張榮儒, 張禮文, 張 鵬, 章躍陵, 劉 柱, 徐玉泉*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.汕頭大學(xué)理學(xué)院, 廣東 汕頭 515063；3.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, ?？?570228

苯二酚內(nèi)酯及其衍生物殺線蟲活性研究

張榮儒1，2，3, 張禮文1, 張 鵬1, 章躍陵2, 劉 柱3*, 徐玉泉1*

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081; 2.汕頭大學(xué)理學(xué)院, 廣東 汕頭 515063；3.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院, ?？?570228

采用浸漬法研究了釀酒酵母異源表達(dá)的苯二酚內(nèi)酯monocillin II、10,11-dehydrocurvularin、pre-asperfuranone、trans-resorcylide、desmethyl-lasiodiplodin和lasiodiplodin的殺秀麗線蟲活性。首次發(fā)現(xiàn)苯二酚內(nèi)酯10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin具有殺線蟲活性。分別以0.1 mg/mL、0.2 mg/mL 和0.5 mg/mL的10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin處理秀麗線蟲的二齡幼蟲(L2)24 h后，秀麗線蟲的校正死亡率分別為7.95%、15.30%、46.41%和3.41%、8.90%、27.47%。Desmethyl-lasiodiplodin的甲基化產(chǎn)物lasiodiplodin的殺線蟲活性降低，濃度為0.5 mg/mL時(shí)，線蟲的校正死亡率為16.12%。研究結(jié)果為植物線蟲病害的防治提供了新的思路。

苯二酚內(nèi)酯；秀麗線蟲；10,11-dehydrocurvularin；desmethyl-lasiodiplodin；殺線蟲活性

植物線蟲病是小麥、水稻和馬鈴薯等糧食作物及番茄、黃瓜和松樹等經(jīng)濟(jì)作物的主要病害之一，全球每年因作物病原線蟲造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1 570億美元[1]。植物線蟲為專性寄生生物，在侵染植物組織后，既吸取植株?duì)I養(yǎng)，又分泌一些酶或毒素，使植物的組織發(fā)生病變，影響植株水分和營(yíng)養(yǎng)的吸收與運(yùn)轉(zhuǎn)，甚至導(dǎo)致植株死亡[2]。

利用化學(xué)殺線蟲劑防治線蟲病害是最主要的農(nóng)業(yè)措施，但大部分商業(yè)化的殺線蟲劑對(duì)人畜有較高毒性，且對(duì)環(huán)境有害，如滅線磷、克百威和涕滅威等，現(xiàn)已經(jīng)被取消或限制使用。近年來(lái)國(guó)內(nèi)線蟲病害呈快速上升趨勢(shì)，而生產(chǎn)中使用的殺線蟲劑品種單一，長(zhǎng)期使用必然導(dǎo)致抗藥性，因此需要開發(fā)新的殺線蟲劑。利用微生物合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物開發(fā)新的殺線蟲劑，目前已成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)[3]。

真菌能夠合成豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中由聚酮合酶(PKS)催化合成的聚酮類化合物以結(jié)構(gòu)和活性多樣著稱[4]，其中阿維菌素就有顯著的殺線蟲活性，目前已在生產(chǎn)中大量使用。苯二酚內(nèi)酯(benzenediol lactones，BDLs)是聚酮化合物中重要的一類，根據(jù)其骨架結(jié)構(gòu)可以分為二羥基苯甲酸內(nèi)酯(resorcylic acid lactones，RALs)和二羥基苯乙酸內(nèi)酯(dihydroxyphenylacetic acid lactones，DALs)[4]，其結(jié)構(gòu)多樣且具有多種生物活性[5]。例如根赤殼菌素(radicicol)能夠抑制Hsp90分子伴侶蛋白的合成，具有抗腫瘤的活性[6]；玉米赤霉烯酮(zearalenone)導(dǎo)致秀麗線蟲的體長(zhǎng)變短、后代生殖能力降低，從而表現(xiàn)出殺線蟲活性[7]。因此，本研究通過(guò)在酵母中異源表達(dá)10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin等6種苯二酚內(nèi)酯聚酮類化合物，采用浸漬法篩選這些化合物的殺秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)活性，并對(duì)他們的殺線蟲活性進(jìn)行比較，為開發(fā)新的殺線蟲劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中合成苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的質(zhì)粒和釀酒酵母菌株BJ5464-NpgA均由本課題組保存。苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的詳細(xì)信息如表1所示。供試線蟲為秀麗線蟲，伊維菌素購(gòu)自齊魯動(dòng)物保健有限公司。

表1 苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的結(jié)構(gòu)Table 1 Construction of benzenediol lactones and derivatives.

1.2 方法

1.2.1供試苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的異源表達(dá)[8]用Frozen EZ Yeast Transformation Ⅱ(TZ001)試劑盒將含有合成苯二酚內(nèi)酯基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到釀酒酵母中，在Trp和Ura二缺(或-Leu-Trp-Ura三缺)SC培養(yǎng)基上篩選雙(3個(gè))質(zhì)粒酵母轉(zhuǎn)化菌落。挑取二缺(三缺)SC培養(yǎng)基平板轉(zhuǎn)化菌落，接種到25 mL相應(yīng)的SC液體培養(yǎng)基中，28℃，220 r/min搖床培養(yǎng)；培養(yǎng)約24 h至OD600=0.6，加入等體積1%葡萄糖的酵母豐富培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵；培養(yǎng)72 h后，用乙酸乙酯萃取；反向高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)，確定后大規(guī)模發(fā)酵。

1.2.2供試苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的分離純化[9]將粗提物用適量甲醇溶解后，與100～200目硅膠拌勻；稱取300～400目硅膠(粗提物:300～400目硅膠質(zhì)量比=1∶13～1∶15)加入一定體積的石油醚，用玻璃棒攪拌成勻漿后，濕法裝柱。上樣后流動(dòng)相洗脫，收集流分后，洗脫液依次為石油醚、石油醚與乙酸乙酯混合物(石油醚與乙酸乙酯的比例根據(jù)所提取的化合物不同而變化)、甲醇。

將收集到的流分用薄層色譜硅膠板(TLC)檢測(cè)后，相同比移值(Rf)的組分合并后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，用HPLC檢測(cè)，以確定目標(biāo)化合物。再將其進(jìn)一步分離，最后用HPLC在210 nm下檢測(cè)化合物的純度，稱重后4℃保存。

1.2.3制備秀麗隱桿線蟲二齡幼蟲懸浮液 利用網(wǎng)篩法制備秀麗隱桿線蟲二齡幼蟲懸浮液。已經(jīng)滅菌的金屬網(wǎng)篩擺放于燒杯中，從上到下的網(wǎng)篩依次為200目(75 μm)、400目(38 μm)、625目(20 μm)，向燒杯中加入M9緩沖液，直至溶液界面到達(dá)625目網(wǎng)篩的中部；用M9緩沖液沖洗NGM培養(yǎng)基平板上的線蟲后，將含有線蟲的M9緩沖液加入到最上層篩網(wǎng)上，于超凈臺(tái)靜置；約12 h后，用5 mL的移液槍沿著燒杯內(nèi)壁與篩子外側(cè)的縫隙，緩慢把緩沖液全部吸走，依次取出200目、400目、625目網(wǎng)篩，最后收集的線蟲即為二齡幼蟲。然后將秀麗線蟲懸浮液稀釋或者離心富集，制成濃度約600條/mL的秀麗隱桿線蟲二齡幼蟲懸浮液，以供毒力生物測(cè)定。

1.2.4確定合適的溶劑及助溶劑 采用浸漬法[10]測(cè)定甲醇、二甲基亞楓(DMSO)和Tween 80對(duì)秀麗線蟲2齡幼蟲的影響。活性測(cè)試選擇在24孔板中進(jìn)行，測(cè)試體系(線蟲數(shù)量為60條，總體積為500 μL)如表2所示，于培養(yǎng)箱中20℃黑暗孵育。

表2 有機(jī)溶劑及助溶劑測(cè)試體系Table 2 Test system of organic solvents and cosolvent.

待孵育24 h后，在解剖鏡下觀察線蟲，統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡率，對(duì)于線蟲死亡的檢驗(yàn)方法為：用針刺線蟲，僵直不動(dòng)者為死亡，彎曲或明顯鉤狀為活體。處理組和對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)平行。采用同樣的方法測(cè)試有機(jī)溶劑和Tween 80混合對(duì)線蟲的影響。

1.2.5苯二酚內(nèi)酯及其衍生物對(duì)秀麗線蟲2齡幼蟲的影響 將苯二酚內(nèi)酯及其衍生物分別用DMSO溶解，制成100 mg/mL的母液，置4℃保存?zhèn)溆?；再將上述化合物稀釋?0 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL置4℃保存?zhèn)溆?；活性測(cè)試選擇在24孔板中進(jìn)行，測(cè)試體系(線蟲數(shù)量為60條，總體積為500 μL)如表3所示。于20℃黑暗孵育24 h；最終體系中DMSO的終濃度為1%，Tween 80的終濃度為0.1%；統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡率，處理組和對(duì)照組重復(fù)3次。

表3 苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的測(cè)試體系Table 3 Test system of BDLs and their derivatives.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

為了消除線蟲自然死亡對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，因此采用校正死亡率[11]計(jì)算殺線蟲活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑及助溶劑對(duì)線蟲的影響

采用浸漬法測(cè)定1%的甲醇、1% DMSO、0.1% Tween 80及有機(jī)溶劑和Tween 80混合對(duì)線蟲的影響，數(shù)據(jù)處理采用獨(dú)立樣品的t檢驗(yàn)(95%的置信區(qū)間)。

如圖1所示，當(dāng)體系中DMSO、甲醇的終濃度為1%時(shí)，處理組線蟲的死亡率和對(duì)照組M9的線蟲死亡率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)體系中的助溶劑Tween 80終濃度為0.1%時(shí)，處理組線蟲的死亡率和對(duì)照組M9的線蟲死亡率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)；當(dāng)體系中DMSO 1%-Tween 80 0.1%或者甲醇 1%-Tween 80 0.1%時(shí)，處理線蟲的死亡率和對(duì)照組M9的線蟲死亡率沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，表明當(dāng)體系中存在DMSO 1%-Tween 80 0.1%對(duì)線蟲沒(méi)有傷害。

2.2 苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的殺線蟲活性

采用浸漬法測(cè)定不同濃度苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的殺線蟲活性，結(jié)果如圖2所示，供篩選的6種苯二酚內(nèi)酯及其衍生物，處理24 h后，10,11-dehydrocurvularin表現(xiàn)出了較強(qiáng)的殺線蟲活性，在0.5 mg/mL、0.2 mg/mL和0.1 mg/mL，其校正死亡率分別為46.41%±8.54%、15.30%±5.60%和7.95%±2.71%；desmethyl-lasiodiplodin的殺線蟲活性較弱，濃度在0.5 mg/mL、0.2 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)，其校正死亡率分別為27.47%±2.19%、8.94%±0.64%和3.41%±0.62%。

圖1 有機(jī)溶劑及助溶劑對(duì)線蟲的影響Fig.1 Effects of organic solvents and solvents on Caenorhabditis elegans.注:對(duì)照：M9緩沖液；DMSO：體系中DMSO的終濃度為1%；甲醇：體系中甲醇的終濃度為1%；Tween 80：體系中Tween 80終濃度為0.1%；DMSO+T:體系中DMSO的終濃度為1%，Tween 80的終濃度為0.1%；甲醇+T：體系中甲醇的終濃度為1%， Tween 80的終濃度為0.1%。

圖2 苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的殺線蟲活性Fig.2 The nematocidal activities of benzenediol lactones and derivatives.

Monocillin II、trans-resorcylide和pre-asperfuranon在0.5 mg/mL下，其校正死亡率均不超過(guò)10%。陽(yáng)性對(duì)照伊維菌素濃度為0.2 mg/mL和0.1 mg/mL時(shí)，其校正死亡率分別為10.12%±0.17%和5.67%±1.26%。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中所用的伊維菌素濃度大于0.2 mg/mL，會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的遮蓋，無(wú)法統(tǒng)計(jì)線蟲的死亡率。

對(duì)10,11-dehydrocurvularin、desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin和陽(yáng)性對(duì)照伊維菌素在0.2 mg/mL時(shí)的校正死亡率進(jìn)行單因素方差分析，如圖2所示，在0.2 mg/mL時(shí)，10,11-dehydrocurvularin、desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin和伊維菌素的校正死亡率無(wú)顯著性差異。

對(duì)desmethyl-lasiodiplodin和lasiodiplodin在0.5 mg/mL時(shí)，線蟲的校正死亡率進(jìn)行單因素方差分析，desmethyl-lasiodiplodin與lasiodiplodin校正死亡率存在顯著性差異(P<0.05)。對(duì)desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin濃度在0.2 mg/mL時(shí)的校正死亡率進(jìn)行單因素方差分析，desmethyl-lasiodiplodin與lasiodiplodin校正死亡率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

在體視顯微鏡下(目鏡10×，物鏡40×)觀察死亡的線蟲，如圖3(彩圖見圖版三)所示，死亡的線蟲僵直不動(dòng)，活的線蟲成彎曲狀。從圖中可以看出活的線蟲口、咽和腸道保持完好。而死亡的線蟲其體內(nèi)已經(jīng)看不清這些器官，器官組織已經(jīng)成分散狀。

3 討論

本文通過(guò)異源表達(dá)和浸漬法的方法，研究了苯二酚內(nèi)酯及其衍生物的殺線蟲活性。首次發(fā)現(xiàn)10,11-dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin的殺線蟲活性。

圖3 秀麗線蟲L2在處理前(A)和BDLs處理24 h后(B)對(duì)比Fig.3 Comparation of Caenorhabditis elegans L2 before (A) and after immersing in BDLs for 24 h (B).注：1:線蟲的口；2:線蟲的咽；3:線蟲的腸(彩圖見圖版三)

Kusan等[12]從青霉的菌絲體和發(fā)酵液中分離得到4種苯二酚內(nèi)酯化合物，當(dāng)11-hydrocurvularin、β,γ-dehydrocurvularin、11-β-hydroxy-12-oxo-curvularin、12-oxo-curvularin的濃度為300 mg/L時(shí)，根腐線蟲(Pratylenchusspp.)死亡率分別是35%、80%、23%和33%。

Dong等[13]從真菌CaryosporacallicarpaYMF1.01026中分離得到3個(gè)BDLs類似結(jié)構(gòu)化合物，當(dāng)caryospomycins A～C的濃度為200 mg/L時(shí)，松材線蟲(B.xylophilus)的死亡率分別是57.1%、47.8%和38.5%。10,11-Dehydrocurvularin和desmethyl-lasiodiplodin在200 mg/L時(shí)，秀麗線蟲的校正死亡率分別為15.30%和8.90%。但是在本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)化合物濃度為200 mg/L時(shí)，10,11-dehydrocurvularin、desmethyl-lasiodiplodin、lasiodiplodin和陽(yáng)性對(duì)照伊維菌素的校正死亡率無(wú)顯著性差異。苯二酚內(nèi)酯及其衍生物殺線蟲活性的差異可能不僅與受測(cè)線蟲有關(guān)，也與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。

為了驗(yàn)證BDLs的結(jié)構(gòu)與其殺線蟲活性有無(wú)特定的關(guān)系，將具有殺線蟲活性BDLs及其衍生物聚類分析。結(jié)果表明成環(huán)的前體pre-asperfuranone(RAL)沒(méi)有殺線蟲活性；14元環(huán)的DALs暫時(shí)沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道是否有殺線蟲活性；12元環(huán)RALs(desmethyl-lasiodiplodin)、12元環(huán)DALs(11-hydrocurvularin、β,γ-dehydrocurvularin、11-β-hydroxy-12-oxo-curvularin、12-oxo-curvularin和10,11-dehydrocurvularin)和14元環(huán)RALs(caryospomycins A～C)均存在殺線蟲活性化合物。這表明BDLs殺線蟲的活性與其骨架結(jié)構(gòu)(RALs、DALs)沒(méi)有特定的規(guī)律。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道伊維菌素殺線蟲機(jī)制主要是作用于氯離子通道，導(dǎo)致線蟲的死亡[14]。在秀麗隱桿線蟲中的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transorming growth facter β，TGF-β)信號(hào)通路在秀麗線蟲的先天性免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要作用。Rudolph等[15]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β的受體不會(huì)被10,11-dehydrocurvularin抑制，但是10,11-dehydrocurvularin通過(guò)阻斷Smad轉(zhuǎn)錄因子與DNA上CAGA序列的結(jié)合，導(dǎo)致TGF-β信號(hào)通路的中斷。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)10,11-dehydrocurvularin能夠引起TGF-β調(diào)控的下游基因表達(dá)降低，如pai-1、pdgf、smad7和mmp-2等，甚至在HepG2細(xì)胞內(nèi)引起了tgf-β的下調(diào)。因此10,11-dehydrocurvularin殺線蟲活性可能與TGF β-Smad信號(hào)通路有關(guān)。

既往研究證實(shí)Desmethyl-lasiodiplodin的-OH是其生物活性如抗腫瘤、抗菌的重要基團(tuán)，其苯環(huán)上的-OH修飾為-OCH3后引起了其抗腫瘤、抗菌能力的下降[16,17]。Buayairaksa等[16]研究發(fā)現(xiàn)與desmethyl-lasiodiplodin相比，lasiodiplodin對(duì)KB、BC1和NCI-H187的IC50分別上升了1.6倍、2.7倍和1.9倍。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)desmethyl-lasiodiplodin對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)和尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusariumoxysporumf. sp.cubense)的IC50分別為6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、12.5 μg/mL、100 μg/mL和50 μg/mL；但是lasiodiplodin對(duì)這些病菌的IC50分別上升了4倍、4倍、8倍和2倍。在本研究中，在0.5 mg/mL時(shí)，與desmethyl-lasiodiplodin相比，lasiodiplodin處理下的線蟲校正死亡率下降了1.7倍，這表明desmethyl-lasiodiplodin苯環(huán)上的-OH也是其殺線蟲活性的重要基團(tuán)。

和大多數(shù)農(nóng)藥原藥一樣，苯二酚內(nèi)酯及其衍生物不易溶于水。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，一方面將利用組合生物學(xué)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，如將其苯環(huán)上的-OH進(jìn)行糖基化，甲基化等修飾增強(qiáng)其水溶性，另一方面將通過(guò)研究不同溶劑和乳化劑的配比制成合適的農(nóng)藥劑型，以便其更好的應(yīng)用于生產(chǎn)。

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StudiesontheNematocidalActivitiesofBenzenediolLactonesandTheirDerivatives

ZHANG Rongru1,2,3, ZHANG Liwen1, ZHANG Peng1, ZHANG Yueling2, LIU Zhu3*, XU Yuquan1*

1.BiotechnologyResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100081,China; 2.CollegeofScience,ShantouUniversity,GuangdongShantou515063,China; 3.InstituteofTropicalAgricultureandForestry,HainanUniversity,Haikou570228,China

Benzenediol lactones(BDLs) and their derivatives, including monocillin II, 10,11-dehydrocurvularin, pre-asperfuranone, trans-resorcylide, desmethyl-lasiodiplodin and lasiodiplodin， were obtained by heterologous biosynthesis in yeast. Their nematocidal activities were researched in this study. For the first time, 10,11-dehydrocurvularin and desmethyl-lasiodiplodin were found with nematocidal activity. After treatingCaenorhabditiseleganswith 0.1 mg/mL, 0.2 mg/mL and 0.5 mg/mL of 10,11-dehydrocurvularin and desmethyl-lasiodiplodin for 24 h, respectively, the corrected mortality rate ofC.eleganswas 7.95%, 15.30%, 46.41% and 3.41%, 8.90%, 27.47%. Nematocidal activity of lasiodiplodin was decreased, and the corrected mortality rate with 0.5 mg/mL was 16.12%. This study provided a new idea for the prevention and cure of plant nematode disease.

benzenediol lactones;Caenorhabditiselegans; 10,11-dehydrocurvularin; desmethyl-lasiodiplodin; nematicidal activity

2017-04-13;接受日期2017-06-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560021)；農(nóng)業(yè)部948計(jì)劃項(xiàng)目(2016-X43)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)(2015DFR31060)；海南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(ZDYF2017020)資助。

張榮儒，碩士研究生，主要從事微生物防治植物病害研究。E-mail:zzru2010@126.com。*通信作者：劉 柱，教授，主要從事微生物農(nóng)藥研究。E-mail:zhuliu@hainu.edu.cn;徐玉泉，研究員，主要從事微生物次生代謝產(chǎn)物的研究。E-mail:xuyuquan@caas.cn

10.19586/j.2095-2341.2017.0026