鄭 威, 周迎紅, 劉金龍

1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)研究所, 武漢 430064; 2.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北 荊州 434025; 3.無(wú)錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫 214153; 4.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 湖北 恩施 445000

擬青霉A20140822發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素工藝的響應(yīng)面優(yōu)化研究

鄭 威1,2, 周迎紅3, 劉金龍4*

1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)研究所, 武漢 430064; 2.主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北 荊州 434025; 3.無(wú)錫商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫 214153; 4.湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 湖北 恩施 445000

用響應(yīng)面分析法研究?jī)?yōu)化擬青霉A20140822發(fā)酵蟲草素工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)找出影響發(fā)酵蟲草素得率的主要因素。并按照響應(yīng)面分析方法設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,分析得出影響蟲草素得率的主要因素的最佳參數(shù)。擬青霉在溫度21℃、時(shí)間38 h、維生素B1添加量0.08 g/L時(shí)，蟲草素含量最高達(dá)到1.465 g/L。擬青霉A20140822發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的量比已報(bào)道的擬青霉菌種高20%～50%,其發(fā)酵條件受溫度、時(shí)間、維生素B1添加量等因素影響。

擬青霉A20140822；發(fā)酵；蟲草素；響應(yīng)面分析

冬蟲夏草是我國(guó)特有的具有較高價(jià)值且被人們廣泛認(rèn)知的藥食兩用中藥，蟲草素是冬蟲夏草的主要有效成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、抗衰老和改善記憶等功能[1～6]。隨著溫室氣體排放的增加，世界氣候逐漸變暖，嚴(yán)寒環(huán)境區(qū)域日益縮小。再加上人類活動(dòng)使得自然環(huán)境受到了毀滅性的打擊，越來(lái)越多的原有環(huán)境發(fā)生了變遷或者破壞。這些都使得蟲草的生長(zhǎng)范圍正在逐年縮小，但另一方面面對(duì)市場(chǎng)對(duì)蟲草需求的日益增加，人們大肆進(jìn)行不計(jì)后果的采摘也使得野生蟲草供不應(yīng)求。

菌絲發(fā)酵的冬蟲夏草的主要成分和藥效與野生蟲草相似，有些成分含量甚至高于野生型,但其價(jià)格要低很多，對(duì)獲得單一有效成分的生產(chǎn)有很重要的意義。擬青霉是國(guó)家藥典認(rèn)可的藥食兩用菌，可用來(lái)生產(chǎn)藥品和保健品，藏蟲草是冬蟲夏草中品質(zhì)最好的品種。從藏蟲草中分離的擬青霉A20140822是一種新菌種，發(fā)酵液中有效成分含量高，本研究旨在優(yōu)化發(fā)酵工藝，從而為它的開發(fā)提供參考，以便形成更好的醫(yī)藥產(chǎn)品和保健功能品，提高人們的生活質(zhì)量，形成新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬青霉A20140822菌種：從西藏海拔4 500 m采得的冬蟲夏草中分離獲得。超凈工作臺(tái)SW-CJ-2FD(蘇州凈化)；恒溫?fù)u床HQL150B(中國(guó)科學(xué)院武漢儀器廠)；智能發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司)。葡萄糖、 硫酸二氫鉀、硫酸鎂、蛋白胨、 酵母浸膏、 氨基酸、維生素B1、蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品均為國(guó)藥化學(xué)試劑。

單因素實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配方：小米100 g，葡萄糖10 g，白糖10 g，磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.25 g，蛋白胨2 g，酵母浸膏1.5 g，氨基酸0.15 g，維生素B10.1 g，pH 6.0，加超純水定容至1 000 mL分瓶灌裝。

維生素B1添加量單因素培養(yǎng)基配方：培養(yǎng)基其他成分不變僅改變維生素的加入量。加入量從0～0.22 g/L每增加0.02 g/L設(shè)置1個(gè)濃度處理，共設(shè)置12個(gè)梯度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1冬蟲夏草菌的制備 取海拔4 000～5 000 m生長(zhǎng)的天然冬蟲夏草用泥土包裹好放置在4℃冰箱保存，分離前先用自來(lái)水沖洗5 min，75%酒精沖洗3 min，再用升汞處理4 min，無(wú)菌水沖洗3次后用滅菌后的手術(shù)刀將僵蟲和子座切開分別處理。仔細(xì)去除表皮后將中間白色菌絲分切成3～5 mm的小段。用滅菌后的鑷子將切分好的片段一半插到加有硫酸鏈霉素的分離培養(yǎng)基中。用封口膜將培養(yǎng)基封住，18℃黑暗培養(yǎng)7 d。

定期觀察，將生長(zhǎng)出的擬青霉A20140822挑到無(wú)菌水中稀釋成若干個(gè)梯度涂布在培養(yǎng)皿中。黑暗培養(yǎng)定期觀察，將單一的菌落再次轉(zhuǎn)接，直到分離出單一菌種。將分離到的單一菌種用試管斜面保藏后鏡檢。

1.2.2單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將擬青霉A20140822接入培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)待瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)大量白色菌絲球?yàn)橹埂?/p>

①培養(yǎng)時(shí)間因素實(shí)驗(yàn)。配制12瓶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每瓶100 mL，在超凈工作臺(tái)上接入10 mL種子培養(yǎng)液，選取26～48 h每隔2 h設(shè)置1個(gè)時(shí)間梯度在恒定條件下培養(yǎng)，設(shè)定罐壓0.04～0.05 MPa，罐溫20±2℃，pH 6.0,溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min。取出發(fā)酵液測(cè)定蟲草素含量。

②培養(yǎng)溫度因素實(shí)驗(yàn)。配制12瓶實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基，每瓶100 mL在超凈工作臺(tái)上接入10 mL種子培養(yǎng)液，分別在17～28℃之間每1℃設(shè)置1個(gè)溫度梯度在恒定條件下培養(yǎng)，設(shè)定罐壓0.04～0.05 MPa，pH 6.0,溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min，40 h后取出發(fā)酵液測(cè)定蟲草素含量。

③維生素B1添加量因素實(shí)驗(yàn)。配制不同維生素B1濃度(從0～0.22 g/L設(shè)置12個(gè)梯度)添加量培養(yǎng)基各100 mL在250 mL三角瓶中，設(shè)定罐壓0.04～0.05 MPa，罐溫20±2℃，pH 6.0,溶氧60%～100%，攪拌速度190 r/min，40 h后取出發(fā)酵液測(cè)定發(fā)酵液中蟲草素的含量。

1.2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，選取維生素B1添加量(X1)、溫度(X2)、發(fā)酵時(shí)間(X3)3個(gè)影響因子，蟲草素得率為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

采用SAS軟件對(duì)15組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，可以得到維生素B1添加量、溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟲草素得率的多元二次回歸方程。

1.2.4蟲草素檢測(cè) 將發(fā)酵產(chǎn)物55℃溫和烘干，粉碎，萬(wàn)分之一天平稱取0.250 0±0.000 1 g，放入帶蓋玻璃瓶中，放入超聲波清洗器中超聲20 min。再將其移入微波爐中火處理100 s，得到蟲草素待測(cè)樣品。本試驗(yàn)冬蟲夏草蟲草素含量檢測(cè)方法選用的濃度為1.8×10-4～12.6×10-4mol/L，蟲草素的濃度與吸光度基本保持線性關(guān)系。利用蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品在260 nm的最大吸收波長(zhǎng)下，得到蟲草素吸光度與蟲草素含量之間的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。再利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品的吸光度，代入回歸方程得到蟲草素含量[7]。

表1 BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 BOX-Behnken experimental design.

①蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定：精確稱取經(jīng)過(guò)烘干的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品置于500 mL容量瓶中，純化水定容，搖勻。分別取配制好的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.8×10-4mol/L、3.6×10-4mol/L、5.4×10-4mol/L、7.2×10-4mol/L、9.0×10-4mol/L、10.8×10-4mol/L、12.6×10-4mol/L 2.0 mL置于260 nm處測(cè)定吸光度值(以2.0 mL蒸餾水為空白)得到蟲草素濃度與吸光度的關(guān)系如圖1。得到回歸方程：Y=0.007 52X+0.191 57。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)蟲草素的吸光度回歸方程Fig.1 Absorbance regression equation of standard cordycepin.

②蟲草素含量測(cè)定：吸取樣品液2.0 mL(空白管為同樣處理的未發(fā)酵的培養(yǎng)基2.0 mL)調(diào)節(jié)溫度至室溫置于260 nm處測(cè)定吸光度。

③蟲草素含量的計(jì)算：將待測(cè)發(fā)酵液沉淀后取上清液，用純化水梯度稀釋到測(cè)得OD值在規(guī)定范圍內(nèi),然后用分光光度計(jì)測(cè)出待測(cè)品的OD值，將OD值代入回歸方程中，計(jì)算出蟲草素摩爾濃度。再代入下列公式計(jì)算：

蟲草素含量(g/L)=NMrX。

其中，N為稀釋倍數(shù)，Mr為蟲草素相對(duì)分子質(zhì)量251.24，X為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算出的蟲草素摩爾濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬青霉A20140822單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1發(fā)酵時(shí)間對(duì)蟲草素產(chǎn)量的影響 通過(guò)對(duì)擬青霉A20140822菌持續(xù)發(fā)酵，通過(guò)蟲草素的摩爾濃度的測(cè)定探究時(shí)間與蟲草素產(chǎn)量的關(guān)系。對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行非線性擬合得到圖2。如圖2所示，擬青霉A20140822菌隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，在32～44 h范圍內(nèi)蟲草素含量不斷上升，發(fā)酵時(shí)間超過(guò)44 h后蟲草素由于被細(xì)胞代謝，含量呈下降趨勢(shì)。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)擬青霉A20140822蟲草素產(chǎn)量影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of cordycepin by fermentation of P. varioti A20140822.

2.1.2溫度對(duì)產(chǎn)蟲草素產(chǎn)量的影響 選取17～28℃溫度條件下發(fā)酵40 h，探討溫度變量對(duì)擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液所產(chǎn)蟲草素含量效果的影響。對(duì)發(fā)酵后產(chǎn)物中的蟲草素摩爾濃度和溫度進(jìn)行非線性擬合。如圖3所示，在18～23℃范圍內(nèi)隨溫度提高，蟲草素含量不斷上升，在22～24℃范圍內(nèi)出現(xiàn)最大值，在23℃后產(chǎn)量逐漸下降。擬青霉A20140822菌最適溫度在20～25℃之間。

圖3 溫度對(duì)擬青霉A20140822發(fā)酵液產(chǎn)蟲草素效果的影響Fig.3 Effect of temperature on the production of cordycepin by fermentation of P. varioti A20140822.

2.1.3維生素B1添加量對(duì)蟲草素產(chǎn)量的影響 將擬青霉A20140822接入到維生素B1加入量因素培養(yǎng)基中在相同條件(20℃，40 h)通過(guò)測(cè)定蟲草素的摩爾濃度，分析維生素B1加入量對(duì)擬青霉A20140822發(fā)酵液蟲草素含量的影響。將上述檢測(cè)結(jié)果做非線性擬合得到圖4。

圖4 培養(yǎng)基中維生素B1添加量對(duì)擬青霉發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的影響Fig.4 Effects of vitamin B1 content in culture medium on the production of cordycepin by the fermentation of the P. varioti A20140822.

如圖4所示，隨著培養(yǎng)基中維生素B1添加量從0.02 g/L增加到0.12 g/L蟲草素的含量呈直線上升趨勢(shì),但超過(guò)0.12 g/L之后蟲草素含量又減少。維生素B1添加量對(duì)擬青霉A20140822發(fā)酵產(chǎn)蟲草素有影響，維生素B1添加量在(0.1±0.02)g/L時(shí)擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液蟲草素含量比較高。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

選取培養(yǎng)基維生素B1添加量(X1)、發(fā)酵溫度(X2)、發(fā)酵時(shí)間(X3)3個(gè)影響因子，蟲草素得率為響應(yīng)值，可得到試驗(yàn)結(jié)果如表3。表3結(jié)果表明，在發(fā)酵時(shí)間為38 h，發(fā)酵溫度為21℃，維生素B1添加量在0.1 g/L時(shí)，蟲草素得率最高為1.238 g/L。

表2 擬青霉A20140822響應(yīng)面發(fā)酵產(chǎn)蟲草素含量Table 2 Cordycepin content by the response surface fermentation of P. varioti A20140822.

運(yùn)用SAS軟件對(duì)15組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，可以得到維生素B1添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間對(duì)冬蟲夏草擬青霉發(fā)酵液蟲草素含量影響的多元二次回歸方程：

Y=0.283 000-0.177 375X1-0.200 125X2-0.147X3+0.255 375X12+0.440 875X22+0.148 625X32-0.116 250X1X2-0.078 000X1X3+0.010 500X2X3

表3 擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression analysis of P. varioti A20140822 fermentation producting cordycepin.

對(duì)回歸方程顯著性及3個(gè)單因素因子對(duì)擬青霉A20140822蟲草菌絲發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的影響進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析。結(jié)果(表4)表明，模型F為112.098 7，P<0.000 1，表明該模型極顯著；對(duì)模型進(jìn)行適合性檢驗(yàn)，P>0.05，未達(dá)到顯著水平，表明該模型是穩(wěn)定的，能較好地預(yù)測(cè)結(jié)果。

回歸模型中X1、X2、X3影響極顯著，且3個(gè)因素對(duì)蟲草素產(chǎn)量的影響大小順序?yàn)椋喊l(fā)酵溫度(X2)>維生素B1添加量(X1)>發(fā)酵時(shí)間(X3)。

交互項(xiàng)X1X2影響極顯著，X1X3影響顯著，X2X3影響不顯著，顯著順序?yàn)閄1X2>X1X3>X2X3。

二次項(xiàng)X12、X22、X32均表現(xiàn)有極顯著影響，3個(gè)二次項(xiàng)的顯著順序?yàn)閄22>X12>X32。

從響應(yīng)面圖5(彩圖見圖版二)可以看出響應(yīng)值與影響因素的關(guān)系。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圖形的焦點(diǎn)距離越遠(yuǎn)影響越明顯。3個(gè)交互項(xiàng)的響應(yīng)值對(duì)應(yīng)圖中的凹度和等高線圖焦點(diǎn)的重合率表明X1X2>X1X3>X2X3，與方差分析結(jié)果一致。

對(duì)X1、X2、X3各設(shè)置5個(gè)水平，即X1為-1(0.08 g/L)、-0.5(0.09 g/L)、0(0.10 g/L)、0.5(0.11 g/L)、1(0.12 g/L)，X2為-1(21℃)、-0.5(21.5℃)、0(22℃)、0.5(22.5℃)、1(23℃)，X2為-1(38 h)、-0.5(39 h)、0(40 h)、0.5(41 h)、1(42 h)，進(jìn)行3因素5水平設(shè)計(jì)，共25種組合，代入方程進(jìn)行檢驗(yàn)，得到不同組合蟲草素含量如表5。由表5可知，此時(shí)的最優(yōu)組合為-1、-1、-1，蟲草素含量為1.465 g/L，而3因素3水平設(shè)計(jì)的最優(yōu)組合為0、-1、-1，蟲草素含量為1.238 g/L，與3因素5水平設(shè)計(jì)時(shí)0、-1、-1組合的蟲草素含量為1.234 g/L只相差0.004 g/L，差異不顯著。說(shuō)明方程有很好的重現(xiàn)性，從而得出最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為發(fā)酵時(shí)間38 h，發(fā)酵溫度21℃，維生素B1添加量0.08 g/L。

3 討論

研究運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化擬青霉A20140822發(fā)酵工藝，經(jīng)試驗(yàn)優(yōu)化后的擬青霉A20140822發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的最佳工藝條件為：在發(fā)酵時(shí)間38 h條件下，擬青霉發(fā)酵溫度為21℃，維生素B1添加量0.08 g/L,其模型最優(yōu)產(chǎn)蟲草素達(dá)1.465 g/L。各因素對(duì)擬青霉A20 140822發(fā)酵生產(chǎn)蟲草素的影響分別為：發(fā)酵溫度>維生素B1添加量>發(fā)酵時(shí)間。

圖5 發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基維生素B1添加量對(duì)擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素含量影響的響應(yīng)面分析結(jié)果Fig.5 Response surface analysis of the effect of fermentation temperature, time and the amount of VB1 on cordycepin content.A:發(fā)酵時(shí)間40 h,維生素B1添加量和發(fā)酵溫度對(duì)擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量影響； B:發(fā)酵溫度22℃,維生素B1添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量影響；C：培養(yǎng)基維生素B1添加量0.1 g/L，溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)擬青霉A20140822菌絲發(fā)酵液中蟲草素產(chǎn)量影響。(彩圖見圖版二)

表4 擬青霉A20140822發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果Table 4 Response surface optimization analysis results of P. varioti A20140822 fermentation condition.

擬青霉A20140822蟲草菌是從藏蟲草中篩選出的一株新的國(guó)家有關(guān)部門鑒定保藏的菌株，也是藥典認(rèn)可的可生產(chǎn)藥品、飲食品的藥食兩用菌。本研究生產(chǎn)蟲草素的能力比已報(bào)道的擬青霉菌種高20%～50%。但試驗(yàn)只就發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、維生素B1添加量對(duì)擬青霉A20140822產(chǎn)蟲草素的影響進(jìn)行了研究，在今后應(yīng)對(duì)其他的發(fā)酵工藝參數(shù)，如培養(yǎng)基成分、接種量、搖瓶轉(zhuǎn)速、pH等因素進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)體系，滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，同時(shí)對(duì)菌絲體中其他有效成分的最大獲得量開展研究[8,9]。

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草中存在多種真菌并能競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)，并成功分離出多種真菌，如蝙蝠蛾被孢霉、蝙蝠蛾擬青霉、蟲草多毛孢、中國(guó)擬青霉、中國(guó)彎頸霉、中國(guó)被毛孢等[10～13]，蝙蝠蛾擬青霉是競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)較強(qiáng)的一種真菌，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體與冬蟲夏草的化學(xué)成分指紋譜極為相似[14]。如何利用這些真菌發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)菌絲體已成為現(xiàn)階段人們研究的重點(diǎn)。

[1] 丁向萍,馬 力,魏書堂,等.蟲草素誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡及對(duì)端粒酶活性影響的研究 [J]. 中華腫瘤防治雜志, 2008, 15(2): 109-113.

[2] 胡 敏,皮惠敏,鄭元梅.冬蟲夏草的化學(xué)成分及藥理作用[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2008,19(11)：2804-2806.

[3] Chen J L, Chen Y C, Yang S H,etal.. Immunological alterations in lupus-prone autoimmune(NZB/NZW) F1mice by mycelia Chinese medicinal fungus Codices silences-induced redistributions of peripheral mononuclear T lymphocytes[J].Clin. Exp. Med.,2009,9(4):277-284.

[4] 嚴(yán) 冬，梁舉春.冬蟲夏草藥理作用研究綜述[J]. 北方藥學(xué),2013,10(4):54-55.

[5] 胡燕琴，林 暉.冬蟲夏草制劑的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展[J]. 首都醫(yī)藥，2009，(24)：27.

[6] 黨和勤, 張繼國(guó). 蟲草素對(duì)東莨菪堿所致小鼠記憶障礙的影響[J].泰山醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 30(11): 818-819.

[7] 何建麗,彭 濤,朱愛玲,等.蟲草功效成分檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2014, 35(13):303-309.

[8] 胡清秀,寥超子,王 欣.我國(guó)冬蟲夏草及其資源保護(hù)、開發(fā)利用對(duì)策[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃,2005,26(5):43-47.

[9] 陸幼蘭.冬蟲夏草菌絲體的深層培養(yǎng)[J].廣州食品工業(yè)科技,2003,19(4)：12-15.

[10] 高 凌，李曉紅，趙建晴，等. MassARRAY單核苷酸多態(tài)性MALDI-TOF質(zhì)譜基因分型法檢測(cè)未成熟冬蟲夏草子座中多個(gè)冬蟲夏草菌突變基因型[J]. 北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011，43(2)：259-266.

[11] 高 凌，李曉紅，趙建晴，等.冬蟲夏草的成熟伴隨著冬蟲夏草子座中多個(gè)基因突變型冬蟲夏草菌表達(dá)的變化[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2012,44(3)：454-463.

[12] 姚藝桑,周妍嬌,高 凌,等.冬蟲夏草成熟過(guò)程中冬蟲夏草菌及其突變基因型在子座和僵蟲體中的差異表達(dá)[J].菌物研究，2011，9(1)：37-49，53.

[13] 朱佳石，趙家剛，高 凌，等.至少6個(gè)突變基因型冬蟲夏草菌在冬蟲夏草子座中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化[J].菌物研究，2012，10(2)：100-112.

[14] 朱佳石,郭英蘭，姚藝桑，等.冬蟲夏草成熟過(guò)程中中國(guó)被毛孢和蝙蝠蛾擬青霉DNA共存及競(jìng)爭(zhēng)增殖力、化學(xué)成分變化[J].菌物研究，2007，5(4)：214-224.

ResponseSurfaceOptimizationoftheFermentationProcessofCordycepinbyPaecilomycesvariotiA20140822

ZHENG Wei1,2, ZHOU Yinghong3, LIU Jinlong4*

1.InstituteofAgriculturalEconomicandTechnology,HubeiAcademyofAgriculturalScience,Wuhan430064,China; 2.HubeiCollaborativeInnovationCenterforGrainIndustry,HubeiJingzhou434025,China; 3.WuxiVocationalInstitueofCommerce,JiangsuWuxi214153,China; 4.CollegeofBiologicalScientificandTechnical,HubeiMinzuUniversity,HubeiEnshi445000,China

Response surface analysis method was used to study the optimization of the fermentation process of cordycepin byPaecilomycesvariotiA20140822. The main factors affecting the yield of fermented cordyceps were found out through single factor experiment. According to the response surface analysis method, we obtained the optimal parameters. The content of cordycepin was the highest 1.465 g/L at the vitamin B10.08 g/L, time 38 h and temperature 21℃. The fermentation condition of A20140822 was 20%～50% higher than that of the fungus. The fermentation conditions were affected by the factors such as temperature, time and vitamin B1content.

PaecilomycesvariotiA20140822; fermentation; cordycepin; response surface analysis

2017-10-03;接受日期2017-10-18

湖北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BBA178);湖北省富硒產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(XKJ201501-17;XKJ201501-20)資助。

鄭 威,研究員,博士,主要從事富硒技術(shù)研究及功能產(chǎn)品研發(fā)。E-mail:nkyzhengwei@163.com。*通信作者：劉金龍,高級(jí)實(shí)驗(yàn)師,主要從事富硒生物工程教學(xué)與研究。E-mail:liujl1618@163.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0146