周景明，張秋麗，張改平，劉紅亮，祁艷華，宋瑞雪，耿 玥，王愛萍(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450001)

PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及淘選

周景明，張秋麗，張改平，劉紅亮，祁艷華，宋瑞雪，耿 玥，王愛萍
(鄭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450001)

用重組的PCV2 Cap蛋白免疫Balb/c小鼠，從免疫小鼠脾細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，擴增抗體重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，利用Overlap PCR方法將VH基因和VL基因組裝成單鏈抗體(ScFv)基因，將ScFv基因克隆到噬菌粒載體pCANTAB-5E中，并將重組載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌TG1中，獲得PCV2 Cap蛋白的單鏈抗體文庫，經(jīng)測定抗體庫庫容為3.58×106。通過輔助噬菌體M13K07拯救，構(gòu)建鼠源PCV2 Cap蛋白的噬菌體單鏈抗體庫。4 輪生物淘選后，經(jīng)ELISA方法檢測，最終獲得3 株能與Cap蛋白特異性結(jié)合的噬菌體克隆。

PCV2；Cap蛋白；單鏈抗體；噬菌體單鏈抗體庫

斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome, PMWS)是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染性疾病。1992年，PMWS在加拿大爆發(fā)[1]，表現(xiàn)為仔豬淋巴系統(tǒng)病變，免疫力下降，進而導(dǎo)致患豬被其他多種病原混合感染，生產(chǎn)機能下降，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

Beach等[2]和Ellis等[3]在感染PMWS的豬群中分離得到豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcine circovirus type 2,PCV2)，并確定PCV2是引起PMWS的主要病原。PCV2屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，是單鏈環(huán)狀DNA病毒。它含有2 個主要的開放閱讀框ORF1和ORF2，ORF1編碼的Rep蛋白與病毒的復(fù)制有關(guān)，ORF2編碼的Cap蛋白與病毒結(jié)構(gòu)相關(guān)，是病毒的抗原決定區(qū)[4-5]，同時也是特異性檢測PCV2抗體的理想抗原。

目前，國內(nèi)外研究人員已建立多種PCV2及其抗體的檢測方法，如病毒分離、PCR、ELISA、IFA等實驗室檢測方法[6-7]，以及簡單、方便、快速的試紙檢測方法。20世紀(jì)80年代初基因重組抗體技術(shù)的出現(xiàn)[8]，使高質(zhì)量、價廉、易得抗體的制備成為可能，為建立高效率、簡單方便的免疫分析檢測技術(shù)奠定基礎(chǔ)[9-12]。但目前尚無有關(guān)PCV2Cap蛋白噬菌體單鏈抗體的報道。

PCV2的Cap蛋白N端核定位序列影響蛋白的可溶性，且與其免疫原性無關(guān)[3]。本研究以去除核定位序列的重組Cap蛋白為抗原，利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建PCV2Cap蛋白鼠源噬菌體抗體庫，并進行初步篩選，為鼠源PCV2特異性單鏈抗體的制備奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

質(zhì)粒pET28a-ORF2、E.coliTG1、噬菌粒載體pCANTAB-5E由鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫學(xué)實驗室保存，輔助噬菌體M13K07購自NEB公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Thermo公司，DNA純化回收試劑盒、SfiⅠ和NotⅠ限制性內(nèi)切酶、Taq酶、Prime STAR HS DNAPolymerase、T4連接酶購于TaKaRa公司，Balb/c鼠購于河南省實驗動物中心。

1.2 PCR引物

鼠源抗體重鏈、輕鏈可變區(qū)引物[13]由上海生工生物工程股份有限公司合成。根據(jù)Overlap PCR的原理，VH接頭(VH-L)基因的下游引物與VL接頭(L-VL)基因的上游引物重疊25個堿基序列，引物序列見表1。

表1 試驗所用的PCR引物序列Table 1 The primers for PCR amplification

注Note: S=G(C); M=A(C);R=A(G);W=A(T).

1.3 重組Cap蛋白的表達與純化

1.3.1 Cap蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定 將pET28a-ORF2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，培養(yǎng)至對數(shù)期，加入1 mmol/L IPTG，30 ℃誘導(dǎo)表達10 h。以pET28a-BL21作對照，進行SDS-PAGE，鑒定目的蛋白表達情況。SDS-PAGE后，進行Western blot鑒定，以鼠抗His單克隆抗體(1∶2 000)作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶2 000)作為二抗，用AEC顯色液進行顯色后觀察結(jié)果。取誘導(dǎo)后的菌液進行超聲破碎并離心，分別取上清與沉淀進行SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物的可溶性。

1.3.2 蛋白純化及質(zhì)量濃度測定 采用Ni-NTA親和層析法純化Cap重組蛋白，0.5 mol/L咪唑洗脫目的蛋白，將收集到的蛋白透析后,用SDS-PAGE鑒定純化結(jié)果，同時利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質(zhì)量濃度。

1.4 Cap蛋白噬菌體抗體庫的構(gòu)建

1.4.1 小鼠免疫及小鼠脾細(xì)胞總RNA提取 以重組的Cap蛋白為免疫原免疫Balb/c鼠，免疫劑量為每只50 μg，每次免疫相隔15 d，共進行4 次免疫，第4 次免疫后第10天小鼠尾靜脈采血分離血清，利用間接ELISA測定抗體效價，從血清抗體效價較高的小鼠脾細(xì)胞中提取總RNA，使用微量紫外分光光度計測定RNA質(zhì)量濃度，并采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性。

1.4.2 抗體可變區(qū)VH、VL的擴增及拼接 以提取的總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)18為引物，參照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA，-80 ℃凍存，備用。以cDNA為模板，擴增抗體VH、VL基因，純化回收。以回收產(chǎn)物為模板，以帶有酶切位點的VH接頭、VL接頭基因的上下游引物擴增VH和VL接頭序列。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并切膠純化回收目的片段。采用Overlap-PCR的方法，將VH-L、L-VL的純化回收產(chǎn)物按1∶1比例混合，以ScFv全長基因引物擴增目的片段ScFv，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并將目的片段純化回收。

1.4.3 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建 將純化后的目的片段ScFv和載體pCANTAB-5E分別用SfiⅠ和NotⅠ進行雙酶切，酶切后的目的片段與載體以10∶1的比例混合后連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，涂布于LB-AG(含100 μg/mL氨芐抗生素及20 g/L葡萄糖)固體培養(yǎng)基上，30 ℃過夜培養(yǎng)，從平板上隨機挑取單克隆進行菌液PCR鑒定，計算重組率，并估算庫容(庫容=克隆數(shù)×稀釋倍數(shù)×重組率)。剩余菌液轉(zhuǎn)入2×YT-AG培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)期，加入M13K07(MOI=20)進行拯救，在2×YT-AK(含100 μg/mL氨芐抗生素和100 μg/mL卡那霉素)培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)。經(jīng)PEG/NaCl濃縮后溶于1 mL TBS，0.22 μm濾膜過濾，構(gòu)建噬菌體單鏈抗體庫。

1.5 PCV2 Cap蛋白噬菌體抗體庫淘選及鑒定

1.5.1 噬菌體抗體庫的淘選 以重組的Cap蛋白為包被原，進行淘選。包被質(zhì)量濃度為100 μg/mL，每孔100 μL，以PBS作為陰性對照，4 ℃過夜；加入200 μL封阻液，4 ℃封閉2 h；加入噬菌體量約為每孔2×1011PFU，37 ℃孵育1 h；TBST[TBS+0.1%(體積分?jǐn)?shù))Tween-20]洗6次；加入100 μL的Gly-HCl(pH 2.2)室溫作用7 min，再加入10 μL的Tris-HCl緩沖液(pH 9.1)，中和洗脫下來的噬菌體溶液；取5 μL進行滴度測定，剩余的感染對數(shù)生長期的TG1，M13K07輔助侵染擴增，完成第1輪淘選。重復(fù)此淘選過程，共4 輪，其中第2、3、4輪包被原的包被質(zhì)量濃度分別為75、50、25 μg/mL，洗滌次數(shù)分別為8、10、12次。

1.5.2 噬菌體抗體初步鑒定 4 輪淘選后，隨機挑取24個克隆，以碳酸鹽緩沖液稀釋重組Cap蛋白，終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，PBS作空白對照，50 g/L脫脂奶封閉。以濃縮后的噬菌體溶液作為一抗，37 ℃孵育2 h，用PBST洗板5次；以HRP標(biāo)記的anti-M13單克隆抗體作為二抗，37 ℃ 孵育2 h，PBST洗板6 次；用TMB顯色劑顯色，室溫避光顯色10 min，2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測定450 nm吸光值。

以豬瘟(classical swine fever virus, CSFV)E2蛋白為對照，終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，PBS為空白對照。50 g/L脫脂奶封閉，每孔100 μL噬菌體，孵育2 h，加入HRP標(biāo)記的anti-M13單抗，孵育2 h，用TMB顯色，顯色10 min后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定450 nm吸光值。

在Cap蛋白包被的96孔板(包被質(zhì)量濃度為10 μg/mL)中加入梯度稀釋的噬菌體抗體溶液，以M13KO7為陰性對照；以HRP標(biāo)記anti-M13單克隆抗體，用TMB顯色，室溫避光顯色10 min后終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀取450 nm吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組Cap蛋白的表達與純化

pET28a-ORF2-BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用SDS-PAGE分析目的蛋白的表達(圖1-A)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組表達菌經(jīng)誘導(dǎo)后在26 ku附近有明顯的表達條帶，與Cap重組蛋白預(yù)期大小一致；表達的蛋白進行Western blot分析(圖1-B)，結(jié)果抗His單克隆抗體可以特異性識別此蛋白，表明Cap重組蛋白得到正確表達；超聲破碎后分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析(圖1-C)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組Cap蛋白主要以可溶性的形式存在于上清中。

將鎳柱親和層析純化透析后的Cap蛋白進行SDS-PAGE分析(圖2-A)，結(jié)果顯示，純化后僅在目的條帶位置約26 ku處存在單一條帶，說明純化效果良好；采用BCA法測定重組Cap蛋白的質(zhì)量濃度，根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2-B)獲得目的蛋白的質(zhì)量濃度為382 μg/mL。

A、B：表達產(chǎn)物鑒定 Express product identification；1.pET-28a-ORF2-BL21表達產(chǎn)物 Induction products of pET-28a-ORF2-BL21; 2. pET-28a-BL21表達產(chǎn)物 Induction products of pET-28a-BL21; C：Cap蛋白的可溶性分析 Solubility analysis of recombined Cap protein;M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(Thermo 26616) Protein marker;1.誘導(dǎo)上清 Induction supernatant;2. 誘導(dǎo)沉淀 Induction sediment

圖1PCV2Cap蛋白的表達及鑒定
Fig.1IdentificationoftheexpressedPCV2Capprotein

A：Cap蛋白純化后鑒定 The identification of Cap protein after purification；M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein marker;1～3.純化后的Cap蛋白 Purified Cap proteins;B：蛋白質(zhì)量濃度測定 Determination of protein mass concentration；y.在562 nm處的吸光值OD562nm；x.BSA的質(zhì)量濃度 The mass concentration of BSA

圖2Cap蛋白的純化及質(zhì)量濃度檢測
Fig.2PurificationandmassconcentrationdetectionofCapprotein

2.2 抗體庫構(gòu)建及淘選結(jié)果鑒定

將Cap蛋白免疫的小鼠血清采用間接ELISA檢測抗體，結(jié)果如圖3所示。免疫后，效價最高的3號小鼠血清抗體滴度達到1∶64 000。提取的小鼠脾細(xì)胞總RNA經(jīng)分光光度計測得質(zhì)量濃度為998 ng/μL，A260/A280為1.92，取2 μL進行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖4-A)，能清晰的看到28S、18S條帶，且28S條帶較18S的亮，說明提取的RNA完整性良好。以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板，進行抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳分析(圖4-B)，結(jié)果表明，擴增的VH基因片段大小約350 bp，VL基因片段大小約320 bp，與預(yù)期相符；VH-L、L-VL的擴增結(jié)果如圖4-C所示，擴增的片段大小約400 bp，與理論相符；VH-L與L-VL隨機拼接后獲得的ScFv基因片段約750 bp(圖4-D)，與預(yù)期相符。

涂板后，隨機挑取19 個克隆進行菌液PCR鑒定(圖5)，19 個克隆中，有17 個克隆能擴增出約750 bp大小的片段，說明ScFv成功插入到噬菌粒載體pCANTAB-5E中，重組率為89.5%。經(jīng)計算，初級抗體庫庫容為3.58×106。

圖3 小鼠血清抗體效價ELISA檢測Fig.3 The ELISA of anti-serumtiter

A:脾細(xì)胞總RNA The total RNA in spleen cells; B:抗體可變區(qū)基因的擴增 Amplified production of antibody variable region gene; M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) Protein marker;1.VH; 2.VL;C: 抗體可變區(qū)接頭基因的擴增 Amplification of the gene in the variable region of antibody; 1.VH-L; 2.L-VL; D:目的基因ScFv的拼接與擴增 Splicing and amplification of target geneScFv;1～2.ScFv

圖4脾細(xì)胞RNA的提取及目的基因PCR鑒定
Fig.4SpleenRNAextractionandPCRproductoftargetgene

M.DNA marker;1～19.隨機挑取的19個克隆 19 clones selected randomly

在4 輪篩選過程中，噬菌體回收率逐輪升高，特異性噬菌體得到顯著富集(圖6-A)。隨機挑取24 個克隆進行ELISA檢測，結(jié)果如圖6-B，24 株克隆中有10 株為陽性克隆(P/N≥3為陽性)；選取OD450值較高的3 株噬菌體陽性克隆(1、10、18)，通過ELISA法對這3 株噬菌體抗體進行檢測，結(jié)果如圖6-C所示，初步鑒定ScFv-1、ScFv-10、ScFv-18噬菌體抗體可以與Cap蛋白特異性結(jié)合；同時對以上3株陽性噬菌體進行擴增，濃縮定量后，按10倍梯度稀釋進行間接ELISA檢測，結(jié)果如圖6-D所示，陽性克隆ScFv-P18表現(xiàn)出較高親和力，可以用于進一步的研究。

A:噬菌體抗體庫的淘選 The panning of phage antibody library; B:噬菌體ELISA鑒定 Identification of phage ELISA;C:陽性噬菌體克隆間接ELISA法檢測 Detection of positive phage clones by indirect ELISA method;D:陽性噬菌體克隆定量分析 Quantitative analysis of positive phage clones

圖6噬菌體單鏈抗體庫的淘選及鑒定
Fig.6ThescreeningandidentificationofphagedisplayScFvlibrary

3 討 論

PCV2的早期檢測對PCV2的防控起著至關(guān)重要的作用，建立快速、靈敏、方便的檢測技術(shù)，對由PCV2引起的各種疾病的早期診斷及防控具有重要的現(xiàn)實意義。目前，已經(jīng)有單克隆抗體用于PCV2的檢測，但制備單克隆抗體周期長，同時需要進行大量的細(xì)胞培養(yǎng)工作，試驗要求及費用高，雜交瘤細(xì)胞還可能會逐漸失去分泌抗體的能力[14]；噬菌體抗體庫技術(shù)用于基因工程抗體的制備，不僅可以省去繁瑣復(fù)雜的雜交瘤細(xì)胞制備過程，直接從被感染的動物中獲取基因抗體，節(jié)約時間且特異性強，而且能夠進行大規(guī)模生產(chǎn)。

本研究以重組的Cap蛋白作為免疫原，成功構(gòu)建庫容為3.58×106的鼠源抗PCV2 Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫，并篩選出3株特異性的陽性噬菌體菌株，與已報道的PCV2 Cap蛋白納米抗體相比[15]，材料來源及操作更簡單方便。在4輪淘選過程中，包被蛋白質(zhì)量濃度逐漸降低，洗滌次數(shù)依次增加，以提高篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性，獲得特異性結(jié)合的噬菌體；鑒定過程中，用CSFV主要結(jié)構(gòu)蛋白E2[16-17]作為陰性對照，進行特異性檢測，以此作為對照能排除非Cap蛋白(His標(biāo)簽)引起的假陽性，證明篩選出的噬菌體抗體能與Cap蛋白特異性結(jié)合。本研究篩選出特異性噬菌體抗體克隆，為特異性單鏈抗體的制備奠定基礎(chǔ)。

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ConstructionandScreeningofAnti-PCV2CapProteinPhageDisplayScFvLibrary

ZHOU Jingming, ZHANG Qiuli, ZHANG Gaiping, LIU Hongliang, QI Yanhua, SONG Ruixue, GENG Yue and WANG Aiping
(School of Life Science, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China)

Balb/cmice were immunized with recombinant PCV2 Cap protein, and the total RNA was isolated from spleen cells. The variable region of immunoglobulins heavy chain(VH) and light chain(VL) genes were amplified by RT-PCR. TheScFvsequence was constructed by fusingVHgene withVLgene via overlap-PCR, and then the sequence was cloned into the phagemid vector pCANTAB-5E. APCV2 Cap proteinScFvlibrary, which consists of approximately 3.58×106individual colonies, was constructed by transforming the recombinant plasmid into theE.coliTG1 cells. Furthermore, the PCV2 Cap protein phage display library was constructed by infecting the transformed cells with M13K07 helper phage. After four rounds of panning,three Cap protein-specific phage clones were isolated.

PCV2; Cap protein;ScFvantibody; Phage-displayScFvlibrary

2016-12-13

2017-01-05

The National Key Research and Development Project(No.2016YFD0500704); Zhengzhou Science and Technology Innovation Team Project(No.131PCXTD622); Science and Technology Project of Henan Province(No.132102110142).

ZHOU Jingming, male, Ph. D,associate professor,master supervisor. Research area:molecular immunology and immunological detection technology.E-mail:zhoujingming@zzu.edu.cn

WANG Aiping, female, Ph. D, professor,doctoral supervisor. Research area: molecular immunology and immunological detection technology. E-mail: pingaw@zzu.edu.cn

顧玉蘭ResponsibleeditorGUYulan)

日期：2017-12-21

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171221.1650.006.html

2016-12-13

2017-01-05

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500704)；鄭州市科技創(chuàng)新團隊(131PCXTD622)；河南省科技攻關(guān)(132102110142)。

周景明，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事分子免疫學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)研究。E-mail：zhoujingming@zzu.edu.cn

王愛萍，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子免疫學(xué)和免疫學(xué)檢測技術(shù)研究。E-mail：pingaw@zzu.edu.cn

S852.43

A

1004-1389(2017)12-1754-07