劉麗芳，丁 凡，余金龍，余韓開宗

(四川省綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 綿陽 621000)

安縣魔芋組培快繁關鍵技術研究

劉麗芳，丁 凡，余金龍，余韓開宗

(四川省綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院，四川 綿陽 621000)

安縣魔芋是國家地理標志保護產(chǎn)品，但因其自然繁殖效率低，用種量大等原因，該優(yōu)良品種在綿陽市魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展過程中，存在種芋嚴重供應不足的問題。為促進安縣魔芋在我市的健康發(fā)展，研究了其組培快繁技術。通過對安縣花魔芋組培過程中的外植體消毒、增殖培養(yǎng)、微型芋誘導等關鍵技術進行研究，探索出較為成熟的安縣魔芋組培快繁技術。

安縣魔芋；外植體；增殖；微型芋

綿陽市安州區(qū)(前稱安縣)是全國知名的魔芋主產(chǎn)區(qū)、魔芋粗加工及魔芋精粉集散地、全國八大“魔芋種植基地重點縣”之一，被評為“中國魔芋之鄉(xiāng)”。魔芋精粉加工和銷量占全國銷售總量的25%～30%，在國內(nèi)外市場享有盛譽。“安縣魔芋”是我國農(nóng)產(chǎn)品地理標志保護農(nóng)產(chǎn)品，其干物質及葡甘聚糖明顯高于其他栽培區(qū)域。安州區(qū)魔芋加工業(yè)發(fā)達，但每年約60%加工原料魔芋干片依賴外地調(diào)運，本地原料供應不足，嚴重制約了當?shù)啬в蠹庸I(yè)進一步擴大發(fā)展。安縣迫切需要發(fā)展魔芋種植基地，但本地種源不足又是魔芋種植基地發(fā)展緩慢的主要原因。本文通過研究安縣花魔芋組培快繁的各關鍵步驟，探索建立其高效快繁技術，為該品種的種芋生產(chǎn)提供又一有效途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

30～50g魔芋球莖，采自安縣千佛山鎮(zhèn)金溪村，由千佛山魔芋專業(yè)種植合作社提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理 魔芋球莖洗凈后，置于0.5‰農(nóng)用鏈霉素+2%百菌清殺菌劑中浸泡1h，放入人工氣候箱催芽，溫度25℃，濕度85%。取葉芽長至1cm左右大小，即可沿芽基本切下，剝?nèi)?～2層芽鞘，切掉芽頂部用作外植體。設計3種不同處理方式，研究外植體消毒的最佳辦法(表1)。初代培養(yǎng)基為MS+1.5×10-66-BA+0.4×10-6NAA+3%白糖+0.1%活性炭，暗培養(yǎng)7d后光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度25℃，濕度80%，光照強度為2000Lx，光周期16h/8h。

1.2.2 愈傷組織誘導及增殖 初代培養(yǎng)無污染、存活的外植體轉入增殖培養(yǎng)基，進行增殖培養(yǎng)。為提高增殖效率，研究經(jīng)過幾次擴繁后獲得的無菌苗的葉柄、芽鞘及愈傷組織為增殖材料，在4種不同激素及活性炭配比的增殖培養(yǎng)基上的長勢(表2)。葉柄、芽鞘接種方式均為正方向豎插，葉柄長度為每段1cm左右。

1.2.3 微型芋誘導 微型芋誘導材料為擴繁30d后，誘導出大量不定芽的愈傷組織。采用4種不同微型芋誘導培養(yǎng)基，以3種不同方式誘導。a：在培養(yǎng)瓶中倒入微型芋誘導液體培養(yǎng)基；b：將愈傷組織整塊轉入固體微型芋培養(yǎng)基；c：將愈傷組織切小后(0.5cm×0.5cm)轉入固體微型芋培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基配方為固體培養(yǎng)基配方去掉卡拉膠，其他組分不變(表3)。

表1 外植體消毒方法

表2 愈傷組織誘導及增殖培養(yǎng)基的組分

表3 微型芋誘導固體培養(yǎng)基的組分

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

外植體接種30d后統(tǒng)計存活率、污染率、褐化率；增殖培養(yǎng)45d后統(tǒng)計葉鞘、葉柄誘導率、褐化率；增殖培養(yǎng)30d后統(tǒng)計愈傷組織增殖系數(shù)、褐化率；微型芋誘導培養(yǎng)60d后統(tǒng)計微型芋誘導個數(shù)及增重系數(shù)。

2 結果與分析

2.1 不同外植體處理方式的效果

外植體消毒7d后即可看部分外植體明顯污染，此后污染陸續(xù)發(fā)生，30d后基本穩(wěn)定了。接種14d后部分外植體明顯死亡。從統(tǒng)計結果看(表4)，傳統(tǒng)處理方式A對外植體傷害較好，存活率100%，但不能有效防止污染，有效存活率僅23%。外植體經(jīng)抗生素浸泡處理，加大升汞濃度及處理時間的B處理，外植植體存活率及污染率均最低，但有效存活率最高，達84%。甲醛-高錳酸鉀熏蒸的處理C其效果也較好，有效存活率為81%，與處理B相近。

表4 不同外植體處理方式的效果

注：外植體未死亡為存活；未死亡、未污染為有效存活。

2.2 不同增殖培養(yǎng)的效果

愈傷組織培養(yǎng)30d后可看到愈傷組織膨大，多代培養(yǎng)的愈傷組織大部分會在45d左右形成完整植株或大量叢生芽。45d后健壯芽鞘均會誘導成大量叢生芽，葉柄會形成致密愈傷組織，部分會在愈傷組織上形成不定芽。從結果可以看出(表5)，不添加活性炭的3、4號培養(yǎng)基的誘導率、增殖率均高于添加活性炭的1、2號培養(yǎng)基，褐化率低于1、2號培養(yǎng)基(芽鞘不褐化)。愈傷組織誘導結果表明，芽鞘在3、4號培養(yǎng)基上誘導率均在90%以上；葉柄也有較高誘導率，最高達85%。未誘導出叢生芽的芽鞘本身較為老化，同時帶葉片的頂部葉柄也基本沒有誘導出愈傷組織。3、4號培養(yǎng)基上各增殖材料褐化率均較低，最高的也僅6%。愈傷組織增殖結果表明，在4號培養(yǎng)基上獲得最高增殖系數(shù)，達4.42。

2.3 不同方式微型芋誘導的效果

接種60d后，總體上3種不同的微型芋誘導技術對微型芋的誘導率依次為b>a>c。誘導效果最好的培養(yǎng)基為采用b誘導技術，其單塊愈傷組織的微型芋誘導個數(shù)高達2.73。3種微型芋誘導方式其增重系數(shù)為1.32～2.74，均低于愈傷組織增殖培養(yǎng)(表6)。a方法倒入微型芋誘導培養(yǎng)液后，主要誘導不定芽形成完整植株，但植株的基部膨大緩慢，同時愈傷組織稍有增殖。b方法形成完整植株的相比a少，但基部膨大相對迅速，部分愈傷組織隨著微型芋的形成發(fā)生萎蔫。c方法愈傷組織增殖緩慢，僅少量形成微型芋。

表5 不同增殖培養(yǎng)的效果

表6 不同方式誘導微型芋的效果

3 小結與討論

安縣花魔芋組培快繁，其外植體消毒采用洗衣粉清洗后，用0.5‰農(nóng)用鏈霉素+2%百菌清殺菌劑浸泡1h，再0.2‰升汞處理25min，無菌水沖洗3次后用75%酒精處理20s，再用無菌水沖洗5次的處理效果最好，甲醛-高錳酸鉀熏蒸[1]的方法效果與之相當。兩種方法相比，抗生素處理方式時間較長，甲醛-高錳酸鉀方法時間短，但會產(chǎn)生有毒的甲醛氣體。研究者可結合實驗室條件做相應選擇。其次外植體的選擇及去芽鞘也十分重要，采用經(jīng)抗生素處理的球莖室內(nèi)催芽，可減少外植體攜帶的病菌；剝?nèi)ネ獠垦壳什⑷ロ斢欣跉⒕鷦┑臐B入及誘導芽基部側芽的萌發(fā)。

增殖培養(yǎng)，本文嘗試了用葉柄及芽鞘做增殖材料，兩者均在MS+2×10-66-BA+0.1-0.5×10-6NAA+3%蔗糖+3.5g/L卡拉膠的培養(yǎng)基上獲得較高誘導率，若除去老化芽鞘及帶葉的葉柄段，其誘導率均可達95%左右。愈傷組織在MS+2×10-66-BA+0.5×10-6NAA+3%蔗糖+3.5g/L卡拉膠的培養(yǎng)基上增殖效果最好?；в笱壳始叭~柄做外植的的相關研究較多，均證明其有較高的愈傷組織誘導率[2-4]，本文篩選出MS+2×10-66-BA+0.5×10-6NAA+3%蔗糖+3.5g/L卡拉膠為芽鞘、葉柄及愈傷組織的通用培養(yǎng)基。因多代增殖的愈傷組織培養(yǎng)45d左右后會形成大量的叢生芽[5]，平均單個愈傷組織有芽鞘1～2個，3～4片葉，每片葉的葉柄可切成約4段。如此在擴繁愈傷組織同時誘導芽鞘及葉柄，可將增殖系數(shù)由4～5提高至17～23，大大提高增殖效率。此外本文采用卡拉膠做增殖培養(yǎng)基支撐體，愈傷組織培養(yǎng)20d左右培養(yǎng)基水化，研究表明液體培養(yǎng)條件下愈傷組織增殖效率提高。同時液體培養(yǎng)能有效抑制組培過程的褐化現(xiàn)象[6-8]，本研究未添加活性炭的增殖培養(yǎng)基也極少發(fā)生褐化現(xiàn)象，故卡拉膠比常用的瓊脂更適宜魔芋增殖培養(yǎng)。

微型芋誘導采用將培養(yǎng)30d，含大量不定芽的愈傷組織為原始材料，轉至MS+0.5×10-66-BA+0.1×10-6PP333+6%蔗糖+3.5g/L卡拉膠的固體微型芋誘導培養(yǎng)基上誘導效果最佳。相比該微型芋誘導方法，將微型芋誘導營養(yǎng)液倒入經(jīng)30d增殖的愈傷組織培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)生長誘導微型芋的方式更為便捷。筆者在馬鈴薯上成功運用該技術進行微型薯的誘導，在魔芋的微型芋誘導上效果卻不夠理想，今后可對該技術進一步研究。魔芋微型芋與愈傷組織粘連不易分割[8]，且通過移栽發(fā)現(xiàn)，帶芽點的愈傷組織大棚移栽后，可以形成完整植株，故微型芋應連帶愈傷組織進行移栽。

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2017-09-19

四川省科技富民強縣專項行動計劃；綿陽市農(nóng)業(yè)科學研究院創(chuàng)新基金。

劉麗芳(1983-)，女，農(nóng)藝師，碩士，研究方向為薯類作物良種繁育及栽培技術研究。E-mail: llf_716@126.com。