李 婧 吳春陽 張 瑩 申貴男 金成浩

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319)

吡唑鋅配合物的合成、晶體結(jié)構(gòu)及抗肝癌細(xì)胞活性

李 婧＊吳春陽 張 瑩 申貴男 金成浩

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319)

通過溶劑揮發(fā)法合成了鋅配合物 [Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)，Hppo=5-苯基-3-羥基吡唑，利用元素分析、FTIR以及X射線衍射法對配合物1進(jìn)行表征。晶體結(jié)構(gòu)顯示配合物屬于單斜晶系，P21空間群。檢測了配合物1對肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B和Huh7的細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞毒性的影響，結(jié)果表明配合物1對腫瘤細(xì)胞具有明顯的抑制作用。

吡唑；抗腫瘤活性；金屬配合物；晶體結(jié)構(gòu)

0 引 言

吡唑啉酮化合物具有多種生物活性，例如消炎、抗菌、抗腫瘤等，在醫(yī)藥、農(nóng)藥等方面得到廣泛的應(yīng)用[1-6]，原因在于其具有多種配位形式，可以與多種金屬形成結(jié)構(gòu)各異的配合物。研究發(fā)現(xiàn)吡唑類金屬配合物常表現(xiàn)出較吡唑配體更強(qiáng)的生物活性[6-7]，其抗腫瘤作用使其成為抗腫瘤新藥開發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3-13]。例如Caruso等[10]報(bào)道了吡唑啉酮-5氧鈦配合物，對乳腺癌細(xì)胞TA-3有較強(qiáng)的抑制作用，IC50為 90 μmol·L-1。 Budzisz等[11]合成 Pt和 Pd 的吡唑配合物，對人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞和淋巴白血病NALM-6細(xì)胞均有較強(qiáng)的抑制作用，IC50均小于10 μmol·L-1。稀土金屬在與吡唑啉酮形成配合物后也表現(xiàn)出抗腫瘤活性，何其莊等[12]報(bào)道的Gd配合物對人白血病K562細(xì)胞有明顯的體外增值抑制作用(IC50=7.5 μmol·L-1)。吡唑啉酮金屬配合物的開發(fā)和其抗腫瘤活性作用研究具有重要價值[14]。

鋅是生物體內(nèi)必需的微量元素，參與多種新陳代謝。在對非鉑類抗癌藥物的研究中，鋅配合物的研究還較少[14-19]。 Zhang等[18]以 1-(3-(2-吡啶基)吡唑-1-基甲基)萘為配體合成吡唑類鋅配合物，該配合物能有效的結(jié)合DNA，并且具有抑制癌細(xì)胞增值的作用。仇曉陽等[19]報(bào)道肼基二硫代甲酸芐酯席夫堿的鋅配合物對腫瘤細(xì)胞MKN45有弱抑制性。Kovala-Demertzi等[20]合成了一組鋅與胺苯硫脲類配合物，表現(xiàn)出具有和順鉑相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性。Stanojkovic等[21]合成的4-氟苯基哌嗪鋅的配合物對腫瘤增值效果強(qiáng)于順鉑，IC50值在 26～90 nmol·L-1。 Lopes等[22]以吡啶基縮氨基硫脲化合物為配體與鋅形成配合物，體內(nèi)抗腫瘤研究表明，配合物對MDA-MB-231和HepG2細(xì)胞具有較強(qiáng)的腫瘤抑制作用。鋅類配合物的抗腫瘤活性研究具有重要的研究意義。

5-苯基-3-羥基吡唑(Hppo)結(jié)構(gòu)當(dāng)中含有2個N原子，一個氧原子，具有多種配位形式，其合成簡單。以此化合物為配體，形成金屬配合物并研究磁學(xué)性質(zhì)早有報(bào)道[23]，但未見抗腫瘤活性研究。本文以Hppo為配體與ZnCl2反應(yīng)，得到單核配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)，并初步用體外實(shí)驗(yàn)研究配合物對人肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B和Huh7的抑制作用，金屬配合物表現(xiàn)出明顯的腫瘤抑制活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑與藥品

元素分析在Perkin-Elmer 240C元素分析儀上測定。晶體結(jié)構(gòu)在Bruker Smart APEX CCDⅡ衍射儀上完成。紅外光譜使用Nicolet 380型紅外光譜儀由KBr壓片法測定。酶標(biāo)儀使用Bio-Tek公司酶標(biāo)儀。

試劑和藥品：DMEM高糖(美國Hyclone公司)；胎牛血清(Solarbio公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；青鏈霉素(Solarbio公司)；5-氟尿嘧啶(Macklin公司)；臺盼藍(lán)(Sigma 公司)；PBS 粉末(Biosharp 公司)；MTT(二甲基溴化四氮唑藍(lán)，Macklin公司)；人肝癌細(xì)胞(HepG2，Hep3B，Huh7)取自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。其他試劑均為分析純。配體Hppo由水合肼和苯乙酰乙酸乙酯通過文獻(xiàn)方法制備[23]。

1.2 配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)的合成

在圓底燒瓶中加入無水ZnCl2(0.068 g,0.5 mmol)，無水乙醇(6 mL)，在64℃下攪拌直至全部溶解。隨后加入5-苯基-3-羥基吡唑(Hppo)[24](0.080 g，0.55 mmol)，攪拌回流1 h，過濾，濾液靜置于無震動的平臺，用保鮮膜將燒杯封口，并在保鮮膜上扎若干小孔，1周后有白色塊狀晶體產(chǎn)物，產(chǎn)量0.028 g，產(chǎn)率26%。元素分析按C27H23ClN6O3Zn計(jì)算，實(shí)測值(%，括號內(nèi)為計(jì)算值)C 55.23(55.88)，H 4.10(3.99)，N 14.32(14.48)。IR(KBr，cm-1)：3 422m，3 339m，3 145m，1 618m，1 567m，1 535s，1 501s，756s，696m，548m。

1.3 晶體結(jié)構(gòu)測定

取適宜大小的配合物1的單晶，用(Bruker Smart APEX CCDⅡ)衍射儀在173(2)K條件下收集衍射數(shù)據(jù)(SMART程序)。衍射光源經(jīng)石墨單色化的Mo Kα 射線 (λ=0.071 073 nm)， 掃描方式為 φ-ω scan。收集到的衍射數(shù)據(jù)用SAINT程序還原后再用SADABS程序作吸收校正。結(jié)構(gòu)用SHELXS-97程序由直接法解出[25]，并用SHELXL-97程序[25]對非氫原子坐標(biāo)及其各向異性溫度因子進(jìn)行全矩陣最小二乘法精修至收斂；氫原子坐標(biāo)由理論計(jì)算確定。有關(guān)晶體學(xué)數(shù)據(jù)如表1所示，主要鍵長鍵角如表2所示。

CCDC：1561437。

表1 配合物1的晶體學(xué)數(shù)據(jù)Table1 Crystallographic data of complex 1

表2 配合物1主要的鍵長(nm)和鍵角(°)Table2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complex 1

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌細(xì)胞(HepG2、Hep3B、Huh7)置于含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2(V/V，下同)條件下培養(yǎng)至第三代對數(shù)生長期。

1.5 配合物1的體外抗癌活性測試

1.5.1 對細(xì)胞形態(tài)的影響

選擇對數(shù)生長期并且狀態(tài)良好的HepG2、Hep3B和Huh7細(xì)胞分別接種于96孔板，濃度為2×104mL-1，每孔 200 μL。 于 5%CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h后，細(xì)胞貼壁并恢復(fù)生長狀態(tài)后，棄去培養(yǎng)液，并加入1%FBS培養(yǎng)液200 μL。配合物 1用DMSO 溶劑溶解， 稀釋至 125.00、62.5、15.63、3.91 μg·mL-1四個加藥終濃度，并分別取 1 μL加入到細(xì)胞中。在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.5.2 MTT法檢測細(xì)胞毒性

分別取對數(shù)生長期HepG2、Hep3B和Huh7細(xì)胞接種于96孔板上，濃度為5×104mL-1，每孔液體為200 μL，即每孔細(xì)胞數(shù)約為1×104個。將96孔培養(yǎng)板置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h至細(xì)胞完全貼壁后，棄去培養(yǎng)液并在每孔加入1%FBS培養(yǎng)液200 μL，饑餓處理2 h。用DMSO將配合物1稀釋至濃度 為 250.00、125.00、62.5、31.25、15.63、7.82 μg·mL-1， 實(shí)驗(yàn)組每孔滴加藥物 1 μL； 藥物 ZnCl2、Hppo和陽性對照藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)，每孔滴加1 μL，濃度為 250.00、125.00、62.50、31.25 μg·mL-1(DMSO溶劑)。DMSO最終濃度小于1%，基本不影響細(xì)胞活性。另設(shè)陰性對照組和溶劑對照組(DMSO)。將加入配合物1的96孔培養(yǎng)板置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng) 24、48、72 h， 而將加入 ZnCl2、Hppo和5-氟尿嘧啶的96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h。離心，棄去上層培養(yǎng)基，各孔加入90 μL不含血清的DMEM培養(yǎng)基與10 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT，置于37℃、5%CO2條件下再繼續(xù)培養(yǎng)4 h。移去上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩 5 min，利用酶標(biāo)儀于490 nm處測定各孔吸光度值，計(jì)算細(xì)胞存活率，繪制成細(xì)胞存活率曲線圖，用SPSS計(jì)算細(xì)胞毒性IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)的合成與紅外光譜解析

無水ZnCl2與Hppo反應(yīng)要在加熱的條件下反應(yīng)，溫度低會導(dǎo)致ZnCl2析出，影響產(chǎn)率。反應(yīng)結(jié)束后趁熱過濾，靜置1周左右，即得無色透明塊狀晶體。晶體產(chǎn)率偏低，溶劑揮發(fā)時間增長，會使產(chǎn)率增加，但是晶體多為碎晶。配合物的紅外譜圖顯示，在3 422 cm-1為OH吸收峰，3 339 cm-1為NH吸收峰，在 1 618、1 567、1 501 cm-1，出現(xiàn)苯環(huán)及吡唑環(huán)ν(C=C)雙鍵吸收峰，1 535 cm-1為 ν(C=N)吸收峰，756、696 cm-1，為單取代苯環(huán) ν(C-H)吸收峰，548 cm-1處出現(xiàn)Zn-N鍵吸收峰。

2.2 晶體結(jié)構(gòu)描述及表征

圖1為配合物1的晶體結(jié)構(gòu)，其主要鍵長、鍵角列于表2，其分子內(nèi)和分子間氫鍵列于表3。該分子為單核配合物，鋅原子為四配位，與3個吡唑環(huán)上N原子和1個Cl原子配位形成一個扭曲的四面體構(gòu)型。其中Zn-N的鍵長分別為0.201 4(7)、0.198 2(7)和0.197 7(7)nm，Zn-Cl的鍵長較長，為0.226 2(2)nm；鋅與配位原子的鍵角從105.6(3)°到113.9(2)°。

晶體結(jié)構(gòu)解析表明，N1與鋅原子鍵合，在此種情況下，吡唑環(huán)與鋅原子可形成3種鍵合方式，如圖2所示：方式Ⅰ中，N1的孤對電子與Zn配位；方式Ⅱ、Ⅲ中，N1失去質(zhì)子與Zn形成離子鍵。紅外數(shù)據(jù)中未見C=O吸收峰，說明配合物中不含有方式Ⅲ；1 535 cm-1處的 ν(C=N)吸收峰，較通常 ν(C=N)鍵(1 690～1 590 cm-1)向短波方向移動，說明N原子參與配位，因此方式Ⅰ為配合物中吡唑結(jié)構(gòu)。3個吡唑配體在與鋅形成配合物時，需要失去1個質(zhì)子達(dá)到電荷平衡，羥基氫較氨基氫活潑，因此其中一個羥基失去質(zhì)子形成負(fù)離子。由于3個吡唑環(huán)的電子分布情況非常接近，在確定羥基氧負(fù)離子時，通過比較連有羥基的C-O鍵長,C(3)-O(1)為0.134 8(10)nm;C(12)-O(2)為 0.131 6(10)nm；C(21)-O(3)為 0.130 6(10)nm；C(21)-O(3)鍵長較短，因此把 O(3)確定為去質(zhì)子，進(jìn)而得出圖1中晶體結(jié)構(gòu)。

在該晶體中，配合物通過3個分子內(nèi)氫鍵N(2)-H(2)與 O(3)、N(4)-H(4)與 O(1)、N(6)-H(5)與 O(2)使 3個吡唑配體形成環(huán)狀構(gòu)型。分子間是通過O(1)-H(1)與另一分子的 Cl(1)i(Symmetry codes：i1+x，y，z)形成分子間氫鍵，進(jìn)而構(gòu)成一維鏈狀，鏈與鏈之間通過分子上的O(2)-H(3)和另一鏈上的O(3)ii(Symmetry codes：ii1-x，1/2+y，1-z)形成分子間氫鍵，使配合物形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3)。

表3 配合物1的分子內(nèi)和分子間氫鍵參數(shù)Table3 Intramolecular and intermolecular hydrogen bond parameters of complex 1

圖1 配合物1的晶體結(jié)構(gòu)(橢球率30%)Fig.1 Molecular structure of the complex 1 with 30%probability ellipsoids

圖2 吡唑與鋅的3種鍵合形式Fig.2 Three binding types of pyrazole and Zn

2.3 配合物1對HepG2、Hep3B和Huh7細(xì)胞形態(tài)的影響

圖4顯示為在配合物1作用48 h后，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B和Huh7的細(xì)胞形態(tài)。通過倒置顯微鏡觀察可見，空白對照組細(xì)胞大小均一，胞質(zhì)顏色透明。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞變圓浮起反差增大，細(xì)胞間接觸變松，增殖減慢，胞質(zhì)中顆粒增多。同時，死細(xì)胞的數(shù)量增多，有的細(xì)胞內(nèi)可見有明顯空泡，細(xì)胞完整性受到破壞，形成大量細(xì)胞碎片。

圖4 配合物1作用48 h后，倒置顯微鏡下肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、Huh7的細(xì)胞形態(tài)(×200)Fig.4 Effect of complex 1 on tumor cell morphology of HepG2,Hep3B,Huh7 cell lines after 48 h investigated by inverted phase-contrast microscopy(×200)

2.4 配合物1對HepG2、Hep3B和Huh7的細(xì)胞毒性

實(shí)驗(yàn)采用 MTT法檢測金屬配合物 1、ZnCl2、Hppo和5-FU對HepG2、Hep3B和Huh7的細(xì)胞毒性。在加藥24、48、72 h后，不同藥物對肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B和Huh7造成了不同程度的抑制作用。配合物1具有較強(qiáng)的抑制效果，圖5顯示了配合物1對HepG2、Hep3B和 Huh7細(xì)胞， 在 24、48、72 h的抑制情況。表4總結(jié)了藥品的IC50，其中對Hep3B抑制效果最好，48 h時的IC50值為9.88 μg·mL-1， 對 HepG2 細(xì)胞的 IC50值為 20.73 μg·mL-1，對Huh7 細(xì)胞的抑制作用最弱，IC50值為 52.16 μg·mL-1。金屬配合物1對肝癌細(xì)胞的抑制均呈劑量依賴，即隨藥物濃度的增加細(xì)胞的抑制效果增強(qiáng)。在給藥時間為24～48 h時，抑制率隨著作用時間的增強(qiáng)而增強(qiáng)，呈正相關(guān)。

圖5 配合物1對腫瘤細(xì)胞HepG2、Hep3B和Huh7的抑制率曲線(n=3)Fig.5 Inhibition rate of complex 1 against tumor cell lines HepG2,Hep3B and Huh7(n=3)with the increasing of concentration

通過對比配合物 1與 ZnCl2、Hppo和5-FU對HepG2、Hep3B和Huh7的抑制作用發(fā)現(xiàn)(圖6)，在樣品濃度62.50 μg·mL-1下，吡唑配體和金屬鹽對細(xì)胞抑制效果較弱，金屬配合物1對Hep3B和HepG2抑制效果與5-氟尿嘧啶的抑制效果相當(dāng)，對Hep3B細(xì)胞的作用效果甚至強(qiáng)于陽性對照藥，對Huh7的抑制效果較弱，與上面實(shí)驗(yàn)相符。在已報(bào)道的吡唑類金屬配合物的抗腫瘤作用機(jī)制研究中，吡唑配體多數(shù)以非共價鍵結(jié)合方式與DNA相互作用[14]。配合物1中含有苯環(huán)和吡唑環(huán)，可以通過插入方式嵌入DNA，這有可能是配合物的抗腫瘤活性原因之一。

表4 配合物1對Hep3B、HepG2和Huh7細(xì)胞的IC50值(n=3)Table4 IC50of complex 1 on tumor cell Hep3B,HepG2 and Huh7(n=3)μg·mL-1

圖6 化合物對細(xì)胞Hep3B、HepG2和Huh7的抑制率(n=3)Fig.6 Inhibition rate of the compounds against HepG2,Hep3B and Huh7(n=3)

3 結(jié) 論

合成了新型金屬配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl]并表征了其晶體結(jié)構(gòu)。Znギ為四面體配位，配體5-苯基-3-羥基吡唑(Hppo)通過吡唑環(huán)上的N原子與Zn配位，分子上的OH和NH通過形成分子內(nèi)和分子間氫鍵穩(wěn)定配合物結(jié)構(gòu)。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示配合物1對肝癌細(xì)胞HepG2，Hep3B和Huh7具有增值抑制作用，其中對Hep3B的抑制效果最好，強(qiáng)于陽性對照5-氟尿嘧啶。ZnCl2與Hppo對3種肝癌細(xì)胞的抑制效果較弱，在形成配合物后生物活性增強(qiáng)。

[1]Mariappan G,Saha B P,Sutharson L,et al.Saudi Pharm.J.,2011,19(2):115-122

[2]Bekhit A A,Abdel-Aziem T.Bioorg.Med.Chem.,2004,12(8):1935-1945

[3]Hashimoto H,Imamura K,Haruta J,et al.J.Med.Chem.,2002,45(7):1511-1517

[4]Peng X M,Cai G X,Zhou C H.Curr.Top.Med.Chem.,2013,13(16):1963-2010

[5]Keter F K,Darkwa J.BioMetals,2012,25(1):9-21

[6]Marcheetti F,Pettinari C,Pettinari R.Coord.Chem.Rev.,2005,249(24):2909-2945

[7]Casas J S,García-Tasende M S,Sánchez A,et al.Coord.Chem.Rev.,2007,251(11/12):1561-1589

[8]Mariappan G,Sha B P,Sutharson L,et al.J.Pharm.Res.,2010,3(12):2856-2859

[9]HUANG Juan(黃娟),CUI Zi-Ning(崔紫寧),LI Ying(李映),et al.Chin.Org.Chem.(有機(jī)化學(xué)),2008,28(4):598-604

[10]Caruso F,Rossi M,Tanski J,et al.J.Med.Chem.,2000,43(20):3665-3670

[11]Budzisz E,Malecka M,Keppler B K,et al.Eur.J.Inorg.Chem.,2007(23):3728-3735

[12]HE Qi-Zhuang(何其莊),MA Shu-Zhi(馬樹芝),XU Dong-Fang(許東芳).Chinese J.Inorg.Chem.(無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2007,23(10):1723-1728

[13]Marzano C,Pellei M,Tisato F,et al.Anticancer Agents Med.Chem.,2009,9(2):185-211

[14]ZHANG Si-Qi(張思琪),WANG Lu(王路),WANG Zhen-Yu(王振宇).Chem.Res.Appl.(化學(xué)研究與應(yīng)用),2014,26(6):777-784

[15]LIU Ya-Nan(劉亞楠),YANG Fang(楊芳),MEI Wen-Jie(梅文杰),et al.Chem.J.Chinese Universities(高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)),2010,31(3):435-441

[16]Jiang J,Tang X L,Dou W,et al.J.Inorg.Biochem.,2010,104(5):583-591

[17]Li M X,Chen C L,Zhang D,et al.Eur.J.Med.Chem.,2010,45(7):3169-3177

[18]Zhang H,Liu C S,Bu X H,et al.J.Inorg.Biochem.,2005,99(5):1119-1125

[19]QIU Xiao-Yang(仇曉陽),LIU Qi-Feng(劉起峰),ZHANG Ping(張平),et al.Chinese J.Inorg.Chem.(無機(jī)化學(xué)學(xué)報(bào)),2012,28(2):362-366

[20]Kovala-Demertzi D,Yadav P N,Wiecek J,et al.J.Inorg.Biochem.,2006,100(9):1558-1567

[21]Stanojkovic T P,Kovala-Demertzi D,Primikyri A,et al.J.Inorg.Biochem.,2010,104(4):467-476

[22]Lopes E O,Oliveira C G,Silva P B,et al.Int.J.Mol.Sci.,2016,17(5):781-795

[23]Aromí A,Bell A R,Helliwell M,et al.Chem.Eur.J.,2003,9:3024-3032

[24]Zimmermann D,Krogsgaard-Larsen P,Ehrhardt J D,et al.Tetrahedron,1998,54(32):9393-9400

[25]Sheldrick G M.SHELXL-97,Program for the Solution and the Refinement of Crystal Structure,University of G?ttingen,Germany,1997.

Synthesis,Crystal Structure and Antitumor Activity of Pyrazole Zinc Complex

LI Jing＊WU Chun-Yang ZHANG Ying SHEN Gui-Nan JIN Cheng-Hao
(College of Life Science and Biotechnology,Heilongjiang Bayi Agriculture University,Daqing,Heilongjiang 163319,China)

A zinc complex[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)(Hppo=3-benzyl-3-pyrazolin-5-one)was synthesized by solvent evaporation and characterized by elemental analysis,FTIR and X-ray diffraction.The complex crystallizes in monoclinic system,space group P21.Cell morphology and in vitro toxicity effects against cancer cell lines HepG2,Hep3B and Huh7 of the complex were investigated.The bioassay results show that this zinc complex has distinct antitumor effects.CCDC:1561437.

pyrazole;antitumor activity;metal complex;crystal structure

O614.24+1

A

1001-4861(2018)01-0135-07

10.11862/CJIC.2018.016

2017-03-30。收修改稿日期：2017-11-10。

國家自然科學(xué)基金(No.31400660)、黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)青年創(chuàng)新人才基金(No.CXRC2016-13)和黑龍江省自然科學(xué)基金(No.QC2016012)資助項(xiàng)目。

＊通信聯(lián)系人。 E-mail：lijingroea@sina.com