孟 翔，胡俊杰，李艷華，歐陽革成

(1.廣東省生物資源應用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260；2.廣州大學生命科學學院，廣州 510006)

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的荔枝蒂蛀蟲SSR位點信息分析

孟 翔1*，胡俊杰2，李艷華2，歐陽革成1

(1.廣東省生物資源應用研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260；2.廣州大學生命科學學院，廣州 510006)

荔枝蒂蛀蟲ConopomorphasinensisBradley是專一性危害我國荔枝和龍眼的重要害蟲。簡單重復序列標記(Simple sequence repeat，SSR)為短串聯(lián)重復序列或微衛(wèi)星標記，其在荔枝蒂蛀蟲偏嗜選擇寄主的遺傳進化機制研究和荔枝蒂蛀蟲綜合治理中具有重要意義。本研究基于高通量測序獲得的荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用MISA軟件從68996條轉(zhuǎn)錄組unigenes結果中發(fā)掘出10521個SSR位點，出現(xiàn)頻率為15.25%。荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中SSR的主要重復類型為單堿基重復，占SSR總數(shù)的66.22%。其次是三堿基重復，占SSR總數(shù)的24.94%。在發(fā)現(xiàn)的33種重復基元中共篩選獲得8種優(yōu)勢重復基元，其中A/T在單堿基重復基元中所占的比例達98.55%?；诤Y選的SSR設計的9對引物中，有4對引物得到擴增預期大小的條帶。荔枝蒂蛀蟲SSR位點的信息分析將為探究荔枝蒂蛀蟲種群遺傳結構、遺傳多樣性和進化關系、害蟲綜合治理等研究提供重要科學依據(jù)。

荔枝蒂蛀蟲；轉(zhuǎn)錄組；簡單重復序列；重復類型；重復基元

簡單重復序列標記(simple sequence repeat，SSR)，又稱為短串聯(lián)重復序列或微衛(wèi)星標記。是一類由幾個核苷酸(1-5個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的重復序列，長度較短，且廣泛均勻分布于真核生物基因組中。由于重復單位的核苷酸不同以及重復次數(shù)不完全相同，使SSR長度具有高度的變異性，多態(tài)性十分豐富。已廣泛應用于遺傳圖譜和物理圖譜的構建、分子標記、輔助育種、品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性、動植物分類和進化等方面的研究(Powelletal.，1996；Varshneyetal.，2005)。目前，隨著高通量測序技術的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序為非模式生物SSR標記的大批量開發(fā)提供了一種經(jīng)濟、高效的途徑，也為非模式昆蟲遺傳多樣性以及環(huán)境保護等研究提供了豐富的資源(楊帆等，2014)。

荔枝蒂蛀蟲ConopomorphasinensisBradley隸屬鱗翅目Lepidoptera細蛾科Gracilariidae，是專一性危害荔枝和龍眼的重要害蟲(Thanhetal.，2006；王少山等，2008)。昆蟲對寄主的選擇和適應性是在長期進化過程中相互協(xié)同進化的結果(Karban and Baldwin，1997；欽俊德和王琛柱，2001；Will and van Bel，2006；Walling，2008)。荔枝蒂蛀蟲作為一種狹食性昆蟲可能代表寄主適應性的一個進化方向，以較低的能量消耗占據(jù)有限的資源，從而可以節(jié)省大量的能量用于其他方面的進化適應和改善，以提高種群的綜合競爭力。然而，目前荔枝蒂蛀蟲研究主要集中于基礎生物學、生態(tài)學以及防治應用等方面(冼繼東等，2006；彭海輝等，2006，2007；陳炳旭等，2011)。而關于荔枝蒂蛀蟲猖獗危害成因和種群遺傳學研究甚少。荔枝蒂蛀蟲SSR標記位點的開發(fā)有利于構建荔枝蒂蛀蟲種群的遺傳圖譜，從分子水平探究其偏嗜選擇寄主的遺傳進化機制，對制定科學合理的檢測及防控措施具有重要的理論和實踐意義。

本研究基于荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(孟翔等，2016)發(fā)掘其功能SSR，對其組成、分布及特征進行系統(tǒng)分析，并對后續(xù)的SSR引物進行設計和驗證，以期獲得荔枝蒂蛀蟲遺傳多樣性和進化關系。研究可為開發(fā)荔枝蒂蛀蟲功能基因提供有效的SSR分子標記，也為荔枝蒂蛀蟲的分子遺傳進化研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源和RNA提取

荔枝蒂蛀蟲成蟲采集于廣東省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所荔枝龍眼園。篩選活力充沛的個體，采用Trizol Reagent方法提取荔枝蒂蛀蟲總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量；Nanodrop分光光度計(IMPLEN，CA，USA)檢測RNA的純度(OD260/OD280比值)，根據(jù)Qubit RNA Assay Kit說明對Total RNA濃度進行精確定量；最后用Agilent 2100(Agilent Technologies，CA，USA)精確檢測RNA的完整性。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序及序列組裝拼接

荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由廣東省生物資源應用研究所-蟲鼠害生態(tài)控制研究中心前期測序獲得。主要采用新一代高通量測序技術Illumina HiseqTM4000對荔枝蒂蛀蟲進行深度測序。對測序獲得的原始reads進行去除帶接頭、ploy-N和低質(zhì)量的reads，并采用Trinity軟件對clean reads進行拼接、過濾和組裝后獲得到高質(zhì)量的unigenes。經(jīng)測序和序列拼接獲得68996條unigenes(孟翔等，2016)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組SSR分析

利用MISA軟件對荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中的unigene獨立基因序列進行SSR位點搜索，對查找的SSR類型進行特征分析。搜索標準為：單堿基重復、二堿基重復、三堿基重復、四堿基重復、五堿基重復、六堿基重復對應的各個unigene的最少重復次數(shù)分別為：10、6、5、5、5、5。

1.4 SSR引物設計與驗證

基于荔枝蒂蛀蟲SSR，應用Primer 3軟件(Untergrasseretal.，2012)設計9對SSR引物，并由Invitrogen生物技術有限公司合成。以荔枝蒂蛀蟲DNA為模板(具體步驟參見OMEGA Total DNA Kit提取試劑盒說明書)進行PCR擴增。反應體系為25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL；dNTP 2 μL；10×buffer 2.5 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；DNA模板1 μL；ddH2O 17 μL。PCR擴增反應在Eppendorf Mastercycler ep基因擴增儀中進行，SSR的擴增程序為：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min；反應結束后，取5L反應液進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 荔枝蒂蛀蟲SSR位點分布特征

利用MISA軟件對荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組進行遺傳多樣性分析，共在68996條unigenes中搜索獲得10521個SSR位點，出現(xiàn)頻率為15.25%。這些SSR基序包含1-4 bp的串聯(lián)重復序列。在荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組SSR的所有堿基重復基元類型中，單堿基重復基元的SSR含量最多，占總數(shù)的66.22%。其次是三堿基重復基元，占總數(shù)的24.94%。在發(fā)現(xiàn)的33種重復基元中，A/T、AC/GT、CCG/CGG和AAAT/ATTT分別在單堿基、二堿基、三堿基和四堿基中出現(xiàn)頻率最多，它們在各自重復基元類型中的比例分別是98.55%、43.24%、65.70%和39.68%(表1)。

表1 荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組SSR重復基元類型及優(yōu)勢重復基元的組成

圖1 荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組不同堿基類型的SSR重復次數(shù)分布Fig.1 Distribution of SSR repeats among different motif types in Conopomorpha sinensis transcriptome

對不同堿基重復基元的重復次數(shù)進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)(圖1)，荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組SSR重復基元的重復次數(shù)分布在5-24。其中，單堿基重復次數(shù)主要集中在9-12，為5599個，占總SSR的53.22%；二堿基、三堿基和四堿基重復次數(shù)主要集中在5-8，分別為756、2621和62個，占總SSR的7.19%、24.91%和0.59%；五堿基和六堿基的SSR數(shù)量較少，重復次數(shù)主要為7和11。

2.2 荔枝蒂蛀蟲SSR引物驗證與PCR擴增

針對荔枝蒂蛀蟲SSR隨機設計9對引物(見表2)對荔枝蒂蛀蟲DNA進行擴增，結果表明：引物2，3，6，9有明顯的擴增條帶且與預期目的片段大小接近；引物7，8也有明顯擴增條帶且小于預期目的片段大??；引物1，5擴增產(chǎn)物有大量非特異性條帶產(chǎn)生；引物4沒有擴增產(chǎn)物。

表2 荔枝蒂蛀蟲篩選SSR引物特征

圖2 荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組9個功能SSR位點擴增電泳圖Fig.2 Agarose gel showing the amplification of 9 SSR loci in Conopomorpha sinensis transcriptome

3 結論與討論

目前，基于昆蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選功能SSR標記已有許多相關報道，并在非模式生物種群遺傳學研究中被廣泛應用(Schoebeletal.，2013)。本研究采用生物信息學方法，從荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得10521個SSR位點，出現(xiàn)頻率為15.25%。與其它昆蟲相比較，荔枝蒂蛀蟲SSR出現(xiàn)的頻率低于大墊尖翅蝗EpacromiuscoerulipesIvanov 44.17%(金永玲等，2015)，高于扶桑綿粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsleny 6.33%(羅梅等，2014)、煙粉虱BemisiatabaciGennadius 5.07%(Xieetal.，2012)、桔小實蠅BactroceradorsalisHendel 4.23%(魏丹丹等，2014)和粘蟲MythimnaseparataWalke 1.93%(胡艷華等，2015)。出現(xiàn)這種頻率差異的原因可能是與搜索序列標準、數(shù)據(jù)庫大小和物種的特異性有關，同時從某種程度上也表明荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量較為豐富，多態(tài)性潛能較高。

一般認為，短重復基序的大量存在表明該物種的進化水平相對較高(Tóthetal.，2000)，而長重復基序占絕大多數(shù)的物種一般具有較低的突變頻率或具有較短的進化時間(Siaetal.，1997；Harry and Schl?tterer，2000；高亞梅等，2008)。研究發(fā)現(xiàn)荔枝蒂蛀蟲SSR序列以單堿基重復為主，占總數(shù)的66.22%。其次是三堿基和二堿基重復。這與研究報道的在轉(zhuǎn)錄組中，除了單核苷酸重復最多以外的是三核苷酸重復的結果是一致的(Xuetal.，2012)。荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中存在大量短重復基序，表明其在生物進化與分類地位中處于相對較高的進化水平，其遺傳基因可能經(jīng)歷了較長的進化時間或具有較高的突變頻率。

為驗證轉(zhuǎn)錄組SSR的多態(tài)性和可用性，本研究隨機篩選的9對引物中有4對引物可以擴增到預期大小的條帶，但仍有5對引物未達到預期擴增或存在明顯的非特異性。這可能與擴增片段中插入內(nèi)含子有關(羅梅等，2014)；也可能是由于本研究所設計引物的SSR序列在基因組中的覆蓋率較低，造成擴增產(chǎn)物很少以至于無法被檢測到(魏丹丹等，2014)；而對于有些引物的擴增產(chǎn)物具有非特異性條帶的情況，很可能是因為這些SSR位于同源基因序列上的緣故。雖然我們對合成的引物進行了驗證，但仍需要對設計好的引物做進一步的甄選和遺傳多樣性分析，以便于更好的開發(fā)基于功能SSR的分子標記。

本研究利用荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，篩選獲得大量荔枝蒂蛀蟲SSR，并對荔枝蒂蛀蟲SSR序列的基本特征和可用性進行了分析和評估，為進一步開發(fā)荔枝蒂蛀蟲功能基因SSR標記奠定了基礎。同時對于荔枝蒂蛀蟲功能基因的開發(fā)利用、遺傳資源評價、豐富其分子標記和比較基因組學研究都具有重要的價值。

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AnalysisofSSRlociintranscriptomedatabaseofConopomorphasinensisBradley(Lepidoptera:Gracilariidae)

MENG Xiang1*, HU Jun-Jie2, LI Yan-Hua2, OUYANG Ge-Cheng1

(1. Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangzhou 510260, China; 2. College of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

ConopomorphasinensisBradley is a major and specific fruit borer pest of litchi and longan in China. Simple sequence repeat, SSR is short tandem repeats or microsatellite. It is important to the genetic evolution mechanism research ofC.sinensispreference for host-plant and its integrated control. Based on the constructed transcriptome database inC.sinensisand the software MISA, 10521 SSR were explored from 68996 transcriptome unigenes, and the occurrence frequency was 15.25%. The majority of repeat type was nucleotide motif (66.22%) and the second was trinucleotide motif (24.94%). A total of 8 dominant repeat motif were screened in 33 kinds of repeat motif. A/T was the most dominant repeat motif (98.55%) in nucleotide motif. Based on the identified SSR, 9 pairs of SSR primers were randomized designed and 4 pairs produced amplification bands in line with expectations. The analysis of SSR inC.sinensissupplys a very important scientific evidence for its population genetic structure research, genetic diversity, evolutionary relationships and integrated control.

ConopomorphasinensisBradley; transcriptome analysis; simple sequence repeat (SSR); repeat type; motif type

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Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)06-1219-06

國家自然科學基金(31301664)；廣東省科技計劃項目(2014A020208079，2015A020209091)；廣州市科技計劃項目(201504290946316)；廣東省科學院優(yōu)秀青年科技人才基金項目(rcjj2015);廣東省科學院科技發(fā)展專項(2017GDASCX-0107)

孟翔，女，1982年生，山西太谷人，博士，副研究員，研究方向為嶺南特色果蔬害蟲生物防治，E-mail：mengxiangxs@126.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: mengxiangxs@126.com

Received: 2016-11-03; 接受日期Accepted: 2017-04-18