃酮溶液質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0 mg/mL，分別測(cè)定PNPP底物濃度為11.2、5.6、2.8、1.4 mmol/mL時(shí)的酶反應(yīng)速率。反應(yīng)條件和體系與1.3.5.2節(jié)相同。以底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）為X軸、以反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為Y軸作圖，擬合得到的直線在X、Y軸上的截距分別代表米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率vm的倒數(shù)。Km值增大，vm值不變?yōu)楦?jìng)爭(zhēng)性抑制；Km值不變，vm值變小為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制；Km值變小，vm值變小，但Km/vm值不變?yōu)榉锤?jìng)爭(zhēng)性抑制。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Xcalibur 2.2軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，通過高分辨質(zhì)譜信息，推導(dǎo)化合物可能的結(jié)構(gòu)式，結(jié)構(gòu)式用ChemDraw Ultra 8.0繪制。用OriginPro 9.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，并繪圖，用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)的顯著性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉黃酮的提取與純化結(jié)果

用微波輔助提取辣木葉黃酮，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥得到純化前的辣木葉黃酮樣品粉末，經(jīng)計(jì)算辣木葉總黃酮提取率為（5.53±0.11）%，其純度為（133.78±7.87）mg/g；聚酰胺層析柱純化后，收集洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥，得到純化后的辣木葉黃酮樣品粉末，其純度為（661.10±9.20）mg/g，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，純化后純度提高了5 倍，說明純化后除去了大部分雜質(zhì)，樣品主要成分為黃酮類化合物，為其結(jié)構(gòu)分析及活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

表2 辣木葉黃酮純度Table 2 Purity of crude and purified flavonoids from Moringa oleifera Lam. leaves

2.2 辣木葉黃酮的結(jié)構(gòu)

在設(shè)置的色譜和質(zhì)譜條件下，將樣品溶液注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用體系，得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用Xcalibur 2.2軟件進(jìn)行分析處理，從中提取出總離子流圖及各峰對(duì)應(yīng)的一、二級(jí)質(zhì)譜圖?？傠x子流圖如圖1所示，結(jié)合高分辨質(zhì)譜信息并參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行分析，共鑒定出11 個(gè)黃酮類化合物。

圖1 辣木葉黃酮的總離子流圖（負(fù)離子模式）Fig. 1 Total ion chromatogram of flavonoids from Moringa oleifera Lam. leaves in the negative ion mode

由圖1可知，負(fù)離子模式下，1號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 593.168 6，二級(jí)質(zhì)譜得到的碎片離子峰m/z 503、473、383、353與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道一致，m/z 353離子峰由母離子峰m/z 593中異鼠李糖環(huán)破裂產(chǎn)生，推斷該化合物為薔薇苷B，其質(zhì)譜信息如圖2所示。2號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 609.1636，二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰m/z 301、271、255、179、151與參考文獻(xiàn)[16-17]報(bào)道一致，推斷該化合物為蘆丁，母離子峰m/z 609失去質(zhì)量數(shù)為308的葡萄糖基中性碎片生成槲皮素離子峰m/z 301；m/z 301離子峰丟失一分子H2O和一分子CO，生成離子峰m/z 255；m/z 301發(fā)生斷裂轉(zhuǎn)移2 個(gè)H，失去質(zhì)量數(shù)為122的中性碎片，生成m/z 179離子峰；m/z 301發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)生成m/z 151碎片離子峰，蘆丁的質(zhì)譜信息如圖3所示。3號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 431.110 8，二級(jí)質(zhì)譜圖得到碎片離子峰m/z 413、341、311與參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，推斷該化合物為牡荊素（芹黃素-8-C-葡萄糖苷），m/z 413離子峰由母離子峰m/z 431丟失一分子H2O產(chǎn)生，m/z 311離子峰由m/z 431葡萄糖基環(huán)破裂，失去C4H8O4中性基團(tuán)并轉(zhuǎn)移2 個(gè)H產(chǎn)生。4號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 463.1017，二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰m/z 343、301、271、255、179、151與文獻(xiàn)[18-19]報(bào)道一致，推斷該化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷，母離子峰m/z 463丟失質(zhì)量數(shù)為162的葡萄糖基得到槲皮素苷元離子峰m/z 301，離子峰m/z 271、255、179、151由槲皮素苷元離子峰m/z 301生成，裂解規(guī)律和3號(hào)峰一致。5號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 549.104 6，二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰m/z 505、463、301、300、271、255、179、151與文獻(xiàn)[20]報(bào)道一致，推斷該化合物為槲皮素-3-O-（6-丙二?；咸烟擒眨?，離子峰m/z 505由m/z 549母離子中的丙二?；鶃G失一分子CO2產(chǎn)生的，m/z 549離子峰失去一個(gè)質(zhì)量數(shù)為86的中性碎片丙二?；?，生成m/z 463離子峰，m/z 549母離子同時(shí)丟失質(zhì)量數(shù)為248的丙二?；咸烟侵行运槠?，生成槲皮素離子碎片m/z 301，離子峰m/z 271、255、179、151由槲皮素離子峰m/z 301產(chǎn)生，裂解規(guī)律和3號(hào)峰一致。6號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 607.148 4，二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰m/z 545、505、463、301、179、151與文獻(xiàn)[21]報(bào)道一致，推測(cè)該化合物為槲皮素-3-O-羥甲基戊二酰基半乳糖苷，母離子峰m/z 607丟失一個(gè)乙?；蒻/z 545離子峰；母離子峰m/z 607同時(shí)失去中性碎片羥甲基戊二?；a(chǎn)生m/z 463離子峰，再失去葡萄糖基生成槲皮素離子峰m/z 301。8號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 505.113 4，二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰m/z 463、445、301、271、179、151與文獻(xiàn)[21-22]報(bào)道一致，推斷該化合物為槲皮素-3-O-乙?；咸烟擒眨鸽x子峰m/z 505失去中性分子乙?；玫剿槠x子峰m/z 463，m/z 463丟失葡萄糖基產(chǎn)生槲皮素苷元分子離子碎片m/z 301。7號(hào)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰m/z 623.180 2，二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰m/z 357、315、300、151與文獻(xiàn)[23-24]報(bào)道一致，推斷為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，母離子峰m/z 623中蕓香糖基環(huán)破裂產(chǎn)生的碎片離子m/z 357，m/z 623母離子峰丟失蕓香糖基生成離子峰m/z 315，接著失去一個(gè)CH3產(chǎn)生離子峰m/z 300，m/z 300碎片離子發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾裂解生成m/z 151。9、10、11號(hào)峰均為山柰酚苷，由一級(jí)質(zhì)譜圖得到準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 591.152 8、m/z 533.109 0、m/z 447.106 8；二級(jí)質(zhì)譜得到碎片離子峰與文獻(xiàn)[21]和[25-26]報(bào)道一致，推斷為山柰酚-3-O-羥甲基戊二?；禾擒?、山柰酚-3-O-丙二酰基己糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷；m/z 285離子峰為山柰酚苷元離子峰，9號(hào)峰中由m/z 591離子峰丟失羥甲基戊二?；禾欠肿赢a(chǎn)生的，10號(hào)峰中由m/z 489母離子丟失丙二?；禾钱a(chǎn)生，11號(hào)峰中由母離子峰m/z 447丟失葡萄糖基產(chǎn)生的。山柰酚-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)譜信息如圖5所示。鑒定結(jié)果如表3所示，11 個(gè)黃酮類化合物均為黃酮苷，其中5 個(gè)為槲皮素苷，4 個(gè)為山柰酚苷，1 個(gè)為芹黃素苷，1 個(gè)為異鼠李素苷。這是因?yàn)樘烊稽S酮類化合物多以苷類存在，黃酮苷元與單糖或者多糖結(jié)合，易容于水、甲醇、乙醇等極性較大的溶劑，糖鏈越長(zhǎng)越易溶于水。

圖2 薔薇苷B一級(jí)質(zhì)譜（A）與二級(jí)質(zhì)譜（B）圖Fig. 2 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of multiflorin B

圖3 蘆丁一級(jí)質(zhì)譜（A）與二級(jí)質(zhì)譜（B）圖Fig. 3 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of rutin

圖4 山柰酚-3-O-葡萄糖苷一級(jí)質(zhì)譜（A）與二級(jí)質(zhì)譜（B）圖Fig. 4 Mass spectrum (A) and tandem mass spectrum (B) of kaempferol-3-O-glucoside

表3 辣木葉黃酮結(jié)構(gòu)分析鑒定結(jié)果Table 3 Identification and analysis of flavonoids from Moringa oleifera Lam. leaves

2.3 辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

圖5 辣木葉黃酮（A）和奧利司他（B）對(duì)胰脂肪酶的抑制率曲線圖Fig. 5 Concentration dependent inhibition of pancreatic lipase activity by flavonoids purified from Moringa oleifera Lam. leaves (A) and orlistat (B)

由圖5可知，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到純化的辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.94 mg/mL，對(duì)照組奧利司他的IC50為0.17 mg/mL。質(zhì)量濃度為0.10～1.5 mg/mL時(shí)，純化的辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制率從20.12%增加到58.77%，未純化的樣品抑制率為0.78%～27.62%，且在各個(gè)質(zhì)量濃度下，純化樣品的抑制率均高于未純化的樣品，差異顯著（P＜0.05），表明辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶具有較好的抑制作用，且純化富集之后抑制效果提高。

2.4 辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用類型

黃酮類化合物通過疏水作用、氫鍵等作用力與酶蛋白結(jié)合而對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制，當(dāng)其結(jié)合到酶的活性中心部位時(shí)，對(duì)酶的抑制表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制；結(jié)合到酶蛋白的非活性部位時(shí)，對(duì)酶的抑制表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制[27-28]。酶抑制劑的分子結(jié)構(gòu)和濃度、酶蛋白的氨基酸組成及其空間構(gòu)型等，均會(huì)影響抑制劑對(duì)酶蛋白生理活性的抑制作用[29-30]。研究表明黃酮類化合物能夠和酶蛋白結(jié)合，從而影響酶蛋白的理化特性及酶學(xué)性質(zhì)。純化的辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶作用的Lineweaver-Burk結(jié)果如圖6所示，當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為0～1 mg/L時(shí)，直線在X軸的截距不變，斜率變大，米氏常數(shù)Km不變，vm值變小，表明純化的辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶的抑制作用為典型的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的抑制程度僅僅取決于抑制劑的濃度，而底物濃度的增加并不影響抑制劑的抑制效果，這為有效地將辣木葉黃酮開發(fā)為胰脂肪酶抑制劑提供了理論基礎(chǔ)。

圖6 純化的辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖Fig. 6 Lineweaver-Burk plots of flavonoids purified from Moringa oleifera Lam. leaves against pancreatic lipase

3 結(jié) 論

用微波輔助提取法提取辣木葉黃酮，提取液經(jīng)聚酰胺層析柱純化后，辣木葉黃酮的純度由純化前的（133.78±7.87）mg/g提高到（661.10±9.20）mg/g，有較好的純化效果。用UPLC-Q-Orbitrap MS技術(shù)對(duì)純化后的辣木葉黃酮的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，鑒定出11 個(gè)黃酮類化合物，分別為薔薇苷、蘆丁、牡荊素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-（6-丙二?；咸烟擒眨㈤纹に?3-O-羥甲基戊二?；肴樘擒铡愂罄钏?3-O-蕓香糖苷、槲皮素-3-O-乙?；咸烟擒铡⑸借头?3-O-羥甲基戊二?；禾擒?、山柰酚-3-O-丙二酰基己糖苷、山柰酚-3-O-葡萄糖苷。辣木葉黃酮對(duì)胰脂肪酶具有較好的抑制作用，且純化后的辣木葉黃酮抑制效果明顯提高，IC50為0.94 mg/mL，用Lineweaver-Burk法判斷出其抑制作用類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

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Structural Analysis and Anti-Pancreatic Lipase Activity of Flavonoids from Moringa oleifera Lam. Leaves

WANG Yuan, ZHENG Wen, CAI Junjun, YUAN Tianqing, GONG Xingwen*
(College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China)

The structure of flavonoids from Moringa oleifera Lam. leaves (FML) was analyzed. Meanwhile, the inhibitory effect of FML on pancreatic lipase was determined and the type of inhibition was investigated. The extraction yield of flavonoids reached (5.53 ± 0.11)% with microwave-assisted extraction using 70% ethanol as the extraction solvent. The obtained crude extract was purified by polyamide column chromatography and freeze-dried to obtain a powder. The total flavonoid content of the powder was (661.10 ± 9.20) mg/g. A total of 11 flavonoids were identified from FML by ultra performance liquid chromatography-quadrupole/electrostatic field orbital trap mass spectrometry (UPLC-Q-Orbitrap MS).The inhibitory activity of FML on pancreatic lipase was determined with p-nitrophenyl butyrate as substrate. The results showed that the purified FML had a strong inhibitory effect on pancreatic lipase, with an IC50of 0.94 mg/mL, and the type of inhibition was determined as non-competitive inhibition by the Lineweaver-Burk double reciprocal plot method.

flavonoids from Moringa oleifera Lam. leaves; UPLC-Q-Orbitrap MS; pancreatic lipase; inhibitory effect

10.7506/spkx1002-6630-201802006

TS201.4

A

1002-6630（2018）02-0031-07

王遠(yuǎn), 鄭雯, 蔡珺珺, 等. 辣木葉黃酮結(jié)構(gòu)分析及其對(duì)胰脂肪酶的抑制作用[J]. 食品科學(xué), 2018, 39(2): 31-37.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201802006. http://www.spkx.net.cn

WANG Yuan, ZHENG Wen, CAI Junjun, et al. Structural analysis and anti-pancreatic lipase activity of flavonoids from

Moringa oleifera Lam. leaves[J]. Food Science, 2018, 39(2): 31-37. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201802006. http://www.spkx.net.cn

2016-12-10

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY12C19011）；食品科學(xué)與工程浙江省重中之重一級(jí)學(xué)科基金項(xiàng)目（JYTSP20141052）

王遠(yuǎn)（1991—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wangyuan4617@163.com

*通信作者簡(jiǎn)介：宮興文（1971—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：gongxingwen@163.com