王丹丹，付化瑞，張彥文(. 遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 8003；.北票市林業(yè)局，遼寧北票 00)

甜櫻桃栽培種指紋圖譜構(gòu)建及遺傳多樣性分析

王丹丹1，付化瑞2，張彥文1
(1. 遼東學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，遼寧丹東 118003；2.北票市林業(yè)局，遼寧北票 122100)

為了對甜櫻桃品種進行分子鑒別及分析不同品種間的親緣關(guān)系，以葉片直接進行PCR擴增，采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建生產(chǎn)上常用的40個甜櫻桃栽培品種的數(shù)字指紋圖譜和模式指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(Cluster Project)并進行遺傳多樣性分析。采用24對甜櫻桃核心引物對所有品種基因組進行擴增，共檢測到129個等位位點，包括118個多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為91.2%。每對引物擴增出的等位位點數(shù)3～10個，每對引物平均擴增5.38個基因型，擴增條帶大小介于100～500 bp，多態(tài)信息含量(PIC)為0.654，基因流(Nm)為1.402，平均雜合率為0.495。8對引物，即PA17、PA32、PA51、PA54、PA73、PA99、PA101和PA202可作為指紋圖譜構(gòu)建的首選引物，利用其中的PA17、PA51、PA99、PA101和PA202以引物組合方式構(gòu)建指紋圖譜可區(qū)分40個品種；聚類分析表明在遺傳距離0.71處40個品種被分為5類，聚類結(jié)果與品種的特性及成熟期具有較高的一致性。

甜櫻桃；EST-SSR標(biāo)記；指紋圖譜；遺傳多樣性；聚類分析

歐洲甜櫻桃(PrunusaviunLinn.)又名大櫻桃、甜櫻桃，隸屬于薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prunus)，果粒大、顏色鮮艷、營養(yǎng)豐富、酸甜可口，經(jīng)濟價值高[1]；原產(chǎn)于西亞及歐洲東南部，19世紀(jì)末、20世紀(jì)初引入中國，由于甜櫻桃冬季休眠期需7.2 ℃以下低溫處理900～1 400 h，而中國長江以南絕大部分地區(qū)不能滿足這一條件，所以甜櫻桃以江北栽培為主，西南高地有少量發(fā)展，但品質(zhì)遠不如西北黃土高原產(chǎn)區(qū)，總體上，中國甜櫻桃在布局上呈現(xiàn)低緯度高海拔、高緯度低海拔分布態(tài)勢，初步形成山東、遼寧、陜西三大產(chǎn)區(qū)，安徽、江西、河北、甘肅、新疆、山西、北京、四川、重慶、云南、貴州、青海等多省(市)局部有所發(fā)展的產(chǎn)業(yè)布局，經(jīng)過多年不斷繁衍擴展，目前全國種植總面積超過10萬hm2，甜櫻桃年產(chǎn)量達60余萬t，已成為中國水果的重要組成成分，甜櫻桃的種植成為典型的高效產(chǎn)業(yè)之一，在中國方興未艾，具有蓬勃發(fā)展之勢[2-8]。20世紀(jì)80、90年代后，由于甜櫻桃生產(chǎn)價值較高，各地紛紛引種，呈現(xiàn)適宜區(qū)全面開花式發(fā)展，種植范圍、生產(chǎn)規(guī)模持續(xù)擴大，進入快速發(fā)展階段，但大都忽略種質(zhì)資源的保護和優(yōu)良品種的選育，且個別種植戶采收母本的同時人為摻雜父本或其他品種，導(dǎo)致種質(zhì)真實性及純度受到嚴(yán)重影響；此外，異物同名、同物異名、變種以及遺傳倍性等問題，使甜櫻桃市場處于混亂狀態(tài)，給育種業(yè)和種植業(yè)造成損失。甜櫻桃雜交種的真實性和純度是其制種面臨的關(guān)鍵問題，也是難關(guān)[9]。中國甜櫻桃種類繁多，每年還會有新品種發(fā)布，然而，目前還沒有一套適合鑒定其種質(zhì)真實性和純度的可靠方法。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建甜櫻桃DNA指紋圖譜對其種質(zhì)的快速鑒定、新品種選育以及種內(nèi)親緣關(guān)系的研判等具有重要意義，對規(guī)范種植業(yè)市場、維護種植者的權(quán)益也具有指導(dǎo)性意義。

品種真實性和純度鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定法、生物化學(xué)法及分子標(biāo)記鑒定法等。因受材料本身與環(huán)境條件的影響，前兩者已很少作為單一的評判標(biāo)準(zhǔn)。由于EST-SSR(Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeats)分子標(biāo)記為共顯性、擴增譜帶少、易識別、統(tǒng)計方便，以及EST來自DNA編碼區(qū)，其序列保守性相對較高等優(yōu)點，已成為品種真實性和純度鑒定的有效方法[10]。中國已建立多種植物的指紋圖譜以鑒定種質(zhì)的真實性和純度，如《水稻品種鑒定DNA指紋法》NY/T1433-2007、《玉米品種鑒定DNA指紋法》NY/T1432-2007等。利用EST-SSR分子標(biāo)記構(gòu)建甜櫻桃DNA指紋譜圖的研究尚未見報道。本研究中，采用EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立甜櫻桃DNA指紋譜圖，為其種質(zhì)資源的真實性和純度鑒定奠定基礎(chǔ)。同時，在研究過程中以葉片直接進行PCR擴增，簡化試驗程序、優(yōu)化PCR體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用常規(guī)種植的40個具有不同產(chǎn)地的甜櫻桃品種為材料(表1)，由大連旅順、煙臺、北京等甜櫻桃研究機構(gòu)或甜櫻桃品種引進機構(gòu)提供。春季或夏季采集生長旺盛的健康、幼嫩葉片于硅膠中干燥保存，以備提取基因組DNA[11]。試驗分析工作在遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院進行。

1.2 EST-SSR引物的開發(fā)

從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Infoemation,NCBI)EST數(shù)據(jù)庫下載甜櫻桃的所有EST序列，分別利用Blastclust、est_timmer、misa.pl和primer 3批量設(shè)計EST-SSR引物；用Blast對所開發(fā)的引物進行比對驗證[12-13]，最后引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 葉片的堿處理

將葉片剪碎，大小不宜超過2 mm2，否則不利于后續(xù)的PCR擴增。將葉片放入含有40 μL 0.25 mol·L-1NaOH的Eppendorf管中，沸水煮30 s；加入40 μL 0.25 mol·L-1HCl和20 μL 0.5 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0，含有φ=0.25% Nonidet-P-40)，再次置沸水中2 min，隨后取出葉片，直接進行PCR擴增[12-16]。

1.4 EST-SSR PCR擴增

在50 μL PCR反應(yīng)體系加入1片經(jīng)堿處理的葉片。反應(yīng)液組成為：dNTPs (2.5 mmol·L-1) 4 μL，引物(10 μmol·L-1)各2 μL，TaqDNA聚合酶(5 U·μL-1)0.5 μL，MgCl2(1.5 mmol·L-1) 3 μL，10×緩沖液5.0 μL，加滅菌ddH2O至總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性50 s，59 ℃或60 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物于4 ℃保存[17-21]。擴增產(chǎn)物采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、銀染和圖譜分析[22]。所用的24對引物是從筆者已開發(fā)的300余對EST-SSR引物中篩選得到的，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等特點(表2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 40種甜櫻桃栽培品種Table 1 The 40 varieties of sweet cherry

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR引物擴增

利用24對引物對40份甜櫻桃進行PCR擴增，部分引物擴增圖見圖1，共獲得129個等位位點，包括118個多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為91.2%。每對引物擴增出的等位位點數(shù)在3～10個，每對引物平均擴增5.38個基因型，擴增的條帶大小介于100～500 bp。多態(tài)信息含量(PIC)是表示微衛(wèi)星DNA變異程度高低的一個指標(biāo)，反映微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高低，其取決于檢測的等位基因的數(shù)目和該基因的基因頻率分布，一般來說，PIC>0.5，多態(tài)性較高；0.25≤PIC≤0.5多態(tài)性適中；PIC<0.25，多態(tài)性較低。而本研究24對EST-SSR引物的平均PIC值為0.654(0.500～0.807，見表2)，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性；基因流(Nm)平均值為1.402(0.496～3.128，見表2)，F(xiàn)ST平均值為0.180(0.074～0.335，P<0.05，見表2)。

M.DM 2 000 DNA marker;1～40.品種編號 The numbers of the 40 varieties

表2 EST-SSR引物在40份供試材料中的擴增情況Table 2 The amplification of EST-SSR primers in 40 varieties

2.2 EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建

24對引物中有8對引物具有區(qū)別不同品種的能力，即PA17、PA32、PA51、PA54、PA73、PA99、PA101和PA202(表3)。PA17區(qū)別品種最多為1、6、9、11、14、16、17、20、21、26、28、30、34、37和40，其中2、5、8、18、23、31、33、38和39帶型一致；3、7、10、12、13、24、27、29和36帶型一致；15、19、22和25帶型一致；32和35帶型一致。

根據(jù)8對引物的多態(tài)性，采用特殊引物法可鑒定40份甜櫻桃品種，其余5種不能鑒定，即5、10、18、25和32。因此，采用引物組合法只需5對EST-SSR引物(即PA17、PA51、PA99、PA101和PA202)便可完全區(qū)分40份甜櫻桃品種(指紋圖譜見表4)。采用ClusterProject軟件對構(gòu)建的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行分析，形成指紋模式圖譜(圖2)，由此，以2種EST-SSR指紋分析方式共同建立甜櫻桃的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。

表3 基于8對EST-SSR引物區(qū)分40份甜櫻桃品種的能力Table 3 The ability to distinguish 40 sweet cherry varieties based on 8 pairs of EST-SSR primers

表4 甜櫻桃品種的DNA數(shù)字指紋圖譜Table 4 The digital fingerprinting of sweet cherry varieties

1～40.品種編號 The numbers of the 40 varieties

2.3 聚類分析

采用UPGMA進行聚類分析，構(gòu)建40份甜櫻桃品種的遺傳關(guān)系樹狀圖(圖3)。40份甜櫻桃品種被劃分為5個類群，聚類結(jié)果與品種的形態(tài)特征及來源具有較高的一致性，即形態(tài)特性相似和來源于同一地區(qū)的品種聚在一個類群種，第Ⅰ類群有7個品種，包括‘友誼’‘金頂紅’‘養(yǎng)老’’黑珍珠’‘伯蘭特’‘桑提娜’‘塞爾維亞’，該類群品種果型均為心臟型，果皮深紅色，且均晚熟；第Ⅱ類群有8個品種，包括‘莫利’‘8-102’‘艷陽’‘長把紅’‘砂蜜豆’‘朝陽蜜’‘抉擇’‘晚紅珠’，大部分品種果型雞心型或腎型，果皮洋紅色，早熟；第Ⅲ類群有7個品種，即‘先鋒’‘薩米脫’‘美早’‘宇宙’‘龍冠’‘岱紅’‘拉賓斯’，大部分果型為近圓形，中早熟品種，果皮多為濃紅色至紫紅色，果肉紅色或紫紅色；第Ⅳ類群有‘晶玲’‘甜心’‘紅燈’‘彩霞’‘早紅寶石’‘布魯克斯’‘早丹’7個品種聚在一起，果型圓形、多為早熟品種，果皮紫紅色，果肉紅色至紫紅色；第Ⅴ類群包括11個品種，有‘佳紅’‘明珠’‘晚蜜’‘春艷’‘那翁’‘豐錦’‘佐錦藤’‘斯特拉’‘雷尼’‘巨紅’‘彩虹’，果型寬心臟型，果皮黃色或黃色帶紅暈，果肉黃色。

圖3 40份甜櫻桃品種聚類圖Fig.3 The dendrogram of 40 sweet cherry cultivars

3 討 論

本研究的40個甜櫻桃品種在遺傳距離0.71處被劃分為5類，大部分以品種形態(tài)特征和成熟季節(jié)進行的類別劃分。此外，同一產(chǎn)地的品種聚在一起的較為普遍，比如由大連農(nóng)科院選育的新品種‘佳紅’‘巨紅’和‘明珠’3個品種聚為一類，說明目前生產(chǎn)上同一地區(qū)反復(fù)使用同一授粉系或者不育系雜交配種的現(xiàn)象較普遍，導(dǎo)致群體內(nèi)部基因流較大(Nm=1.402)。觀測雜合度(Ho=0.495)都略低于期望雜合度(He=0.670)，性狀相似現(xiàn)象亦較為普遍，造成同一地區(qū)遺傳基礎(chǔ)較差。此外，有些國產(chǎn)品種和國外品種聚在一起，親緣關(guān)系較近，說明國際合作育種工作已有成效。為了避免中國甜櫻桃品種的遺傳基礎(chǔ)出現(xiàn)狹窄現(xiàn)象，未來有必要加強國內(nèi)外合作育種或雜交配育更加優(yōu)良的甜櫻桃品種。

目前，很多國家審定新品種都需要DUS證明新品種的特性與現(xiàn)有品種不同，而部分品種僅是育種者提供品種，經(jīng)過區(qū)域試驗后，對于達到要求的品種即可申請為新品種，而對于新品種的描述也只限于形態(tài)學(xué)的特征，造成品種同物異名和異物同名等現(xiàn)象。利用EST-SSR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，如不含內(nèi)含子，在各組織、各發(fā)育時期均可檢測到，且不受季節(jié)、環(huán)境等因素的限制；數(shù)量之多可覆蓋整個基因組；多態(tài)性高，成共顯性，能夠鑒別出純合、雜合基因型等，即使品種間形態(tài)學(xué)差異較小，只要在遺傳基礎(chǔ)上仍有差異，EST-SSR就可發(fā)揮作用。

本研究對供試的40個甜櫻桃品種，采用葉片直接進行PCR擴增，簡化PCR程序、篩選出適合鑒定真實性和純度的5對核心引物，構(gòu)建現(xiàn)有甜櫻桃種質(zhì)的DNA指紋數(shù)字圖譜和EST-SSR指紋模式圖譜數(shù)據(jù)庫，指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建對未來解決甜櫻桃出現(xiàn)的品種糾紛提供服務(wù)。隨著甜櫻桃新品種的不斷出現(xiàn)，指紋圖譜構(gòu)建工作需不斷加強，要大量篩選新的甜櫻桃EST-SSR核心引物，為新品種做指紋圖譜，以保證中國甜櫻桃產(chǎn)業(yè)健康有序地繁榮發(fā)展。

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EstablishmentofDNAFingerprintingandAnalysisofGeneticDiversityamongPrunusaviunCultivars

WANG Dandan1,FU Huarui2and ZHANG Yanwen1
(1.College of Agriculture, Eastern Liaoning University, Dandong Liaoning 118003, China;2.Forestry Burean of Beipiao,Beipiao Liaoning 122100,China)

In order to identify the cultivars ofPrunusaviunand analyze the genetic relationship among different cultivars at a molecular level, we constructed the digital fingerprint and model fingerprint(ClusterProject)for 40 commonPrunusaviuncultivars using EST-SSR(Expressed Sequence Tag-Simple Sequence Repeats) molecular markers. The 24 pairs of primers amplified a total of 129 alleles including 118 polymorphic alleles with a polymorphism rate of 91.2%. Each pairs of primers can amplify 3-10 alleles, with an average of 5.38 alleles per locus. The length of amplified products was 100-500 bp, with the mean value ofPIC(Polymorphism information content) being 0.654,Nm(Gene flow) being 1.402, and the mean value ofHo(Heterozygosity) being 0.495. Among the 24 primers, 8 primers can be used as a preferred choice for fingerprinting, namely PA17, PA32, PA51, PA54，PA73, PA99，PA101 and PA202, in which 5 primers(PA17, PA51, PA99, PA101 and PA202) can be employed in combination to identify the 40 cultivars. Cluster analysis showed that the 40 cultivars can be divided into five groups at a genetic distance of 0.71; the genetic relationship as indicated by the cluster completely reflected the characteristics and the maturation stage of the cultivars.

Prunusaviun; EST-SSR markers; Fingerprinting; Genetic diversity; Cluster analysis

2017-06-05

2017-10-30

The National Natural Science Fund(No.31370400); Dandong Project of Science and Techenology in 2016 (No.2016KJ001); Eastern Liaoning University Foundation Youth Fund Project(No.2015QN006).

WANG Dandan,female,lecturer.Research area:biochemistry and molecular biology.E-mail:wangdandansq@sina.com

郭柏壽ResponsibleeditorGUOBaishou)

日期：2017-12-21

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20171221.1650.012.html

2017-06-05

2017-10-30

國家自然科學(xué)基金(31370400)；丹東市2016科技攻關(guān)(2016KJ001)；遼東學(xué)院青年基金(2015QN006)。

王丹丹，女，碩士，講師，從事分子生物學(xué)研究。E-mail:wangdandansq@sina.com

Q663.4

A

1004-1389(2017)12-1813-08