毛 敏,蔣春先*,柳明剛,李 慶,楊群芳,王海建

(1.四川農業(yè)大學農學院，成都 611130；2.自貢市植物檢疫站，四川自貢643000)

黑水虻幼蟲血細胞類型的研究

毛 敏1,蔣春先1*,柳明剛2,李 慶1,楊群芳1,王海建1

(1.四川農業(yè)大學農學院，成都 611130；2.自貢市植物檢疫站，四川自貢643000)

黑水虻Hermetiaillucens(L.)是一種重要的資源昆蟲。本文旨在篩選出適合黑水虻血細胞觀察的染色方法，明確黑水虻血細胞類型、數(shù)量及組成，為黑水虻血細胞免疫研究奠定基礎。采用Giemsa和Giemsa-Wright’s染色方法和血球計數(shù)板法，對黑水虻血細胞染色方法和血細胞數(shù)量及形態(tài)進行研究。結果表明，甲醇固定4 min，Giemsa-Wright’s染液染色9 min、pH 7.2磷酸鹽緩沖液分色10 min是黑水虻幼蟲血細胞最佳染色方法；黑水虻幼蟲血細胞包括原血細胞、漿血細胞、粒血細胞、類絳血細胞、珠血細胞5類；4齡黑水虻幼蟲血細胞數(shù)量大約為2917個/μL，其中漿血細胞占53.20%±2.78%，粒血細胞占37.49%±3.96%，原血細胞占7.97%±1.51%，類絳血細胞占1.02%±0.24%，珠血細胞占0.62%±0.08%。Giemsa-Wright’s染色法為黑水虻幼蟲血細胞最佳染色方法，黑水虻幼蟲血細胞可分為5類10種。

黑水虻；血細胞；Giemsa-Wright’s染色法

黑水虻Hermetiaillucens(L.)是雙翅目Diptera水虻科Stratiomyidae的一種重要資源昆蟲，其幼蟲能處理餐廚垃圾、死體畜禽、糞便等有機垃圾(Banksetal.，2014)。黑水虻營養(yǎng)價值高，尤其是脂肪含量，能作為飼料添加劑替代魚粉等，用作生物柴油新型原料也具有其獨特的優(yōu)勢(Lietal.，2011；陳曉偉等，2012；Henryetal.，2015)。作為水虻科的一類昆蟲，黑水虻幼蟲在自然界中常以腐爛有機物和動物糞便為食(安新城等，2007；柴志強等，2013)，像家蠅一般擁有強大的免疫能力，但黑水虻成蟲不攜帶致病微生物，不傳播疾病(徐齊云等，2014)，對家蠅種群有抑制作用(Bradleyetal.，1984)。宋明英(2013)等曾對黑水虻幼蟲抗菌肽的誘導條件優(yōu)化及粗提物活性做了初步研究，發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲能產(chǎn)生對大腸桿菌Escherichiacoil有強活性的抗菌肽；Park等(2014)和SI等(2015)發(fā)現(xiàn)低分子量的黑水虻幼蟲提取物具有廣譜抗菌活性，包括革蘭氏陽性的金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌methicillin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA)，革蘭氏陰性銅綠假單胞菌Pseudomonasaeruginosa。

昆蟲血細胞作為其細胞免疫的主要執(zhí)行者，能在天然免疫應答中發(fā)揮非常重要的作用，比如抵抗外源物時能實現(xiàn)吞噬、包囊、包被、凝集成瘤、形成結節(jié)等功能(張錫林等，2009)。果蠅Drosophilamelanogaster在遭受細菌、真菌和病毒等病原體攻擊時，能通過細胞吞噬、集結、包囊作用以及產(chǎn)生抗菌肽等方式來清除入侵的微生物(李國輝等，2015)；3齡家蠅Muscadomestica幼蟲離體血細胞在感染大腸桿菌之后，其漿血細胞、粒血細胞聚集成團能夠將細菌包裹形成包囊，黑化(Yan，2010)。汪曉純等(2014)在研究Notch信號途徑中Su(H)和E(spl)基因對果蠅天然免疫的影響過程中發(fā)現(xiàn)，不同果蠅突變體中血細胞的噬菌功能和血細胞數(shù)量的變化不同。胡建等(2003)在觀察亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis幼蟲血細胞包囊行為時發(fā)現(xiàn)，亞洲玉米螟幼蟲血細胞在體內外皆能黏附在外源物表面形成包囊，部分包囊會發(fā)生黑化現(xiàn)象。昆蟲血細胞狀態(tài)會隨著昆蟲生理環(huán)境的變化而發(fā)生不同程度的變化。楊志蘭等(2013)發(fā)現(xiàn)，草地螟Loxostegesticticalis血細胞總數(shù)及各血細胞數(shù)量包括漿血細胞、粒血細胞會隨幼蟲密度的增加而顯著遞增。Sun等(2010)發(fā)現(xiàn)，斜紋夜蛾Spodopteralitura(Fabricius)幼蟲在取食不同鎳含量的飼料之后血細胞凋亡率隨著世代的增加發(fā)生不同變化；李艷敏等(2010)用含Cd2+飼料飼喂棕尾別麻蠅Boettcheriscaperegrine初產(chǎn)幼蟲發(fā)現(xiàn)，重金屬Cd2+對其血細胞具有毒害作用，包括細胞膜受損或破裂，染色質呈現(xiàn)凝聚,線粒體和內質網(wǎng)等細胞器明顯減少，以及胞質內出現(xiàn)空囊泡。方旭(2015)研究表明，Zn2+脅迫能誘導黑水虻幼蟲血細胞的凋亡，凋亡率隨著世代的增加而增加，但該研究未涉及黑水虻血細胞類型的研究。關于黑水虻血細胞類型的研究國內外尚未見報道，本文運用Giemsa和Giemsa-Wright’s染色方法和血球計數(shù)板法，對黑水虻血細胞染色方法和血細胞數(shù)量及形態(tài)進行研究，以期為黑水虻細胞免疫研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黑水虻由四川農業(yè)大學農業(yè)昆蟲與害蟲防治實驗室長期室內飼養(yǎng)。選取健康活躍、大小及生理狀態(tài)一致的4齡黑水虻幼蟲供試。

1.2 黑水虻血淋巴提取

將4齡黑水虻幼蟲放置冰上麻痹，用75%酒精清洗體表，再用無菌水洗去酒精后擦干，剪去頭部，每頭幼蟲用移液槍吸取血淋巴約15 μL，將4頭幼蟲血淋巴于1.5 mL離心管中混勻，置于冰上備用。

1.3 血細胞染色方法的篩選

Giemsa染色法：取血淋巴10 μL滴于干凈載玻片上涂成血膜。待血膜干燥之后，用甲醇固定、Giemsa染液染色和pH 6.8磷酸緩沖液分色，用自來水沖洗，晾干封片，在Nikon80i光學顯微鏡下進行血細胞形態(tài)觀察。

Giemsa-Wright’s染色法：按上述方法取血淋巴制成血涂片。待血膜干燥之后，用甲醇固定、Giemsa-Wright’s染液染色和pH 7.2磷酸緩沖液分色，用自來水沖洗，晾干封片。分別設置固定、染色和分色時間的不同處理，在Nikon80i光學顯微鏡下進行血細胞形態(tài)觀察。

根據(jù)玻片血膜狀態(tài)、核質著色情況、不同類型血細胞形態(tài)特征辨認出的細胞類型等，篩選出最適黑水虻血細胞的染色方法。

1.4 黑水虻血細胞數(shù)量及血細胞形態(tài)觀察

1.4.1血細胞數(shù)量

取4齡黑水虻幼蟲血淋巴，用血球計數(shù)板在普通光學顯微鏡下計數(shù)，統(tǒng)計5張以上血球計數(shù)板上細胞數(shù)量，取其平均值進行計算。

1.4.2血細胞類型觀察

用篩選出的Giemsa-Wright’s染色法對血細胞形態(tài)觀察。取黑水虻血淋巴制成血膜，待血膜充分干燥之后，用3-4滴甲醇固定4 min，Giemsa-Wright’s染液3-4滴染色9 min，再緩慢地滴加pH 7.2磷酸鹽緩沖液分色10 min。自來水沖洗后，晾干封片，在光學顯微鏡下觀察血細胞形態(tài)并拍照。每張玻片大約鑒定300個血細胞類型并計數(shù)，統(tǒng)計5張以上玻片血細胞類型。所有數(shù)據(jù)應用Excel軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 黑水虻血細胞染色方法篩選

Giemsa染色法需要時間較長、血細胞著色效果差，對黑水虻血細胞染色效果不佳。試驗過程中染色時間分別為10 min、15 min、20 min、30 min的血細胞著色很淡，細胞質和細胞核之間的區(qū)分不明顯，無法辨別血細胞類型；分別染色35 min、45 min、60 min的血細胞，雖然著色明顯，但核質顏色區(qū)別不顯著，無法辨別血細胞類型。

Giemsa-Wright’s染色法效果較Giemsa染色法好，染色時間短，細胞著色明顯，細胞類型辨別清晰。不同的固定、染色和分色時間，血涂片呈現(xiàn)出不同染色效果，其中在甲醇固定4 min，Giemsa-Wright’s染液染色9 min，pH 7.2磷酸鹽緩沖液分色10 min的條件下血膜完整、視野清晰，核質著色明顯，能清晰辨認各種細胞類型，為黑水虻血細胞最佳染色方法(表1)。后續(xù)試驗皆采用此方法。

2.2 黑水虻幼蟲血細胞類型

通過Giemsa-Wright’s染色法觀察發(fā)現(xiàn)，黑水虻幼蟲血細胞(hemocyte)包括原血細胞(prohaemocytes)、漿血細胞(plasmatocytes)、粒血細胞(granulocytes)、珠血細胞(spherulocyte)和類絳血細胞(oenocytoid)5類。

2.2.1原血細胞

原血細胞是小型單核細胞，核大，有少量細胞質或者幾乎沒有細胞質，一般呈圓形，少數(shù)卵圓形，輪廓清晰，直徑為7-9 μm。Giemsa-Wright’s染色中細胞核呈紅紫色，細胞質呈淡藍紫色或不見(圖1.1、1.2a)。

2.2.2漿血細胞

漿血細胞是一類形態(tài)多樣的中型細胞，有月牙形、不規(guī)則形、梭形，以卵圓形和圓形為主。卵圓形細胞平均大小約為15.7 μm×11 μm；圓形細胞直徑大小約為12.9 μm。Giemsa-Wright’s染色下分為藍紫核漿血細胞和紅核漿血細胞，藍紫核漿血細胞形狀多為圓形、卵圓形，多為單核細胞，偶見雙核，細胞核直徑為7.6 μm。細胞質呈藍色，含有少量大小均勻的微小顆粒。單核細胞核偏小，位于細胞中央；雙核細胞核分布在細胞兩端(圖1.2b-1.6a)。紅核漿血細胞輪廓模糊，單核，核大呈紅紫色，核常偏離中央，細胞核直徑約為8 μm，細胞質顏色為淺藍色(圖1.6b、1.7)。

2.2.3粒血細胞

粒血細胞多為圓形、卵圓形的中型單核細胞，細胞直徑大小約為19.3 μm，核位于細胞中央，細胞核直徑約為9 μm。在Giemsa-Wright’s染色下細胞核呈紅紫色，細胞質藍色，細胞質內含物呈現(xiàn)深藍色。根據(jù)細胞中內含物顆粒大小，可分為小粒粒血細胞和大粒粒血細胞，小粒粒血細胞細胞質顆粒直徑小于1 μm，小粒粒血細胞又分為稀少小粒粒血細胞(圖1.8)和密集小粒粒血細胞(圖1.9)；大粒粒血細胞細胞質內含物顆粒較大，顆粒直徑約1-3 μm(圖1.10)。

2.2.4類絳血細胞

類絳血細胞是一類較大型的血細胞，單核，核較小，平均細胞大小約為14.7 μm×21.5 μm，細胞核直徑約為7 μm。在Giemsa-Wright’s染色，可分為紅核和藍核兩種類型。紅核類絳血細胞呈卵圓形，輪廓清晰，細胞核較大且常偏離細胞中央，呈現(xiàn)紅紫色，細胞質藍色、稠密，含多個有明顯透亮的棒桿狀內含物(圖1.11、1.12)；另一類藍核類絳血細胞細胞形態(tài)不規(guī)則，輪廓模糊，細胞核較小，位于細胞中央，呈深藍色，細胞質稀疏，呈淡藍色，細胞內不見明顯內含物(圖1.13)。

2.2.5珠血細胞

珠血細胞為中型單核圓形細胞，細胞直徑大小約為15.3 μm，細胞核較大，細胞核直徑約為8.3 μm，細胞質中含有大量的珠形內含物，珠粒透亮，大小基本均一且珠粒之間界限分明。珠血細胞可為紅核珠血細胞(圖1.14)和藍紫核珠血細胞(圖1.15)。

表1 不同條件下Giemsa-Wright’s染色法對黑水虻幼蟲血細胞的染色效果

圖1 Giemsa-Wright’s法黑水虻幼蟲血細胞光學顯微鏡觀察圖Fig.1 The optical microscpe’s image of the hemocyte of Hermetia illucens (L.) by Giemsa-Wright’s method注：1.1、1.2a,原血細胞×600；1.2b-1.6a,藍紫核漿血細胞×600；1.6b-1.7,紅核漿血細胞×600；1.8,稀少小顆粒粒血細胞×600；1.9,密集小顆粒粒血細胞×600；1.10,大顆粒粒血細胞×600；1.11、1.12,紅核類絳血細胞×600；1.13,藍核類絳血細胞×600；1.14,紅核珠血細胞×600；1.15,紫核珠血細胞×600；1.1,標尺=5 μm;1.2-1.14,標尺=10 μm。Note:1.1、1.2a, prohaemocytes×600; 1.2b-1.6a, blue-nucleus plasmatocyts×600; 1.6b-1.7, red-nucleus plasmatocyts×600; 1.8, the exiguous small granular granulocytes of the granulocyte×600; 1.9, the dense small granular granulocytes of the granulocyte×600; 1.10, the large granular granulocytes of the granulocyte×600; 1.11、1.12, red-nucleus oenocytoid×600; 1.13, blue-nucleus oenocytoid×600; 1.14, red-nucleus spherulocyte×600; 1.15, blue-nucleus spherulocyte×600; 1.1, Scale bar=5 μm; 1.2-1.14, Scale bar =10 μm.

2.3 黑水虻幼蟲血細胞數(shù)量及各類血細胞比例

用血球計數(shù)板計數(shù)表明，4齡黑水虻幼蟲血細胞數(shù)量大約為2917個/μL；其中，通過染色觀察發(fā)現(xiàn)數(shù)量最多的是漿血細胞，其次是粒血細胞、原血細胞和類絳血細胞，珠血細胞最少。各血細胞數(shù)量所占比例為：漿血細胞53.20%±2.78%，粒血細胞37.49%±3.96%，原血細胞7.97%±1.51%，類絳血細胞1.02%±0.24%，珠血細胞0.62%±0.08%。

3 結論與討論

選擇一種合適的染色方法處理血細胞來觀察其形態(tài)，是研究昆蟲血細胞過程中非常關鍵的一部分。Giemsa染色、Wright’s染色以及Giemsa-Wright’s染色等方法為昆蟲血細胞研究中常用方法。不同染色法對不同昆蟲血細胞染色效果不同，王世貴等(2007)用Giemsa染色觀察紅褐斑腿蝗Catantopspinguis血細胞并對其進行了分類；遲淑萍等(2004)運用Giemsa法觀察了德國小蠊Blattellagermanica血細胞；賈雷坡等(2011)通過Wright’s染色對不同地區(qū)東亞飛蝗的血細胞進行了觀察和分類；王強等(2011)分別用這3種方法染色中華稻蝗Qxyachinensis血細胞進行比較發(fā)現(xiàn)，Giemsa-Wright’s染色具備了另外2種染液的優(yōu)點；殷培峰等(2014)運用Giemsa-Wright’s染色對金銀花尺蠖HeterolochajinyinhuaphagaChu.幼蟲血細胞的形態(tài)進行觀察。本文篩選出了適合黑水虻幼蟲血細胞觀察的Giemsa-Wright’s染色法，染色時間短、核質區(qū)分明顯、能夠清晰辨別各種類型的血細胞，可用于黑水虻血細胞相關研究。

雙翅目昆蟲血細胞數(shù)量種間差異較大。家蠅3齡幼蟲血細胞數(shù)量約為7090個/μL(劉暉，2008)；致倦庫蚊Culexpipiensquinquefasciatus幼蟲在發(fā)育的過程中，血細胞數(shù)量大約在1378-1814個/μL變化(莫非，2001)；桔小實蠅Bactroceradorsalis幼蟲血細胞數(shù)量根據(jù)蟲齡的變化更顯差異，大約在45522.7-19086366.6個/μL(徐浪，2015)。本文中4齡黑水虻幼蟲血細胞數(shù)量約為2917個/μL，與其他種類昆蟲血細胞數(shù)量相比差異明顯，但其血細胞數(shù)量在不同發(fā)育階段變化還需進一步研究。

在雙翅目昆蟲血淋巴中，通常具有吞噬等作用的漿血細胞(傅貽玲，1982)所占比例很大，果蠅幼蟲的漿血細胞占比達到90%-95%(Rizki，1957)，家蠅幼蟲中漿血細胞占比在50%左右(劉暉，2008)。本研究發(fā)現(xiàn)黑水虻4齡幼蟲中漿血細胞比例達到50%以上。但同一目昆蟲中同類型血細胞比例是不盡相同的，比如家蠅粒血細胞占比為11.4%(劉暉，2008)，致倦庫蚊粒血細胞比例高達40.3%(Brayner，2005)，埃及斑蚊的粒血細胞含量為16%(Araújo，2008)。據(jù)本試驗統(tǒng)計結果，在黑水虻幼蟲血細胞中粒血細胞所占比例為37%。

由于昆蟲種類豐富，血細胞形態(tài)多樣，且昆蟲血細胞的形狀常因觀察時間和處理方法的不同而有較大差異，命名也頗不統(tǒng)一。盡管人類對昆蟲血細胞的研究至今大約有340多年的歷史，且涉及到的昆蟲種類在100種以上(賈雷坡，2011)，但是血細胞的分類仍然是一個爭議比較多的方面。目前普遍接受的是將其分為原血細胞、漿血細胞、粒血細胞、類絳血細胞和珠血細胞 5種常見的血細胞類型(傅貽玲，1982)，但這些血細胞類型并不是同時存在所有昆蟲中。在雙翅目昆蟲中，因為種屬之間的差異，血細胞類型存在不同。目前人們普遍認同蚊類細胞主要包括為粒血細胞和漿血細胞、原細胞、球形細胞和類絳細胞；其中，楊松等(2004)通過Giemsa染色初步鑒定了大劣按蚊Anophelesdirus血細胞主要為顆粒細胞與漿細胞。莫非等(2001)將致倦庫蚊C.quinquefasciatus幼蟲的血細胞分為5種，即原血細胞、漿血細胞、粒血細胞、珠血細胞和類絳血細胞；但Brayner等(2005)對Culexquinquefasciatus血細胞超微結構進行觀察，發(fā)現(xiàn)了原血細胞、漿血細胞、珠血細胞、粒血細胞、類絳血細胞和脂血細胞(adipohemocytes)6種血細胞類型并對血細胞比例進行了統(tǒng)計；Araújo等(2008)發(fā)現(xiàn)埃及斑蚊Aedesaegypti除了擁有原血細胞、粒血細胞、漿血細胞和類絳血細胞4種常見血細胞類型以外還存在脂血細胞和擬血小板細胞(thrombocytoids)。對于果蠅Drosophilamelanogaster血細胞類型存在不同看法，談娟(2011)認為果蠅血細胞主要有漿細胞、結晶細胞(crystal cell)和葉狀血細胞(lamellocytes)3種，而Rizki(1957)則將其分為漿細胞、結晶細胞兩大類以及其他變異類型足細胞(podocytes)。劉暉等(2008,2012)發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲血細胞分為原血細胞、漿血細胞、粒血細胞、珠血細胞、類絳血細胞5類，其中漿血細胞又分為大核漿血細胞和小核漿血細胞兩種。

本文通過在Giemsa-Wright’s染色在黑水虻的血涂片中觀察到了5類10種血細胞。其中，原血細胞和粒血細胞細胞核被染成紅色，而漿血細胞、珠血細胞和類絳血細胞細胞核則都被染成紅色和紫藍色或藍色兩種類型。早在1966年就有科學家對昆蟲血細胞之間相互演化關系進行研究，其觀點認為漿血細胞是昆蟲血細胞的基本形態(tài)，由原血細胞分裂演化而來；粒血細胞、類絳血細胞、足血細胞和蠕血細胞皆由漿血細胞發(fā)育形成；珠血細胞、囊血細胞是漿血細胞、粒血細胞形成；脂血細胞則是由粒血細胞而來(Gupta，1966)。賈雷坡等(2011)用Wright’s染色法觀察東亞飛蝗血細胞，并提出其血細胞之間有如下演化關系：原血細胞是東亞飛蝗血細胞的干細胞，分裂和分化成漿血細胞，漿血細胞進一步演化為紅核漿血細胞和藍核漿血細胞2種類型，紅核和藍核漿血細胞各自分化和演化為粒血細胞和類絳血細胞。結合以上依據(jù)及本文中對黑水虻血細胞的觀察認為，黑水虻血細胞可能存在以下演化關系：漿血細胞是由原血細胞分裂分化而來；漿血細胞分化為藍紫核漿血細胞和紅核漿血細胞，藍紫核漿血細胞進一步演化為藍紫核珠血胞和藍紫核類絳血胞；紅核漿血細胞進一步演化為紅核粒血細胞、紅核珠血細胞和紅核類絳血細胞。其中，可能由于染色方法的不同本文中除了類降血細胞以外，兩類紅核、藍紫核細胞并沒有呈現(xiàn)純正的對比顏色，但并不影響觀察。更值得一提的是，在本文觀察過程中并沒有發(fā)現(xiàn)藍核或者藍紫核粒血細胞，其原因還需進一步研究。

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StudyonhemocytesclassificationofHermetiaillucens(L.)larve

MAO Min1, JIANG Chun-Xian1*, LIU Ming-Gang2, LI Qing1, YANG Qun-Fang1, WANG Hai-Jian1

(1.Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China；2.Zigong Plant Quarantine Station,Zigong 643000,Sichuan Province,China)

Hermetiaillucens(L.) is a kind of important resource insect. In order to lay the foundation for the research of Haemocyte immune functions ofH.illucens, the type, number and composition of the hemocytes of the 4thstage larva of theH.illucenswere studied by selecting suitable staining method which is beneficial to observe the hemocytes of 4thstage larva of theH.illucens. Hemocytes’s quantity and morphology of the 4thstage larva of theH.illucenswas researched by using Giemsa and Giemsa-Wright’s staining method and blood count plate. Fixing 4 min with Methanol, staining 9 min with Giemsa-Wright’s, separating color 10 min with pH 7.2 phosphate buffer is the best method. The hemocytes of the 4thstage larva ofH.illucenscould be divided into five types: prohemocyte, plasmatocyte, granulocyte, sphrulocyte and oenocytoid. The number of total hemocytes of the 4thstage larva ofH.illucenswas 2917/μL, and the percentage of prohemocyte, plasmatocyte, granulocyte, sphrulocyte and oenocytoid were about 7.97%±1.51%, 53.20%±2.78%, 37.49%±3.96%, 0.62%±0.08%, 1.02%±0.24%, respectively. Giemsa-Wright ’s method is the suitable method for hemocytes identification. The hemocytes of the 4thstage larva ofH.illucenscan be divided into five main types with ten subtypes.

Hermetiaillucensf; hemocyte; Giemsa-Wright’s method

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Q965

A

1674-0858(2017)06-1342-08

四川農業(yè)大學雙支計劃

毛敏，女，1993年生，在讀碩士研究生，研究方向為農業(yè)昆蟲與害蟲防治，E-mail：15573831671@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: chunxianjiang@126.com

Received: 2016-07-06; 接受日期Accepted: 2016-08-27