趙 磊，夏 昊，錢(qián) 強(qiáng)，徐 圓，李 凱

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

菜粉蝶osiris基因家族鑒定與發(fā)育動(dòng)態(tài)

趙 磊，夏 昊，錢(qián) 強(qiáng)，徐 圓，李 凱*

(東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620)

osiris基因家族是昆蟲(chóng)特異性基因，迄今尚未在昆蟲(chóng)綱以外的物種中發(fā)現(xiàn)同源基因。本研究利用菜粉蝶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了菜粉蝶16個(gè)osiris基因家族成員，分屬11個(gè)亞家族。通過(guò)與菜粉蝶基因組比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菜粉蝶osiris基因均為斷裂基因，外顯子數(shù)量為3-15個(gè)；通過(guò)結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)菜粉蝶Osiris完整編碼蛋白含有信號(hào)肽和一個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域DUF1676，且多數(shù)Osiris蛋白含跨膜結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，osiris基因家族成員與其他昆蟲(chóng)種類相應(yīng)成員更似直系同源，而非種內(nèi)基因擴(kuò)張，再次驗(yàn)證了osiris基因是在昆蟲(chóng)物種分化之前就已形成的多基因家族。發(fā)育轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析表明，osiris家族不同成員表達(dá)量在不同發(fā)育階段趨勢(shì)幾乎完全一致，多在菜粉蝶1齡幼蟲(chóng)和5齡幼蟲(chóng)高表達(dá)，卵期、蛹期與成蟲(chóng)期低表達(dá),預(yù)示著osiris基因家族不同成員轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的相似性與發(fā)育的相關(guān)性。

osiris基因家族；菜粉蝶；蛋白結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化；發(fā)育

1972年，Sandler等(1972)在對(duì)黑腹果蠅Drosophilamelanogaster染色體片段非整倍體的研究中發(fā)現(xiàn)，三號(hào)染色體存在導(dǎo)致單倍體或三倍體致死的區(qū)段，并將其命名為三倍體致死基因座(Tpl)。2003年，Dorer等(2003)在Tpl區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)含有20個(gè)成員的基因家族，并對(duì)其命名為osiris家族。隨著昆蟲(chóng)基因組測(cè)序的進(jìn)展，陸續(xù)在柑橘鳳蝶Papilioxuthus(Futahashietal., 2012)，玉帶鳳蝶Papiliopolytes(Futahashietal., 2012)，大紅斑蝶Danausplexippus(Zhanetal., 2011)、家蠶Bombyxmori(Zhaoetal., 2010)、黑腹果蠅(Doreretal., 2003)、冬尺蛾Operophterabrumata(Derksetal., 2015)，蠅蛹金小蜂Nasoniavitripennis(Werrenetal., 2010)等多個(gè)昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)osiris基因。在功能上，目前已知osiris基因家族與果蠅對(duì)辛酸的抗性(López, 2015)，意大利蜜蜂Apismellifera的細(xì)菌免疫(Cornmanetal., 2013)、白蟻Termite的發(fā)育(Terraponetal., 2014)、家蠶性別與組織發(fā)育(Ganetal., 2012)等密切相關(guān)。

作為昆蟲(chóng)特異性基因，osiris基因家族成員表現(xiàn)出兩個(gè)明顯的特征：保守性與共線性。半變態(tài)與全變態(tài)昆蟲(chóng)中osiris基因都非常保守，均含信號(hào)肽與DUF1676結(jié)構(gòu)域。如比較果蠅屬中D.melanogaster與D.sechellia的Osiris蛋白，發(fā)現(xiàn)Osiris 6/7的編碼區(qū)完全一致，Osiris 8中只有2個(gè)氨基酸的變化(López, 2015)。從osiris基因家族在染色體上的共線性來(lái)看，該家族所在位置是果蠅中最大的共線性區(qū)段。Shah等(2012)認(rèn)為，在昆蟲(chóng)和其他節(jié)肢動(dòng)物在進(jìn)化上分離以后、昆蟲(chóng)種類分化之前，osiris基因家族在短時(shí)間內(nèi)迅速的復(fù)制與功能化，osiris基因家族的序列和共線性應(yīng)該在進(jìn)化中受到強(qiáng)烈選擇、并保留到現(xiàn)在。

本文利用菜粉蝶發(fā)育轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，比對(duì)并鑒定16個(gè)菜粉蝶Osiris蛋白，描述了菜粉蝶Osiris蛋白家族的基本特征，重建昆蟲(chóng)Osiris蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)osiris基因在菜粉蝶不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)模式作初步分析，為今后研究菜粉蝶osiris基因的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 菜粉蝶轉(zhuǎn)錄組與基因組數(shù)據(jù)

菜粉蝶卵、1齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)、5齡幼蟲(chóng)、蛹與成蟲(chóng)6個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Qietal., 2016)與成蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室前期拼接而成。

1.2 菜粉蝶Osiris家族成員發(fā)現(xiàn)

在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上下載目前已確定的昆蟲(chóng)的Osiris蛋白序列，使用BLAST(Mount, 2007)程序?qū)⒉朔鄣霓D(zhuǎn)錄組序列與上述已知Osiris蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，取期望值E-value<1e-5，取最佳匹配結(jié)果并根據(jù)其序列為菜粉蝶的Osiris蛋白命名。

1.3 菜粉蝶Osiris家族結(jié)構(gòu)域分析

用Transcode(Haasetal., 2013)軟件預(yù)測(cè)編碼osiris基因的ORF并翻譯成氨基酸序列。用SMART在線軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行信號(hào)肽與結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。將osiris基因cDNA序列使用本地化BLAST的方法，將編碼Osiris的mRNA比對(duì)到菜粉蝶基因組上，分析其外顯子、內(nèi)含子特征。

1.4 昆蟲(chóng)Osiris家族進(jìn)化分析

Osiris蛋白使用clustalX軟件(Larkinetal.,2007)進(jìn)行多序列比對(duì)分析，用MEGA 6.0(Tamuraetal., 2013)采用Neighbor-joining(NJ)法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)重構(gòu)，Bootstrap重復(fù)設(shè)置為500。

1.5 菜粉蝶osiris家族RNA-seq表達(dá)量分析

osiris家族基因在菜粉蝶卵、1齡幼蟲(chóng)、3齡幼蟲(chóng)、5齡幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)6個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量，利用Trinity(Haasetal., 2013)軟件調(diào)用RSEM(Lietal., 2011)計(jì)算出對(duì)應(yīng)的reads數(shù)目，然后再調(diào)用edgeR(Daietal., 2014)軟件對(duì)其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，最后得到osiris基因在不同樣本中的表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜粉蝶的Osiris蛋白家族

將菜粉蝶cDNA和已知Osiris蛋白序列比對(duì)，得到了16個(gè)菜粉蝶osiris基因家族成員。其中12個(gè)菜粉蝶osiris基因家族成員比對(duì)到鱗翅目的同源基因，另外4個(gè)菜粉蝶osiris家族基因比對(duì)到黑腹果蠅同源基因(表1)。在16條osiris基因序列中，ORF最短的編碼160個(gè)氨基酸，ORF最長(zhǎng)的編碼613個(gè)氨基酸。通過(guò)對(duì)BLAST比對(duì)到菜粉蝶基因組上的位置，得到菜粉蝶osiris基因家族成員的外顯子分布結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)菜粉蝶osiris基因的外顯子數(shù)目至少為3個(gè)，其中外顯子數(shù)目最多的是osiris17，含有15個(gè)外顯子。分析內(nèi)含子剪切位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)全部符合gt-ag規(guī)則。

表1 菜粉蝶osiris基因基本屬性

2.2 菜粉蝶Osiris蛋白結(jié)構(gòu)域分析

信號(hào)肽、DUF1676結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域是昆蟲(chóng)Osiris蛋白的三大重要特征。菜粉蝶Osiris家族蛋白中有15個(gè)含有信號(hào)肽，僅Osiris 17不含信號(hào)肽，該特征與黑腹果蠅中的同源蛋白Osiris 17一致(圖1)。15個(gè)Osiris蛋白含有DUF1676結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域在不同成員之間較保守(圖2)。Osiris 22沒(méi)有DUF1676結(jié)構(gòu)域但它與黑腹果蠅同源，黑腹果蠅Osiris 22蛋白亦不含有DUF1676結(jié)構(gòu)域，但含有信號(hào)肽和兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(Douglasetal., 2003)。13個(gè)Osiris蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)域，僅Osiris 2、Osiris 23與Osiris 24蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域。Osiris序列中含有的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域表明其為分泌蛋白或跨膜蛋白。在菜粉蝶Osiris 17中還含有一個(gè)DM4_12結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是在黑腹果蠅中首次發(fā)現(xiàn)(Lachaiseetal., 1988)，大約含有115個(gè)氨基酸并且含有4個(gè)高度保守的半胱酸殘基，其具體生物學(xué)功能尚未解析。

圖1 蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析Fig.1 Analysis of protein structure domain

2.3 昆蟲(chóng)Osiris家族進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，得到127條已確定的昆蟲(chóng)Osiris家族序列，其中鱗翅目昆蟲(chóng)包含59條，并利用蛋白質(zhì)序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)(圖2)。結(jié)果可看出，Osiris各個(gè)亞族在進(jìn)化樹(shù)分支上存在明顯分歧，同一亞族的成員多成簇存在且以單系群為主，顯示Osiris家族是在昆蟲(chóng)物種分化前形成的多基因家族。對(duì)Osiris家族種內(nèi)和種間的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，計(jì)算Osiris家族在種內(nèi)和種間的差異度，結(jié)果顯示同一個(gè)Osiris家族序列在種間的保守性比不同的Osiris家族序列在種內(nèi)的保守性強(qiáng)。

為進(jìn)一步證實(shí)單個(gè)Osiris蛋白在昆蟲(chóng)種類間的分化，隨機(jī)選取菜粉蝶和其他昆蟲(chóng)中的Osiris 7和Osiris 19序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果證實(shí)了在不同的物種之間Osiris家族序列是高度保守的，且菜粉蝶和大紅斑蝶及冬尺蛾的Osiris家族親緣關(guān)系相對(duì)較近(圖3)。

2.4 菜粉蝶osiris基因家族在其發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式

菜粉蝶osiris家族成員基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量如圖4所示?？梢钥闯鰋siris基因不同發(fā)育階段的表達(dá)模式趨向一致。如在卵期，3齡幼蟲(chóng)期和成蟲(chóng)期表達(dá)量都很低甚至不表達(dá)，峰值一般出現(xiàn)在1齡或5齡幼蟲(chóng)期。其中osiris9B、osiris20、osiris2、osiris19、osiris18和osiris9D在1齡和5齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量都很高，osiris9F、osiris9A、osiris9E、osiris9C、osiris7、osiris17、osiris22和osiris24在5齡幼蟲(chóng)期表達(dá)量最高。osiris基因在菜粉蝶不同生長(zhǎng)時(shí)期表達(dá)量變化的相似趨勢(shì)，提示osiris基因家族不同成員轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的相似性且可能與發(fā)育相關(guān)的，值得進(jìn)一步深入挖掘其機(jī)制。

圖2 Osiris家族DUF1676結(jié)構(gòu)域多序列比對(duì)分析Fig.2 Multiple sequence alignment analysis of DUF1676

圖3 各個(gè)物種的Oisris家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of Osiris gene family注：P.x,柑橘鳳蝶；P.p,玉帶鳳蝶；P.r,菜粉蝶；D.p,大紅斑蝶；B.m,家蠶；O.b,冬尺蛾；C.q,致倦庫(kù)蚊；A.d,達(dá)氏按蚊；D.me, 黑腹果蠅；D.si,擬果蠅；N.v,蠅蛹金小蜂；L.n,黑褐毛山蟻；A.p,豌豆蚜。Note: P.x, Papilio xuthus; P.p, Papilio polytes; P.r, Pieris rapae Linne; Danaus plexippus (D.p), B.m, Bombyx mori; O.b, Operophtera brumata; C.q, Culex quinquefasciatus; A.d, Anopheles darling; D.me, Drosophila melanogaster; D.si, Drosophila simulans; N.v, Nasonia vitripennis; L.n, Lasius niger; A.p, Acyrthosiphon pisum.

圖4 各昆蟲(chóng)之間Osiris 7和Osiris 19的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Osiris 7 and Osiris 19注：P. xuthus,柑橘鳳蝶Papilio Xuthus；P. polytes,玉帶鳳蝶Papilio polytes；P. rapae,菜粉蝶Pieris rapae Linne；D. plexippus,大紅斑蝶Danaus plexippus；B. mori,家蠶Bombyx mori；O. brumata,冬尺蛾Operophtera brumata；C. quinquefasciatus,致倦庫(kù)蚊Culex quinquefasciatus；A. darling,達(dá)氏按蚊Anopheles darling；D. melanogaster,黑腹果蠅Drosophila melanogaster；D. simulans,擬果蠅Drosophila simulans；N. vitripennis,蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis； L. niger,黑褐毛山蟻Lasius niger；A. pisum,豌豆蚜Acyrthosiphon pisum。

圖5 菜粉蝶osiris基因表達(dá)模式圖Fig.5 Gene expression profiles of the osiris gene family in Pieris rapae注：egg,卵期；L1，1齡幼蟲(chóng)期first larval stages；L3，3齡幼蟲(chóng)期third larval stages；L5，5齡幼蟲(chóng)期fifth larval stages；pupa，蛹期；adult，成蟲(chóng)期。

3 結(jié)論與討論

osiris基因簇是昆蟲(chóng)最大的保守性基因家族。通過(guò)對(duì)菜粉蝶轉(zhuǎn)錄組和基因組的研究發(fā)現(xiàn)菜粉蝶中含有osiris家族基因16個(gè)。通過(guò)對(duì)其結(jié)構(gòu)域的研究發(fā)現(xiàn)菜粉蝶Osiris蛋白家族中除Osiris 22之外都含有DUF1676結(jié)構(gòu)域，有趣的是在最早發(fā)現(xiàn)該基因家族成簇存在的黑腹果蠅中，Osiris 22同樣也不含有DUF1676結(jié)構(gòu)域而其余Osiris蛋白均含有該結(jié)構(gòu)域。DUF1676結(jié)構(gòu)域在Osiris家族中的普遍存在可以預(yù)測(cè)其可能在Osiris家族中起著重要的作用，但其具體功能目前仍然未知(Doreretal., 2003)。在對(duì)黑腹果蠅的研究當(dāng)中顯示，黑腹果蠅的20條osiris基因均位于3號(hào)染色體上(Doreretal., 2003)，對(duì)于其在菜粉蝶染色體中是否也具有類似的分布特征仍需進(jìn)一步研究。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)重構(gòu)顯示，菜粉蝶Osiris蛋白在進(jìn)化上與鱗翅目昆蟲(chóng)同源蛋白親緣關(guān)系接近，且昆蟲(chóng)Osiris蛋白各亞家族成員在進(jìn)化分支上的成簇存在也表明Osiris蛋白進(jìn)化上的保守性。osiris家族基因如此保守，其中序列的同義突變率顯著高于無(wú)義突變率(Doreretal., 2003)，顯示出強(qiáng)烈的功能選擇與重要性。從昆蟲(chóng)的Osiris家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析可以看出，Osiris家族在不同物種的直系同源關(guān)系比較明顯，因此可以推測(cè)出其是在昆蟲(chóng)物種分化之前就已經(jīng)形成的多基因家族。在比較黑腹果蠅與岡比亞按蚊的Osiris蛋白同源性時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)存在橫向同源基因(Doreretal., 2003)。此外，果蠅Osiris家族在序列上和染色體分布上都存在明顯的保守性(Doreretal., 2003)，但由于目前菜粉蝶基因組研究還處于初級(jí)階段，基因組拼接出的序列還不夠長(zhǎng)，因此不能得到Osiris家族在菜粉蝶染色體分布上的保守性，其在染色體上的位置信息還需進(jìn)一步研究與發(fā)現(xiàn)。

除了早期的劑量敏感效應(yīng)外，目前已發(fā)現(xiàn)與抗性(López., 2015)，免疫(Cornmanetal., 2013)、白蟻發(fā)育(Terraponetal., 2014)或性別(Ganetal., 2012)等相關(guān)。如果蠅中的osiris基因第6/7/8外顯子被敲除后，果蠅對(duì)辛酸的敏感度增加。對(duì)脂肪體和唾液腺進(jìn)行組織特異性基因敲除后，反而會(huì)增加對(duì)辛酸的抗性(López, 2015)。而蜜蜂幼蟲(chóng)被腐臭病感染后，17個(gè)osiris基因均上調(diào)，其中11個(gè)基因差異顯著(Cornmanetal., 2013)。在菜粉蝶中，通過(guò)對(duì)其不同生長(zhǎng)時(shí)期的RNA-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，菜粉蝶osiris基因在不同的生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，其中osiris基因上調(diào)主要發(fā)生在1齡和5齡幼蟲(chóng)時(shí)期，在卵期，3齡幼蟲(chóng)期，蛹期和成蟲(chóng)期表達(dá)量較低，預(yù)示著osiris基因家族可能在菜粉蝶不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期發(fā)揮著不同的作用。類似的上調(diào)表達(dá)聚集在某些發(fā)育階段的現(xiàn)象，也存在與白蟻發(fā)育中(Terraponetal., 2014)，但具體功能均需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，不同的osiris基因表達(dá)量隨發(fā)育變化趨勢(shì)相對(duì)一致，預(yù)測(cè)菜粉蝶osiris基因受相似的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)。隨著基因組信息的進(jìn)一步完善，調(diào)控元件的分析有助于證實(shí)這一猜測(cè)。

通過(guò)對(duì)菜粉蝶osiris基因家族的研究，可以充實(shí)對(duì)昆蟲(chóng)osiris家族的認(rèn)識(shí)，為今后人們研究和發(fā)現(xiàn)osiris家族的功能提供了參考。osiris家族可能作為新型生物殺蟲(chóng)劑的良好靶位點(diǎn)，通過(guò)對(duì)菜粉蝶osiris家族的研究，對(duì)未來(lái)菜青蟲(chóng)以及其他害蟲(chóng)的生物防治、農(nóng)藥開(kāi)發(fā)與綜合防治提供了新的思路，其實(shí)踐意義重大。

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IdentificationanddevelopmentalpatternofosirisgenefamilyinthecabbagebutterflyPierisrapae

ZHAO Lei, XIA Hao, QIAN Qiang, XU Yuan, LI Kai*

(College of Chemistry, Chemical Engineering & Biotechnology, Donghua University, Shanghai 201620, China)

osirisgene family are insect-specific genes, whose homologous genes are unavailable in any other species. In current study, 16osirisgenes were identified belong to 11 sub-families based on the developmental transcriptome ofPierisrapae. All these genes were found to be split genes with 3 to 15 exons by compared with theP.rapaegenome. Structural domain analysis revealed that each Osiris protein contained one signal peptide and one structure domain (DUF1676), while most of them have a trans-membrane domain. Phylogenetic analysis indicated thatosirisgene had been formed before insect speciation. Analysis of different developmental stage ofP.rapaetranscriptomes showed thatosirisgene members had similar expression pattern throughout the entire life-stage (high expression in the first and fifth larval stages and low expression in other growth stages). These results indicated that different members ofosirisgene family may be involved in similar mechanism of transcription regulation and related with development.

osirisgene family; protein structure domain; phylogenetic; development

趙磊，夏昊，錢(qián)強(qiáng),等.菜粉蝶osiris基因家族鑒定與發(fā)育動(dòng)態(tài)[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2017,39(6):1319-1325.

Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)06-1319-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31171199)；東華大學(xué)“勵(lì)志計(jì)劃”(B201308)

趙磊，男，1991年生，山東人，碩士，研究方向?yàn)槔ハx(chóng)發(fā)育與免疫，E-mail: zhaolei19911010@163.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: likai@dhu.edu.cn

Received: 2016-09-06; 接受日期Accepted: 2016-11-05