河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

田小超 郭秋紅△ 孫冠嬰△ 何偉亮 張 凱△(石家莊 050000)

實(shí)驗(yàn)研究

葶藶生脈方對(duì)充血性心力衰竭大鼠心肌RhoA/ROCK信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)*

河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

田小超郭秋紅△孫冠嬰△何偉亮張凱△(石家莊050000)

目的：研究葶藶生脈方對(duì)充血性心力衰竭(CHF)大鼠左心室肌RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達(dá)的影響，探討其防治心肌重塑的作用機(jī)制。方法：將健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組，假手術(shù)組、模型組、葶藶生脈方低劑量組、高劑量組和對(duì)照組。除假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈不結(jié)扎外，其余4組采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作CHF大鼠模型。5組均于手術(shù)后4周開始灌胃、腹腔注射給藥(水)，連續(xù)8周。停藥(水)24 h后迅速股動(dòng)脈取血及左心室組織剝離，采用放射免疫分析法檢測血漿AngⅡ含量，Western Blotting技術(shù)測定RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ含量，心肌組織RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達(dá)均明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.01)，葶藶生脈方低劑量組、高劑量組大鼠血漿AngⅡ含量降低(P<0.01)。結(jié)論：葶藶生脈方通過調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號(hào)通路，降低RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達(dá)，改善心肌重塑，從而有效緩解大鼠CHF。

充血性心力衰竭；葶藶生脈方；邢月朋；心氣虛；益氣溫陽；活血利水；RhoA/ROCK信號(hào)通路

充血性心力衰竭(CHF)是多種心臟疾病引起心肌結(jié)構(gòu)和功能改變的最終轉(zhuǎn)歸，具有較高的發(fā)病率及死亡率。葶藶生脈方為全國名老中醫(yī)邢月朋根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)出的治療氣虛血瘀、陽虛水停型CHF的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過臨床驗(yàn)證能有效緩解患者癥狀，改善生活質(zhì)量，減少住院時(shí)間。在筆者以往的研究中發(fā)現(xiàn)，葶藶生脈方能改善壓力超負(fù)荷大鼠血流動(dòng)力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)，降低心肌細(xì)胞凋亡率，減輕心肌纖維化，有效防止心室重塑。[1-2]此研究擬通過觀察葶藶生脈方對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)，進(jìn)一步探討其防治心室重塑的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體質(zhì)量170～200 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥品與試劑 葶藶生脈方由葶藶子、紅參、麥冬、五味子、桂枝、茯苓、川芎等藥物組成，實(shí)驗(yàn)時(shí)分別配制成所需濃度的水煎液；鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業(yè)股份有限公司；Ang II放免分析藥盒購自北京解放軍總醫(yī)院放免所； RhoA一抗、ROCK1一抗、p-MYPT-1一抗均購自英國Abcam公司，c-fos一抗購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 CHF大鼠模型制備： 參考Anversea方法，[3]將60只大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在雙腎動(dòng)脈上方0.5 cm處分離腹主動(dòng)脈，除假手術(shù)組10只大鼠只分離腹主動(dòng)脈，不結(jié)扎外，其余50只沿腹主動(dòng)脈平行放置一直徑0.7 mm 7號(hào)一次性注射器針頭，用0號(hào)手術(shù)絲線將腹主動(dòng)脈和針頭結(jié)扎在一起，然后抽出針頭，使腹主動(dòng)脈縮窄60%～70%。術(shù)后抗生素處理，觀察4周。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及標(biāo)本制備： 除假手術(shù)組外，將行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)4周后存活大鼠40只隨機(jī)分為4組，每組10只：即模型組、葶藶生脈方高、低劑量組、對(duì)照組。假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水灌胃，生理鹽水腹腔注射；葶藶生脈方組灌胃給藥(低劑量15 g/kg，高劑量30 g/kg)，生理鹽水腹腔注射；對(duì)照組腹腔注射法舒地爾10 mg/kg，蒸餾水灌胃。各組每次灌胃量按1 mL/100 g計(jì)算，腹腔注射量按5 mL/kg計(jì)算，每日1次，共給藥8周。末次給藥24 h后，用20%烏拉坦(6.5 mg/kg)腹腔注射麻醉。股動(dòng)脈取血后迅速開胸摘取心臟，切取左心室用錫箔分裝，置于液氮速凍后，保存于-80℃冰箱中備用。

1.3.3 放射免疫分析法檢測血漿AngⅡ含量：將股動(dòng)脈血置于肝素、EDTA抗凝試管中，4℃ 2 500 r/min分離血漿，采用放射免疫分析法，嚴(yán)格按試劑盒說明書檢測。

1.3.4 Western blotting 檢測RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達(dá)：常規(guī)提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白(上樣量為50 μg總蛋白)，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗抗體RhoA(1∶1 500)，ROCK1(1∶500)，p-MYPT-1(1∶500)，c-fos(1∶500)4℃過夜。去一抗，PBST沖洗4次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG二抗，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL試劑顯影定影。應(yīng)用凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)條帶的灰度分析，以β-actin為內(nèi)參，所得比值表示目標(biāo)蛋白相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿AngⅡ含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，葶藶生脈方高、低劑量組血漿AngⅡ含量顯著降低(P<0.01)，對(duì)照組含量降低，但差異無顯著性；葶藶生脈方高、低劑量組血漿AngⅡ含量低于對(duì)照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血漿AngⅡ含量比較

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠左室心肌組織RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)相對(duì)含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)量下降(P<0.01)；對(duì)照組ROCK1蛋白表達(dá)量低于葶藶生脈方高、低劑量組(P<0.05)。詳見表2。

組別nRhoAROCK1假手術(shù)組100.221±0.0470.098±0.021模型組100.612±0.093*0.401±0.069*低劑量組100.378±0.075#0.267±0.055#△高劑量組100.351±0.050#0.258±0.050#△對(duì)照組100.422±0.071#0.195±0.066#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.05

2.3 各組大鼠左室心肌組織p-MYPT-1、c-fos蛋白表達(dá)相對(duì)含量比較 與假手術(shù)組比較，模型組p-MYPT-1、c-fos蛋白表達(dá)量升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組p-MYPT-1、c-fos蛋白表達(dá)量下降(P<0.01)。各給藥組之間比較，差異無顯著性(P>0.05)。詳見表3。

組別np-MYPT-1c-fos假手術(shù)組100.372±0.0670.332±0.050模型組100.821±0.101*0.720±0.089*低劑量組100.523±0.098#0.467±0.067#高劑量組100.497±0.071#0.442±0.053#對(duì)照組100.472±0.082#0.501±0.073#

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3 討論

心室重塑包括左室壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分和細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變，是導(dǎo)致心功能逐漸惡化的關(guān)鍵因素。眾多研究表明低分子量GTP酶RhoA以及其下游效應(yīng)因子Rho激酶(ROCK1)通路介導(dǎo)的各種細(xì)胞功能參與了心肌重塑的發(fā)生發(fā)展各個(gè)階段。[4]刺激因子AngⅡ等通過與 Gq偶聯(lián)，增加RhoA的表達(dá)及向細(xì)胞膜的移位，表明RhoA蛋白是心臟腎素-血管緊張素系統(tǒng)( RAS)激活的下游靶點(diǎn)。[5]隨著CHF時(shí)RAS系統(tǒng)的激活，大鼠心肌RhoA表達(dá)逐漸增高, 伴隨發(fā)病時(shí)間延長, 心肌重塑增加, 心力衰竭加重，其增高就越明顯。因此RhoA 過度增加是促進(jìn)CHF發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制之一，RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將成為CHF的一個(gè)很有前景的新的治療干預(yù)靶點(diǎn)。研究證實(shí)，使用ROCK抑制劑可改善AngⅡ、壓力超負(fù)荷大鼠等所引起的心肌肥厚，[6]法舒地爾是目前臨床上唯一應(yīng)用的ROCK抑制劑，通過特異性抑制ROCK能降低心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡，從而改善心肌重構(gòu)。[7]

眾多研究表明，原癌基因c-fos、c-jun、c-myc等參與了心肌重構(gòu)過程中的心肌纖維化、左心室肥厚，c-fos 基因作為一個(gè)通用轉(zhuǎn)錄因子，與各種細(xì)胞外信號(hào)通過多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致心肌重構(gòu)有關(guān)。有研究顯示心力衰竭大鼠心肌組織原癌基因c-fos表達(dá)增加，抑制ROCK能夠降低c-fos的表達(dá)，同時(shí)在心肌細(xì)胞激活RhoA可引起c-fos基因表達(dá)上調(diào)，[8]表明原癌基因c-fos參與RhoA/ROCK信號(hào)通路誘導(dǎo)心肌損傷。

全國名老中醫(yī)邢月朋根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為CHF的病機(jī)首推心氣虛，心氣虛為始發(fā)之根本，氣虛易及陽，導(dǎo)致陽氣虧虛，在此基礎(chǔ)上又繼發(fā)瘀血、水飲等病理產(chǎn)物?！堵孕牧λソ咧形麽t(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》亦指出虛、瘀、水是CHF的核心病機(jī)。[9]葶藶生脈方由紅參、黃芪、麥冬、五味子、葶藶子、桂枝、茯苓、白術(shù)、豬苓、澤瀉、丹參、紅花、川芎組成，具有益氣溫陽，活血利水之效。葶藶生脈方能抑制CHF大鼠RAS系統(tǒng)的過度激活，調(diào)控心肌組織CVF和TGF-β1的表達(dá)，減輕心肌纖維化，逆轉(zhuǎn)心室重塑，呈現(xiàn)出多途徑、多靶點(diǎn)的治療作用。[1-2]

本研究與以往結(jié)果相同，葶藶生脈方可有效降低壓力超負(fù)荷大鼠血漿AngⅡ含量。同時(shí)研究還表明葶藶生脈方和法舒地爾均可下調(diào)CHF大鼠心肌組織RhoA、ROCK1蛋白表達(dá)，在抑制ROCK1蛋白表達(dá)方面法舒地爾干預(yù)效應(yīng)強(qiáng)于葶藶生脈方。Rho激酶對(duì)肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶的調(diào)節(jié)主要是通過磷酸化MYPT-1來完成，兩藥均可降低RhoA/ROCK信號(hào)通道的重要下游通道MYPT-1磷酸化水平，以降低ROCK的活化程度。在本次實(shí)驗(yàn)中，壓力超負(fù)荷大鼠心肌組織c-fos蛋白表達(dá)上調(diào)，用法舒地爾干預(yù)治療后，c-fos蛋白表達(dá)下降，表明法舒地爾抗心肌肥大與其抑制c-fos蛋白表達(dá)有關(guān)，葶藶生脈方亦能有效降低c-fos蛋白表達(dá)。綜上所述，葶藶生脈方對(duì)RhoA/ROCK信號(hào)通路的抑制可能是其逆轉(zhuǎn)心室重塑，防治CHF的作用機(jī)制之一。

[1] 翟卷平，郭秋紅，王卓，等. 葶藶生脈方對(duì)心衰大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，25(2)：5-6

[2] 郭秋紅，劉敬坡，趙淑明，等. 葶藶生脈方對(duì)心衰大鼠RAAS及心肌組織AT-1mRNA表達(dá)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(10)：1 654-1 656

[3] Anversea P，Hagopian M，Alder V. Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy[J]. Lab Invest，1973,29(3):282

[4] Kobayashi N，Takeshima H，F(xiàn)ukushima H，et al. Cardioprotective effects of pitavastatin on cardiac performance and remodeling in failing rathearts[J]. Am J Hypertens，2009，22 ( 2) : 176-182

[5] Morissette MR, Sah VP, Glembotski CC, et al. The Rho effector, PKN, regulates ANF gene transcription in cardiomyocytes through a serum response element[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278(6):H 1 769-1 774

[6] Phrommintikul A, Tran L, Kompa A, et al. Effects of a rho kinase inhibitor on pressure overload induced cardiac hypertrophy and associated diastolic dysfunction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008, 294(4): 1 804-1 814

[7] Ueyama T, Sakoda T, Kawashima S, et al. Activated Rho A stimulates c-fos gene expression in myocardial cells[J].Circ Res,1997, 81: 672-678

[8] Shimokawa H, Rashid M. Development of Rho-kinase inhibitors for cardiovascular medicine[J]. Trends Pharmacol Sci, 2007, 28(6):296-302

[9] 李金根，徐浩. 慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)：亮點(diǎn)與解讀[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2016，36(2)：142-145

InterventionEffectsofTingliShengmaiFangonSignalPathwayofMyocardialRhoA/ROCKinRatswithCongestiveHeartFailure

TIANXiao-chaoGUOQiu-hongSUNGuan-yingHEWei-liangZHANGKai(Shijiazhuang 050000)

Second Hospital of Hebei Medical University

Objective: to study the effect ofTingliShengmaiFangon left ventricular muscle RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein expression in rats with congestive heart failure (CHF), and to investigate its mechanism of prevention and treatment of myocardial remodeling. Methods: Healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups: sham operation group, model group,TingliShengmaiFanglow dose group, high dose group and control group. Except for the dissection of abdominal aorta without ligature in the sham operation group, the abdominal aorta coarctation method was employed to make the CHF rat model of the other 4 groups. The 5 groups were treated with intragastric administration and intraperitoneal injection (water) for 8 weeks at the 4th week after the operation. After withdrawal (water) for 24 h, blood was collected and left ventricular tissue was rapidly removed from femoral artery. Plasma Ang II content was detected by radioimmunoassay. The expression of RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein was detected by Western Blotting. Results: Compared with sham operation group, the level of Ang II and the expression of RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein in myocardial tissue of model group increased significantly (P< 0.01). Compared with the model group, RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein expression of each administration group were significantly decreased (P< 0.01), plasma Ang II levels ofTingliShengmaiFanglow and high dose groups were reduced (P< 0.01). Conclusion:TingliShengmaiFangcan reduce the expression of p-MYPT-1 and c-fos protein and improve myocardial remodeling through regulating the pathway of RhoA/ROCK, RhoA, ROCK1, thus effectively alleviate the rat CHF.

congestive heart failure;TingliShengmaiFang;XINGYue-peng; heart-qi deficiency; ：YiqiWenyang(benefiting qi and warming yang);HuoxueLishui(activating blood and excreting water); RhoA/ROCK signaling pathway

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0001-03

* 河北省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目：No.2016048

△ 河北中醫(yī)學(xué)院(石家莊050200)

張凱，男，碩士，副教授。

(2017-09-23 收稿)