王榮春，何秋霞，韓建，陳錫強，孫晨，王希敏，韓利文，劉可春

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)重點實驗室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014)

氯霉素對斑馬魚幼魚發(fā)育及免疫毒性的研究

王榮春，何秋霞，韓建，陳錫強，孫晨，王希敏，韓利文*，劉可春*

(山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物檢測技術(shù)重點實驗室，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250014)

以野生型及轉(zhuǎn)基因Tg(lyz:EGFP)斑馬魚幼魚為研究對象，研究氯霉素對斑馬魚幼魚的發(fā)育毒性及對免疫細胞的影響。用不同濃度的氯霉素分別處理72 h，觀察斑馬魚幼魚的生存率、畸形率和形態(tài)變化，以及標(biāo)記綠色熒光免疫細胞在斑馬魚幼魚中的數(shù)量。結(jié)果顯示，隨著氯霉素濃度(≥ 100 mg/L)的升高和暴露時間的延長，斑馬魚的存活率和孵化率降低，死亡率升高；氯霉素對斑馬魚幼魚的致畸作用，主要表現(xiàn)為心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲；通過對Tg(lyz:EGFP)品系的觀察，發(fā)現(xiàn)氯霉素(≥ 75 mg/L)可以降低斑馬魚幼魚免疫細胞的數(shù)量。研究表明，氯霉素對斑馬魚幼魚的致畸和致死作用具有劑量、時間依賴性，并可以導(dǎo)致斑馬魚幼魚的免疫細胞數(shù)量減少，具有免疫毒性。

氯霉素；斑馬魚；發(fā)育毒性；免疫細胞

氯霉素(chloramphenicol)是一種廣譜抗生素，廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)及臨床應(yīng)用中。氯霉素能夠抑制多種微生物的生長，但在其應(yīng)用過程中也會對機體產(chǎn)生危害，如骨髓抑制、白血病、再生不良性貧血等[1-3]。歐盟、美國及日本等國家已經(jīng)禁止在水產(chǎn)養(yǎng)殖和畜牧業(yè)中使用氯霉素，在我國雖然也已禁止，但由于其價格低廉且容易獲得，在生產(chǎn)、生活中仍有大量應(yīng)用。

斑馬魚是近年來藥物篩選和安全評價普遍使用的新型模式生物，在基因水平上與人類具有87%的同源性，而且具有繁殖周期短、胚胎透明易于觀察、遺傳操作簡單以及飼養(yǎng)簡便等優(yōu)點[4-5]。同時，熒光標(biāo)記不同組織(肝臟、心臟、腎臟等)、細胞(神經(jīng)細胞、免疫細胞等)的多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系的出現(xiàn)，也促進了斑馬魚在不同學(xué)科研究中的應(yīng)用[6-8]。與傳統(tǒng)的實驗動物大、小鼠相比，斑馬魚具有實驗操作簡便、用藥量少、培養(yǎng)時間短、經(jīng)濟等優(yōu)點。斑馬魚作為一種體內(nèi)實驗的模式動物，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于分子發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)和免疫學(xué)等學(xué)科的研究中[9-10]。

本研究以斑馬魚幼魚為動物模型，探討了氯霉素對斑馬魚幼魚的發(fā)育毒性，并研究了氯霉素對斑馬魚幼魚中心粒細胞發(fā)育及遷移的影響，為抗生素的毒理學(xué)研究提供了參考依據(jù)。

1 實驗材料和儀器

1.1 試劑

氯霉素(Sigma公司)使用DMSO(Sigma公司)配置，用斑馬魚養(yǎng)殖水溶解稀釋。斑馬魚養(yǎng)殖水的配方為:5.0 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.4 mmol/L CaCl2，0.16 mmol/L MgSO4[11]。三卡因( Sigma 公司) 使用純凈水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.16%的溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

1.3 儀器

體視熒光顯微鏡 SZX16(Olympus 公司)；斑馬魚飼養(yǎng)養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 氯霉素與斑馬魚幼魚共孵育

將受精后1 h的野生型斑馬魚AB品系放在培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎于6孔板中，每孔30個胚胎。實驗中氯霉素的濃度分別設(shè)置為0、25、50、75、100、150、200、300 mg /L(養(yǎng)殖水配置)和空白對照組(DMSO)，每孔給予不同濃度的氯霉素暴露液5 mL，每個濃度組分別設(shè)置 3個重復(fù)孔， 給藥后放在 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)控光培養(yǎng)。連續(xù)藥液暴露 3 d，每24 h更換一半藥液，并去除死亡幼魚。

2.2 斑馬魚幼魚觀察和記錄

分別在給藥24、48、72 h后記錄斑馬魚死亡數(shù)和畸形數(shù)，然后計算其死亡率、畸形率。使用三卡因麻醉幼魚后，在體視熒光顯微鏡下拍照觀察，并記錄斑馬魚形態(tài)變化。

2.3 免疫細胞觀察

將受精后1 h的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lyz:EGFP)品系進行氯霉素處理(0、25、50、75、100、150 mg/L)，方法同2.1。

給藥72 h后，使用三卡因麻醉幼魚，在體視熒光顯微鏡下拍照觀察綠色熒光標(biāo)記的中性粒細胞的數(shù)量和定位。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進行樣本均數(shù)間多重比較。

3 結(jié)果與分析

3.1 氯霉素對斑馬魚幼魚死亡率的影響

觀察斑馬魚幼魚的死亡情況，氯霉素暴露24 h后，空白對照組和氯霉素組(≤ 200 mg/L)在斑馬魚存活率上沒有統(tǒng)計學(xué)差異，300 mg /L組斑馬魚存活率顯著下降；氯霉素暴露48 h后，隨著濃度的提高，氯霉素組(≥ 150 mg/L)存活率顯著性降低(P<0.05)；給藥72 h后，氯霉素組(≥ 100 mg/L)幼魚存活率顯著降低，300 mg/L處理組斑馬魚幼魚存活率低于5 %，見圖1。

*表示P<0.05,與對照相比具有顯著差異。圖1 氯霉素暴露對斑馬魚幼魚存活率的影響Fig.1 The effect of chloramphenicol exposure on the survival rate of juvenile zebrafish

3.2 氯霉素對斑馬魚幼魚孵化率和發(fā)育畸形的影響

氯霉素暴露72 h后，100、150、200、300 mg /L組斑馬魚孵化率顯著降低(P <0.05)，其中300 mg/L組孵化率接近0 %，見圖2。100、150、200、300 mg /L組斑馬魚畸形率顯著提高(P <0.05)，其中200、300 mg /L組畸形率為95%以上?；沃饕憩F(xiàn)為心包水腫、卵黃囊水腫、脊柱彎曲等癥狀，見圖3、4。

*表示P<0.05,與對照相比具有顯著差異。圖2 氯霉素暴露72 h對斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.2 The effect of chloramphenicol exposure for 72 h on the hatching rate of zebrafish embryos

YSE 卵黃囊水腫； PE 心包水腫； SC 脊柱彎曲； CTL 對照。 圖3 氯霉素對斑馬魚幼魚發(fā)育的影響Fig.3 The impact of chloramphenicol on the morphological development of the juvenile zebrafish

*表示P<0.05,與對照相比具有顯著差異。圖4 氯霉素暴露72 h對斑馬魚畸形率的影響Fig.4 The impact of chloramphenicol exposure for 72 h on the malformation rate of zebrafish

3.3 氯霉素對斑馬魚幼魚中性粒細胞發(fā)育的影響

選取不同濃度的氯霉素(0、25、50、75、100、150 mg/L)處理綠色熒光標(biāo)記中性粒細胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lyz:EGFP)品系胚胎。暴露72 h后，在體式熒光倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)氯霉素可以抑制中性粒細胞的熒光表達，隨著氯霉素濃度升高，斑馬魚免疫細胞數(shù)目明顯減少。對斑馬魚尾部免疫細胞的數(shù)目進行計數(shù)并統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，氯霉素暴露組(75、100 mg/L)斑馬魚幼魚尾部中性粒細胞的數(shù)目顯著降低，見圖5，6。

圖5 氯霉素對斑馬魚免疫細胞發(fā)育的影響Fig.5 The effect of chloramphenicol on the immune cells development of juvenile zebrafish

*表示P<0.05,與對照相比具有顯著差異。圖6 AE氯霉素處理對斑馬魚免疫細胞數(shù)目的影響Fig.6 The effect of chloramphenicol treatment on the immune cell number of zebrafish

4 討論

氯霉素從20世紀(jì)中葉被發(fā)現(xiàn)以來，在一段時期內(nèi)，作為人及動物臨床治療疾病的藥物及飼料添加劑廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，主要用于清除對機體造成不利影響的各類病菌。然而，氯霉素在使用過程中表現(xiàn)出多種毒副作用，臨床表現(xiàn)出嚴(yán)重的骨髓造血機能抑制、灰嬰綜合征、神經(jīng)毒性及免疫毒性等[12-14]。盡管抗生素的使用會導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性并對有機體產(chǎn)生危害，但是在一些缺乏對此類藥物進行管理控制的國家，仍然被大量使用。

斑馬魚胚胎及其幼魚用于研究藥物的發(fā)育毒性具有獨特優(yōu)勢[15-16]，多種熒光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可以在透明的魚體中直接觀察藥物對各類組織及細胞的作用，更加有利于其在藥物評價中的應(yīng)用[17-18]。

本實驗通過不同濃度氯霉素暴露(25、50、75、100、150、200、300 mg /L)野生型AB品系斑馬魚，結(jié)果表明，氯霉素暴露24 h后，空白對照組和氯霉素組(≤ 200 mg/L)在斑馬魚存活率上沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，300 mg /L組斑馬魚存活率顯著下降；氯霉素暴露48 h后，隨著濃度的提高，氯霉素組(≥ 150 mg/L)存活率顯著性降低(P>0.05)；給藥72 h后，氯霉素組(≥ 100 mg/L)幼魚存活率顯著降低，300 mg/L處理組斑馬魚幼魚存活率低于5 %。說明氯霉素對斑馬魚的發(fā)育具有毒性，并呈現(xiàn)劑量和時間依賴性。根據(jù)上述結(jié)果，我們選用25、50、75、100、150 mg /L的氯霉素處理免疫細胞標(biāo)記熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(lyz:EGFP)品系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露72 h后75、100 mg/L組斑馬魚免疫細胞數(shù)目明顯減少，而低濃度25、50 mg/L組，斑馬魚免疫細胞數(shù)目也明顯減少，說明氯霉素對斑馬魚幼魚具有免疫毒性。

本研究以斑馬魚幼魚為動物模型，探討了氯霉素對斑馬魚幼魚的發(fā)育毒性，并利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚在體直接觀察了氯霉素對免疫細胞的毒性影響，為進一步闡述抗生素免疫毒性提供了重要模型。

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Researchontheeffectsofchloramphenicolondevelopmentalandimmunetoxicityofjuvenilezebrafish

WANGRong-chun，HEQiu-xia，HANJian，CHENXi-qiang，SUNChen，WANGXi-min，HANLi-wen*，LIUKe-chun*

(ShandongProvincialEngineeringLaboratoryforBiologicalTestingTechnology,KeyLaboratoryforDrugScreeningTechnologyofShandongAcademyofSciences,BiologyInstitute，ShandongAcademyofSciences,Jinan250301,China)

∶The impact of chloramphenicol on developmental toxicity and immune cells of wild and transgenic Tg(lyz:EGFP) juvenile zebrafish was investigated. After treated separately with different concentrations of chloramphenicol for 72 hours, the survival rate, abnormal rate, morphology variation of juvenile zebrafish, and the number of immune cells labeled with green fluorescent in juvenile zebrafish were observed. The results showed that with the increase of the concentration of chloramphenicol (≥100 mg/L) and the exposure time, the survival rate and hatching rate of zebrafish decreased, and mortality increased. The teratogenic effects of chloramphenicol on juvenile zebrafish included yolk sac edema, pericardial edema and spinal curvature. Through observation of the transgenic strain Tg(lyz:EGFP), it was found that chloramphenicol (≥75 mg/L) could inhibit the number of immune cells in zebrafish. This study showed that chloramphenicol had teratogenic and lethal effects on juvenile zebrafish in a time dependent and dose dependent manner. And chloramphenicol had immune toxicity, which could reduce the number of immune cells in juvenile zebrafish.

∶chloramphenicol；zebrafish；developmental toxicity；immune cell

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.06.006

2017-09-14

山東省科學(xué)院青年基金(2015QN010，2015QN012)；山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金(ZR2015YL009，ZR2015YL013)

王榮春(1983—)，男，博士，研究方向為藥理學(xué)。E-mail:1wangrongchun@163.com

*通信作者，韓利文(1980—)，男，博士，研究方向為藥物篩選及代謝組學(xué)研究。E-mail: hanliwen08@126.com 劉可春(1964—)，男，博士，研究方向為藥物篩選。E-mail:hliukch@sdas.org

R737.33

A

1002-4026(2017)06-0035-06