葛金林，曾余豐，錢俊敏，金晨慈

麥角甾醇對LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的抗炎作用研究

葛金林1*，曾余豐1，錢俊敏2，金晨慈1

目的研究麥角甾醇對LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的抗炎作用研究。方法取50只雄性BABL/c小鼠隨機分為5組：空白對照組、模型組、地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇低劑量組(20 mg/kg)、麥角甾醇高劑量組(40 mg/kg)?？瞻讓φ战M和模型組按體積給予生理鹽水，地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇組(20、40 mg/kg)灌胃給予相應(yīng)藥物。給藥1 h后，除空白對照組，其余各組小鼠氣管滴注20 μg LPS。檢測小鼠肺干濕重比(W/D)，肺泡灌洗液(BALF)中超氧化物歧化酶(SOD)水平、丙二醛(MDA)含量，血清與肺泡灌洗液炎性細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平。取各組小鼠肺組織做HE染色，并檢測肺組織Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、NF-κBP65、p-IκBα、IκBα蛋白表達。結(jié)果麥角甾醇20、40 mg/kg能顯著提升LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠血清SOD水平，降低MDA含量；改善血清及肺泡灌洗液炎癥因子水平和肺組織病理學(xué)改變；降低肺組織Rho、ROCK1、ROCK2、p-NF-κBP65、p-IκBα蛋白表達。結(jié)論麥角甾醇對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠有保護作用，其作用可能與Rho/ROCK/NF-κB信號通路有關(guān)。

麥角甾醇；肺損傷；Rho/ROCK/NF-κB

0 引言

急性肺損傷是指各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致急性低氧性呼吸功能不全[1]。急性肺損傷的病理生理特征是肺容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)等[2]。急性肺損傷在臨床上是較為常見的急危重癥之一，主要病理生理學(xué)改變是炎癥反應(yīng)。如果控制不當(dāng)，急性肺損傷可能發(fā)展成為急性呼吸窘迫綜合征，引起多器官臟器功能衰竭[3]。因此，尋找治療急性肺損傷的藥物并研究其作用機制，改善患者的生存質(zhì)量，已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點。

麥角甾醇又稱為麥角固醇，是一種甾體類化合物。麥角甾醇是微生物細胞膜的重要組成部分，對確保細胞膜的完整性、膜結(jié)合酶的活性、膜的流動性、細胞活力及細胞物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔肹4]。本研究擬觀察麥角甾醇對急性肺損傷小鼠的保護作用。

Rho蛋白是小G蛋白超家族的亞家族成員，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20多種Rho家族成員。根據(jù)序列的同源程度和功能可分為RhoA、Racl、Cdc42及缺乏GTP酶活性等4類[5]。Rho的下游靶蛋白是ROCK，又稱Rho激酶。Rho激酶是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，又稱為Rho相關(guān)激酶，在缺血、炎癥、外傷等多種病理因素中起重要作用[6]。其參與細胞黏附、遷移和細胞骨架重構(gòu)、調(diào)劑中性粒細胞產(chǎn)生的活性氧等。研究表明，RhoA在炎癥應(yīng)答過程中起重要作用[7]。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的主要形式為p50、p65和IκBα。研究表明，NF-κB可以激活、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄下游炎癥因子表達。本研究探討了麥角甾醇對急性肺損傷的作用機制是否通過Rho/ROCK/NF-κB信號通路起作用。

1 材料與試劑

1.1 材料與試劑 麥角甾醇 (純度：97%)購自中國食品藥品檢定研究院。地塞米松(Dex)購自南京先聲藥業(yè)。脂多糖(LPS，大腸桿菌血清型0111∶B4，No.L-2630，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)、IL-1β、IL-6和TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒由南京凱基生物科技有限責(zé)任公司提供。MDA、SOD試劑盒由南京建成生物試劑有限公司提供。Rho、ROCK1、ROCK2、p-IκBα、IκBα、NF-κBp65、p-NF-κBp65抗體均由Cell Signaling Technology (Danvers，USA)公司提供。

1.2 動物 50只BALB/c小鼠(體重：20～22 g)由揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供。所有動物于室溫(22±1)℃，空氣濕度40%～50%，晝夜交替時間12 h條件下普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

2 方法

2.1 分組及給藥 取50只雄性BABL/c小鼠隨機分為5組：空白對照組、模型組、地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇低劑量組(20 mg/kg)、麥角甾醇高劑量組(40 mg/kg)?？瞻讓φ战M和模型組按體積給予生理鹽水，地塞米松組(2 mg/kg)、麥角甾醇組(20、40 mg/kg)灌胃給予相應(yīng)藥物。給藥1 h后，除空白對照組，其余各組小鼠氣管滴注20 μg LPS(溶于50 μL PBS)，空白對照組氣管內(nèi)滴注50 μL PBS。

2.2 肺泡灌洗液收集 給藥6 h后處死小鼠，抽取500 μL預(yù)冷的PBS (pH 7.2)，用注射器緩慢注入左肺并灌洗，回抽得到肺泡灌洗液(BALF)。抽取3次后，將肺泡灌洗液以1 500 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 肺干濕重比測定 將右側(cè)肺組織取出，分離食管和氣管，測量濕重；將其置于60 ℃烘箱內(nèi)48 h至恒重，測量干重，計算肺干濕重比值(干重/濕重×100%)。

2.4 組織病理學(xué)檢查 小鼠眼眶取血后處死，將肺組織固定于4%的中性福爾馬林溶液中過夜。將組織固定包埋于石蠟中，切成4 mm厚的切片。去石蠟，用蘇木素-伊紅染液染色(HE染色)，采用光學(xué)顯微鏡觀察肺損傷和肺部炎癥細胞的浸潤情況。

2.5 肺泡灌洗液中SOD、MDA含量測定 按照試劑盒說明書測定LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中SOD、MDA的含量。

2.6 血清與肺泡灌洗液中炎癥因子的測定 小鼠眼眶取血，4 500 r/min離心15 min后取上清液凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書檢測LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

2.7 Western blot分析 將肺組織剪碎，用RIPA裂解液進行提取總蛋白，12 000 r/min條件下離心15 min，收集上清后采用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣品置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中直至樣品到達分離膠的底部，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完畢后，將條帶浸入5%脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結(jié)束后將PVDF膜浸入一抗中于4 ℃孵育過夜。第2天棄一抗，用TBST洗4次后，加入第2抗體于搖床室溫孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后，棄抗體，取出PVDF膜用TBST清洗4次。使用凝膠成像系統(tǒng)進行曝光并用凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描條帶分析各條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠肺組織干濕重比的影響 如圖1所示，與空白對照組比較，模型組小鼠在給予LPS造模之后，肺干濕重比顯著增加。與模型組相比，麥角甾醇組肺干濕重比值降低。

3.2 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠肺泡灌洗液中MDA、SOD的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠注射LPS后，MDA含量增加，SOD活力降低。與模型組比較，麥角甾醇可以顯著降低MDA含量，提升SOD 活力。見圖2。

圖1 各組小鼠肺組織干濕重比比較

注：C.空白組，M.模型組，D.地塞米松2 mg/kg組，EL.麥角甾醇20 mg/kg組，EH.麥角甾醇40 mg/kg組*與M組比較，P<0.01；#與C組比較，P<0.01

圖2 各組小鼠肺泡灌洗液中MDA、SOD比較

注：C.空白組，M.模型組，D.地塞米松2 mg/kg組，EL.麥角甾醇20 mg/kg組，EH.麥角甾醇40 mg/kg組*與M組比較，P<0.01；#與C組比較，P<0.01

3.3 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響 如圖3所示，與空白對照組相比，模型組小鼠在注射LPS之后，肺組織可見明顯的炎性細胞浸潤。與模型組相比，麥角甾醇可以顯著減少炎性細胞浸潤，表現(xiàn)出對LPS誘導(dǎo)的肺損傷小鼠的保護作用。

3.4 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠血清與肺泡灌洗液中炎性細胞因子表達的影響 與空白對照組比較，模型組小鼠在注射LPS后，血清與肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性細胞因子含量顯著增加。與模型組比較，麥角甾醇降低血清與肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量，改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠炎性細胞因子的表達。見圖4。

3.5 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠Rho/ROCK/NF-κB信號通路表達的影響 采用Western blot檢測麥角甾醇對急性肺損傷小鼠相關(guān)蛋白表達的影響，以確定其相關(guān)作用機制。與空白對照組相比，模型組小鼠在給予LPS后，p-NF-κB、p-IκBα、Rho、ROCK1 ROCK2的表達上調(diào)，麥角甾醇治療后，以上蛋白的表達顯著下調(diào)。結(jié)果表明，麥角甾醇可能通過Rho/ROCK/NF-κB信號通路改善LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。見圖5。

圖3 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠肺組織病理的影響(200×)

圖4 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠血清與肺泡灌洗液中炎性細胞因子表達的影響

圖5 麥角甾醇對急性肺損傷小鼠Rho/ROCK/NF-κB信號通路表達的影響

4 討論

急性肺損傷是急性呼吸窘迫綜合征的早期階段，其病理特征為肺彌漫性損害、肺泡毛細血管通透性增加、肺泡內(nèi)水腫等[8-9]。

炎性細胞因子釋放引發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致急性肺損傷患者肺泡中毛細血管通透性增加的主要原因。中性粒細胞在其中發(fā)揮重要作用[10]。中性粒細胞是炎癥反應(yīng)過程中的主要細胞，激活后可以釋放IL-1β、IL-6、TNF-α，破壞毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞間的緊密連接，導(dǎo)致肺泡毛細血管通透性增加[11]。TNF-α由單核細胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)控功能。IL-1β是一種促炎細胞因子，參與組織水腫。IL-6具有免疫調(diào)節(jié)功能，可以增強免疫反應(yīng)[12]。本研究中，與空白對照組比較，模型組小鼠在給予LPS后，血清與肺泡灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α含量升高。與模型組相比，麥角甾醇可以顯著降低以上炎癥因子的表達，表明麥角甾醇對LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠有明顯的改善作用。

NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的過程中發(fā)揮重要作用[13]。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與NF-κB肺抑制性蛋白(IκB)結(jié)合成為非活性狀態(tài)，存在于胞漿中。在LPS的刺激下，NF-κB從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)入細胞核，從而啟動炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄[14-15]。ROCK是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由ROCKⅠ和 ROCKⅡ 2種異構(gòu)體組成，是Rho下游的靶效應(yīng)分子，與炎癥關(guān)系密切。Western blot 結(jié)果表明，麥角甾醇可以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其機制可能與Rho/ROCK/NF-κB信號通路相關(guān)。

綜上所述，麥角甾醇可以緩解LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，其機制可能與Rho/ROCK/NF-κB信號通路有關(guān)。

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Anti-inflammatoryeffectsofergosterolonLPS-inducedlunginjuryinmice

GE Jin-lin1*,ZENG Yu-feng1,QIAN Jun-min2,JIN Chen-ci1

(1.Department of Respiratory Medicine,Wenzhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital,Wenzhou 325000,China;2.Department of Respiratory Medicine,Yongjia People′s Hospital,Wenzhou 325100,China)

ObjectiveTo investigate the anti-inflammatory effect of ergosterin on lipopolysaccharide (LPS)-induced acute lung injury (ALI).MethodsTotally 50 BABL/c mice were divided into 5 groups randomly:control group,model group,dexamethasone group (2 mg/kg),ergosterin (20 mg/kg),ergosterin (40 mg/kg).The mice were given ergosterin or dexamethasone at 1 h before intratracheal instillation of LPS.The lung wet-to-dry weight (W/D) ratio,the level of super oxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in bronchoalveolar lavage fluid (BALF),and the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α),interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in BALF were detected.The protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65,NF-κBP65,p-IκBα and IκBα in lung tissue was analyzed.ResultsErgosterin of 20 mg/kg and 40 mg/kg could increase the level of SOD and decrease the content of MDA,and improve the levels of pro-inflammatory cytokines in serum and BALF and pathological changes.It could also decrease the protein expression of Rho,ROCK1,ROCK2,p-NF-κBP65 and p-IκBα in lung tissue.ConclusionErgosterin can ameliorate the LPS-induced acute lung injury in mice and its related mechanism might be related to inhibition of Rho/ROCK/NF-κB pathway.

Ergosterin;Lung injury;Rho/ROCK/NF-κB

2017-07-20

1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325000；2.永嘉縣人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江 溫州 325100

浙江省中醫(yī)藥科研基金項目(2015ZB111)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712003