王殿冰 崔宗強(qiáng) 張先恩**

1 中國科學(xué)院生物物理研究所 生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101

2 中國科學(xué)院武漢病毒研究所 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430071

分子生物傳感器與細(xì)胞內(nèi)分子影像*

王殿冰1崔宗強(qiáng)2張先恩1**

1 中國科學(xué)院生物物理研究所 生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100101

2 中國科學(xué)院武漢病毒研究所 病毒學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430071

分子生物傳感器是由生物大分子通過基因重組或DNA合成所構(gòu)成的傳感器，能夠?qū)崟r、可視化探測活細(xì)胞及活體內(nèi)關(guān)鍵分子事件。目前研究熱度高、應(yīng)用廣的分子生物傳感器包括分子信標(biāo)（MB）、共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（熒光共振能量轉(zhuǎn)移和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）和分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)（如雙分子熒光互補(bǔ)、三分子熒光互補(bǔ)等）。文章介紹了這幾類分子生物傳感器的原理和特點(diǎn)，重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了它們在活細(xì)胞分子影像學(xué)中的運(yùn)用，如：研究細(xì)胞內(nèi)蛋白之間的相互作用，探索生物大分子在細(xì)胞中的定位、運(yùn)動和動力學(xué)等。此外，還討論了分子生物傳感器的局限性和面臨的挑戰(zhàn)，并展望了未來發(fā)展方向?！把垡姙閷?shí)”，分子生物傳感器在這方面發(fā)揮獨(dú)特的作用，它使我們前所未有地深入到細(xì)胞內(nèi)部去觀察生物分子事件乃至生物學(xué)過程，從而解答更多的生物學(xué)難題。

分子生物傳感器，細(xì)胞影像，分子信標(biāo)，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移，雙分子熒光互補(bǔ)

DOI 10.16418/j.issn.1000-3045.2017.12.004

活細(xì)胞及活體內(nèi)生理和病理過程中關(guān)鍵分子事件的實(shí)時、可視化探測對理解基本生物學(xué)過程、闡釋疾病發(fā)生機(jī)制等具有重要意義。臨床上，疾病的診斷及精準(zhǔn)治療也越發(fā)依賴影像學(xué)手段。分子生物傳感器是一種通過產(chǎn)生可視、可定量信號來指示生物物質(zhì)或生物事件發(fā)生及存在的生物分子系統(tǒng)，在活細(xì)胞或者活體內(nèi)能夠?qū)崟r動態(tài)示蹤生物分子之間的相互作用、生物大分子的定位和運(yùn)動、生理環(huán)境的變化以及一些重要生化反應(yīng)等。近 20 年的研究充分表明分子生物傳感器是分子事件“眼見為實(shí)”的強(qiáng)有力工具。本文將聚焦其中研究熱度較高的分子信標(biāo)（molecular beacons，MB）、共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移）和分子熒光互補(bǔ)系統(tǒng)（如雙分子熒光互補(bǔ)、三分子熒光互補(bǔ)等），重點(diǎn)闡述這幾種分子生物傳感器的原理、特點(diǎn)、活細(xì)胞中的應(yīng)用，探討可能面臨的挑戰(zhàn)及未來發(fā)展方向等。

1 分子信標(biāo)

1.1 分子信標(biāo)原理

分子信標(biāo)是由 Tyagi 和 Kramer[1]于 1996 年根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理首次設(shè)計(jì)的一種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的寡核苷酸熒光探針，亦稱發(fā)夾探針。經(jīng)典的分子信標(biāo)通常為 25—35 個核苷酸，包括環(huán)形區(qū)（Loop）、莖干區(qū)（Stem）及其所連接的熒光分子和淬滅分子（圖 1）。其中，環(huán)形區(qū)由 15—25 個核苷酸組成，可特異性結(jié)合靶分子序列。莖干區(qū)是 5—7 個互補(bǔ)堿基對，可在分子信標(biāo)與靶分子結(jié)合過程中發(fā)生可逆性解離，用于維持分子特殊形狀。熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)則分別位于莖干區(qū)的兩個末端[2]。當(dāng)無目標(biāo)序列存在時，分子信標(biāo)呈現(xiàn)自由狀態(tài)，莖干區(qū)互補(bǔ)堿基發(fā)生結(jié)合，促使分子信標(biāo)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此時，熒光分子和淬滅分子距離最為接近（約 6—10 nm），促發(fā)熒光共振能量轉(zhuǎn)移，即：熒光分子發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收，并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全淬滅。相反，當(dāng)存在目標(biāo)序列時，分子信標(biāo)的環(huán)形區(qū)與靶分子發(fā)生雜交，莖干中的互補(bǔ)區(qū)打開，由于熒光分子遠(yuǎn)離淬滅分子，分子信標(biāo)的熒光近乎100%恢復(fù)，其熒光強(qiáng)度與溶液中靶分子濃度呈正相關(guān)。

1.2 分子信標(biāo)應(yīng)用

分子信標(biāo)具有高靈敏度、高特異性、無須除去冗余等優(yōu)點(diǎn)。檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）過程中的擴(kuò)增產(chǎn)物是分子信標(biāo)問世的初衷。如今，早非局限于此。研究者通過改造經(jīng)典的分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)、發(fā)展多種熒光分子和淬滅分子、偶聯(lián)納米材料（如金納米粒子/石墨烯、碳納米管等）等，已成功構(gòu)建出各種具有優(yōu)越性能的新型分子信標(biāo)探針，并將其廣泛應(yīng)用于基因診斷、核酸檢測、分子示蹤等多個領(lǐng)域。本文主要聚焦分子信標(biāo)在活細(xì)胞內(nèi)分子影像中的應(yīng)用。

（1）分子信標(biāo)在活細(xì)胞內(nèi)示蹤 mRNA 的研究最為豐富。1998 年，Sokol 等[3]首次實(shí)時示蹤了 RNA-DNA 雜交，在熒光顯微鏡下檢測到原癌基因 vav 的 10 個 mRNA分子，即 0.1 ag（1 ag = 1×10–18g）的分子信標(biāo)所產(chǎn)生的雜交信號。隨后，Bratu 等[4]開辟了利用分子信標(biāo)在活細(xì)胞中研究 mRNA 定位、轉(zhuǎn)運(yùn)的先河。該團(tuán)隊(duì)在黑腹果蠅卵母細(xì)胞中觀察了天然 mRNA 的運(yùn)動，并發(fā)現(xiàn) mRNA 3′端非翻譯區(qū)的遺傳操作或細(xì)胞內(nèi)微管蛋白網(wǎng)絡(luò)的化學(xué)擾動可以明顯改變 mRNA 的分布。Vargas 等[5]則通過分子信標(biāo)追蹤活細(xì)胞中 mRNA 分子，進(jìn)一步對 mRNA- 蛋白復(fù)合物從轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)到核孔的轉(zhuǎn)運(yùn)行為進(jìn)行了可視化研究，提示其轉(zhuǎn)運(yùn)過程依賴于酶促反應(yīng)。筆者團(tuán)隊(duì)利用分子信標(biāo)技術(shù)率先建立了一種在活的寄主細(xì)胞內(nèi)病毒核酸可視化的方法，在熒光顯微鏡下可直觀地看到脊髓灰質(zhì)炎病毒的正鏈 RNA 和甲型流感病毒 mRNA 的動態(tài)行為，同時結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)手段，探討了病毒核酸轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[6,7]。

圖1 分子信標(biāo)工作原理改編自文獻(xiàn)[1]

（2）分子信標(biāo)還較為普遍地用于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、ATP 等分子的檢測與示蹤。這主要通過分子信標(biāo)與適配子形成的適配子信標(biāo)（aptamer beacon）來完成。Yamamoto 等[8]首次證明了將目標(biāo)物的適配子結(jié)合位點(diǎn)插入分子信標(biāo)中的可能性，構(gòu)建了靶向 HIV 病毒 Tat 蛋白的高親和力適配子信標(biāo)。與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)相比，這些信標(biāo)與目標(biāo)物序列的匹配數(shù)目減少了一半（8 個堿基）。筆者團(tuán)隊(duì)利用相同策略，構(gòu)建了特異識別 HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶的適配體分子信標(biāo)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中 HIV 逆轉(zhuǎn)錄酶的可視化[9]。Zhang 等[10]構(gòu)建了 ATP 的分子信標(biāo)檢測系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在白血病細(xì)胞 K562 和乳腺癌細(xì)胞 4T1 中 ATP 的檢測，體外檢測下線低至（1.1—3.2）×10?7mol/L。Tan 等[11]和 Liu 等[12]分別將氧化石墨烯作為 ATP 分子信標(biāo)的淬滅分子，獲得了更加穩(wěn)定、特異的適配子信標(biāo)，前者可以半定量檢測活細(xì)胞內(nèi) ATP，后者可響應(yīng) 5 mmol/L Ca2+誘導(dǎo)的 ATP 升高。

目前，針對性發(fā)展多功能分子信標(biāo)，在單細(xì)胞、單分子水平示蹤關(guān)鍵分子事件的研究工作已經(jīng)萌芽。例如，Li 等[13]設(shè)計(jì)了一種雙功能分子信標(biāo)，能夠同時檢測并抑制斑馬魚中的 microRNA。Chen 等[14]利用分子信標(biāo)最小工程化①即只需要極少的分子工程改造地點(diǎn)亮單分子 RNA，通過成像技術(shù)深入研究了單細(xì)胞非編碼 RNA（lncRNA）的動力學(xué)和定位。這些方向可能成為分子信標(biāo)在細(xì)胞成像領(lǐng)域應(yīng)用中的主流。

2 共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是利用能量轉(zhuǎn)移原理和基因操縱技術(shù)構(gòu)建的分子傳感體系，主要包括熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）和生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（bioluminescent resonance energy transfer，BRET）。

2.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

2.1.1 原理

FRET 是 1948 年由 F?rster[15]提出的一種基于能量轉(zhuǎn)移來測量分子間距離的技術(shù)。其基本原理是當(dāng)供體的熒光發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊，并且供體和受體的距離合適時（一般小于 10 nm），就會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移。如圖 2 所示，當(dāng)以適當(dāng)頻率的激發(fā)光照射供體時，供體會產(chǎn)生振蕩偶極子并與相鄰受體的偶極子產(chǎn)生共振。供體熒光團(tuán)的能量由于偶極子之間的相互作用非放射性地轉(zhuǎn)移到受體熒光團(tuán)?？傮w而言，產(chǎn)生FRET現(xiàn)象需要同時具備兩個條件：（1）供體分子具有較高的量子產(chǎn)率，其發(fā)射光光譜與受體分子的激發(fā)光光譜有效重疊；（2）供體和受體分子都處于被激發(fā)狀態(tài)，兩者之間距離在1—10 nm之間[16]。

2.1.2 特點(diǎn)

在生物學(xué)研究領(lǐng)域，F(xiàn)RET 技術(shù)是研究生物大分子間相互作用，特別是在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的有力工具。FRET 供、受體主要是熒光蛋白、有機(jī)熒光分子、無機(jī)納米熒光材料等，其發(fā)生需要外界光源激發(fā)熒光供體。青色熒光蛋白（CFP）和黃色熒光蛋白（YFP）是最常用的一對供受體。由于 FRET 嚴(yán)格依賴空間距離（1—10 nm），且大多數(shù)生物分子介于該尺寸之間，因此，F(xiàn)RET 是一把丈量分子空間距離的光學(xué)“分子尺”，可以解決生物學(xué)中諸多難題，如蛋白質(zhì)動力學(xué)、蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等。有別于經(jīng)典的分子發(fā)射光譜分析法，F(xiàn)RET 最大優(yōu)點(diǎn)是，該技術(shù)利用信號比值而非信號強(qiáng)度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，消除了取樣誤差而造成的信號間差異。近年來，由于新型熒光材料的出現(xiàn)、光學(xué)技術(shù)的進(jìn)步以及顯微成像工具的發(fā)展，F(xiàn)RET 技術(shù)在空間分辨率、檢測靈敏度等方面有了極大的提升，目前已實(shí)現(xiàn)單分子 FRET（SmFRET）[17]。

圖2 FRET 技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間相互作用A和B是一對相互作用的蛋白

2.1.3 應(yīng)用

FRET 在活細(xì)胞中的應(yīng)用非常之多，即利用兩個蛋白分子之間相互作用的空間信息以回答分子運(yùn)動、蛋白構(gòu)象、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等相關(guān)生物學(xué)問題。技術(shù)上，主要通過顯微鏡，利用受體漂白、導(dǎo)致的供體熒光增強(qiáng)、供體熒光漂白、受體熒光壽命增長、供-受體熒光強(qiáng)度比率法等多種手段來檢測 FRET 現(xiàn)象[18]，在此介紹部分代表性研究。

（1）活細(xì)胞內(nèi)生理狀態(tài)下的離子檢測是 FRET 技術(shù)較為經(jīng)典的應(yīng)用。例如，Myawaki 等[19]發(fā)展了一種由CFP、YFP、鈣調(diào)蛋白和鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽 M13 組成的活細(xì)胞鈣離子指示劑。其原理是，細(xì)胞里的 Ca2+促進(jìn)鈣調(diào)蛋白與 M13 結(jié)合，進(jìn)而增加了熒光蛋白之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移，因此可通過檢測 FRET 現(xiàn)象和數(shù)據(jù)校正，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞器中鈣離子的監(jiān)測與定量。無獨(dú)有偶，Zhang 等[20]利用 FRET 探針對活細(xì)胞中 Hg2+進(jìn)行了高靈敏檢測。另外，針對活細(xì)胞中 ATP、pH 值等重要生理參數(shù)，均有巧妙的 FRET 示蹤體系被相繼報道[21-23]。

（2）FRET無疑是研究蛋白質(zhì)互作的最好手段之一。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用涉及生命體中眾多生理過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，在細(xì)胞活動中扮演關(guān)鍵性角色。利用 FRET 技術(shù)檢測蛋白質(zhì)互作的策略通常是利用基因操縱，將兩個目標(biāo)蛋白分別偶聯(lián)一個供體或受體，并在細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)。在特定時空及生理?xiàng)l件下，如果存在互作，供體和受體會相互靠近產(chǎn)生 FRET 現(xiàn)象，反之則無。利用這一策略，細(xì)胞中多種蛋白之間的互作已被鑒定和示蹤。例如，高遷移率族蛋白 1（HMGB1）、Toll 樣受體（TLR）與晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）之間的相互作用[24]；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中表皮生長因子受體（EGFR）與和其結(jié)合蛋白 Grb2 之間的互作[25]；基質(zhì)相互作用分子 1（STIM1）之間的寡聚化及其易位、靶向等[26]。

除此之外，F(xiàn)RET 也普遍用于活細(xì)胞中 RNA 檢測、蛋白質(zhì)動力學(xué)等相關(guān)研究[27-29]。

2.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移

BRET 于 1999 年問世，與 FRET 基本原理相似，有異曲同工之妙[30]。BRET 體系中的供體主要是熒光素酶（Luc）。其中，海腎熒光素酶（Rluc）以腔腸素（Coelenterazine）為底物，螢火蟲熒光素酶（Fluc）以D-Luciferin 和 ATP 為底物，海螢熒光素酶（Cluc）則以海螢熒光素為底物，這些均是 BRET 常用供體。如圖 3 所示，這些底物及其衍生物會被相應(yīng)的熒光素酶催化并氧化發(fā)光。由于 A-B 分子的相互作用，供受體相互靠近。當(dāng)兩者距離 1—10 nm 時，BRET 現(xiàn)象產(chǎn)生，受體發(fā)光。底物飽和狀態(tài)下，受體熒光強(qiáng)度與酶濃度呈正相關(guān)。較 FRET 比，由于 BRET 無須外界光源激發(fā)供體，因此可避免強(qiáng)光源導(dǎo)致的光漂白、光吸收、組織損傷等現(xiàn)象，同時能夠降低因生物體內(nèi)自發(fā)熒光產(chǎn)生的背景信號[31]。

圖3 BRET 工作原理圖與A蛋白融合表達(dá)的熒光素酶催化其底物氧化發(fā)光，經(jīng)A-B蛋白之間相互作用后，供體熒光素酶與受體相互靠近，發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移，受體產(chǎn)生熒光

在活細(xì)胞影像的應(yīng)用方面，BRET 和 FRET 大致相同，如蛋白質(zhì)相互作用、ATP 檢測、蛋白質(zhì)活性測定等[32-35]。值得一提的是，在富含血細(xì)胞或血紅色素的組織及活體成像中，由于生物體內(nèi)光吸收、自發(fā)熒光的減少，使 BRET 在信噪比方面具有明顯優(yōu)勢[36]。

3 分子互補(bǔ)系統(tǒng)

分子互補(bǔ)系統(tǒng)是利用蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)構(gòu)建的分子傳感體系。本文著重闡述的是以熒光蛋白為信號元件的分子互補(bǔ)系統(tǒng)，包括雙分子熒光互補(bǔ)（bimolecular fluorescence complementation, BiFC）、三分子熒光互補(bǔ)（trimolecular fluorescence complementation，TriFC）等。

3.1 雙分子熒光互補(bǔ)

3.1.1 原理

BiFC 起源于蛋白質(zhì)片段互補(bǔ)技術(shù)，由 Ghosh 等[37]于 2000 年首次報道。如圖 4a 所示[38]，熒光蛋白在特定區(qū)域（通常是 loop 區(qū)）通過基因剪接形成兩個非熒光片段，稱為 N 片段和 C 片段。N、C 兩個片段通過 Linker 肽分別與一對相互作用的靶蛋白融合表達(dá)。由于靶蛋白對之間的相互作用，熒光蛋白 N 片段和 C 片段會緊密靠近，形成空間互補(bǔ)，進(jìn)而發(fā)生分子重建恢復(fù)構(gòu)象，并在合適的激發(fā)波長下產(chǎn)生熒光。反之，若靶蛋白之間不存在相互作用，則無熒光產(chǎn)生。

3.1.2 特點(diǎn)

BiFC 可應(yīng)用于體內(nèi)和體外，具有高靈敏、低噪聲等特點(diǎn)。BiFC 分子元件預(yù)先通過基因操縱導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)，無須外源添加即可直接利用熒光觀測活細(xì)胞或活體中生物分子的相互作用及其空間位置信息，因此避免了外源物質(zhì)對細(xì)胞的干擾和觀察的失真。與 FRET 和 BRET技術(shù)相比，BiFC 不用復(fù)雜的數(shù)據(jù)處理，常規(guī)熒光顯微鏡即可滿足。利用不同顏色的熒光互補(bǔ)系統(tǒng)，還可以在活細(xì)胞內(nèi)同時檢測多個蛋白的相互作用。鑒于這些特點(diǎn)，BiFC 被廣泛用于生物分子相互作用的研究，特別是細(xì)胞內(nèi)之間、細(xì)胞與環(huán)境物質(zhì)之間的相互作用。

圖4 BiFC和TriFC工作原理[38]（a）BiFC工作原理。熒光蛋白的N、C 兩個片段分別與靶蛋白A、B融合表達(dá)。由于A-B之間相互作用，熒光蛋白 N 片段和 C 片段緊密靠近，形成空間互補(bǔ)，產(chǎn)生熒光。（b）TriFC工作原理。熒光蛋白的 C 片段通過已知蛋白質(zhì)（A'）和 RNA（D）之間的相互作用，附著于報告 mRNA。由于B'蛋白與報告基因 mRNA 中的靶序列（RNA ligand）相互作用，N 和 C 兩片段相互靠近，恢復(fù)熒光蛋白構(gòu)象，產(chǎn)生熒光

目前所報道的 BiFC 系統(tǒng)通常不可逆、即結(jié)合重構(gòu)后很難再被打開。這個特點(diǎn)使得 BiFC 靈敏度很高，可檢測KD接近 1 mmol/L 的弱相互作用，但也阻礙了 BiFC 監(jiān)測蛋白質(zhì)相互作用的動態(tài)變化。為此，Tchekanda 等[39]利用基因改造的近紅外熒光蛋白突變單體 IFP1.4 發(fā)展了可逆的 BiFC 系統(tǒng)，進(jìn)一步擴(kuò)展了 BiFC 技術(shù)的應(yīng)用。

3.1.3 應(yīng)用

BiFC 常用于研究蛋白質(zhì)寡聚化（protein oligomerization）。其中，α- 突觸核蛋白（α-synuclein）的錯誤折疊——寡聚化和纖維化被認(rèn)為是帕金森和其他相關(guān)神經(jīng)疾病發(fā)生和發(fā)展的核心事件。Outeiro 等[40]通過 BiFC 直觀地觀察了突觸核蛋白在活細(xì)胞中的寡聚化，并發(fā)現(xiàn)蛋白寡聚化導(dǎo)致的細(xì)胞毒性增加可通過 Hsp70 來緩解。除此之外，G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）的寡聚化是又一重要研究領(lǐng)域。GPCRs 及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及諸多疾病，其寡聚化在調(diào)節(jié)受體藥理學(xué)和功能中具有重要作用。目前大約 30%—40% 藥物的細(xì)胞靶標(biāo)針對 GPCRs 而設(shè)計(jì)[41,42]。在該領(lǐng)域，有大量基于 BiFC 的研究與發(fā)現(xiàn)，包括 GPCR 二聚化[43]和二聚化的抑制[44]、腺苷 A2A 受體的分布和其在質(zhì)膜上的組裝[45,46]、利用 GPCR 二聚體成像研究神經(jīng)肽 Y Y1/Y5 受體異二聚體的藥理學(xué)等[47]。Cirulela 和 Vilardaga[48]更是詳細(xì)總結(jié)了 BiFC 在 GPCR 研究中的應(yīng)用。因此，BiFC 不僅是示蹤蛋白寡聚化的重要工具，更是尋找相關(guān)疾病治療靶標(biāo)和藥物的有效手段。

BiFC 也廣泛用于研究病毒與宿主之間的相互作用。這些研究對于理解病毒的生命周期和致病機(jī)制具有重要意義。例如，Hemerka 等[49]利用 BiFC 揭示了流感病毒聚合酶復(fù)合物 PA 與 PB2 亞基之間前所未知的相互作用，并對 PA-PB2 二元復(fù)合物的亞細(xì)胞定位與進(jìn)核進(jìn)行了詳細(xì)分析，其研究思路為進(jìn)一步探索 PA-PB2 互作與甲型流感病毒聚合酶活性、病毒復(fù)制的生物相關(guān)性提供了一個框架。目前，利用 BiFC 對人類病毒的研究還涉及 Epstein-Barr 病毒潛伏膜蛋白 1 的表征[50]、基于 Beclin1-Bcl2 復(fù)合物解離的自噬抑制劑藥物篩選[51]、HIV 病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白 Vpr 分子之間的互作等[52]。

3.2 分子互補(bǔ)系統(tǒng)的發(fā)展

3.2.1 遠(yuǎn)紅外和近紅外BiFC

在哺乳動物中存在細(xì)胞成像的近紅外（NIR）光學(xué)窗口（650—900 nm），以避免生物體內(nèi)水、血紅蛋白等分子對光的吸收[53,54]。為了解決這個問題，筆者團(tuán)隊(duì)利用mCherry（λex/λem= 587 nm/610 nm）、mNeptune（λex/λem=600 nm/650 nm）等熒光蛋白開發(fā)了系列長波長熒光分子互補(bǔ)系統(tǒng)[55,56]。另外，為了更好地實(shí)現(xiàn)深部組織成像，我們打破利用 GFP-like 熒光蛋白構(gòu)建 BiFC 這一常規(guī)，創(chuàng)新性的發(fā)展了以細(xì)菌光敏色素 iRFP 為基礎(chǔ)的近紅外 BiFC 系統(tǒng)（λex/λem= 690 nm/713 nm）。該工作為生理?xiàng)l件下研究蛋白質(zhì)相互作用提供了強(qiáng)有力工具，同時也為活細(xì)胞中的藥物評價提供了新策略[57]。

3.2.2 三分子互補(bǔ)系統(tǒng)

鑒于細(xì)胞內(nèi)未知的蛋白質(zhì) -RNA 之間互作，基于BiFC 建立的 TriFC 系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。如圖 4b 所示，在 TriFC 系統(tǒng)中，熒光蛋白的 C 片段通過已知蛋白質(zhì)（A′）和 RNA（D）之間的相互作用，附著于報告 mRNA。N 片段與 RNA -結(jié)合蛋白 B′融合表達(dá)。如果 RNA 結(jié)合蛋白與報告基因 mRNA 中的靶序列相互作用，則 N 和 C 兩片段緊密接近，恢復(fù)熒光蛋白構(gòu)象產(chǎn)生熒光[58]。TriFC 不僅可用于鑒定 RNA- 蛋白質(zhì)相互作用，還可分析活細(xì)胞中 RNA- 蛋白質(zhì)相互作用的定位和動力學(xué)。大量研究已驗(yàn)證該方法的實(shí)用性[59-61]。其中，筆者團(tuán)隊(duì)利用 TriFC 重點(diǎn)研究了流感病毒和 HIV 病毒 mRNA 與宿主蛋白之間的相互作用，并闡釋了相關(guān)生物學(xué)機(jī)制[55,62]。

最近，筆者團(tuán)隊(duì)還發(fā)展了三片段熒光互補(bǔ)系統(tǒng)（three-fragment fluorescence complementation，TFFC），用于蛋白三聚體的成像研究。我們把具有光轉(zhuǎn)換和光激活特性的熒光蛋白 mIrisFP 拆分為 3 個片段，結(jié)合超分辨成像，在單分子水平示蹤了活細(xì)胞中 G 蛋白三聚體亞基間的相互作用[63]。除此之外，在熒光蛋白第 10 個和第 11 個 β-strand 之間“切割形成的分子互補(bǔ)系統(tǒng)”（split fluorescent proteins complementation）也被用于活細(xì)胞可視化研究，如蛋白質(zhì)的定位、胞漿肽的輸送等[64-66]。

4 結(jié)語與展望

近 20 年來，上述以熒光為信號的分子生物傳感技術(shù)進(jìn)展迅速，大量相關(guān)研究論文被發(fā)表，涵蓋了材料、化學(xué)、物理、生物醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)等多個學(xué)科。從活細(xì)胞層面的應(yīng)用態(tài)勢來看，利用多色標(biāo)記，結(jié)合超分辨成像，在單細(xì)胞、單分子水平實(shí)時動態(tài)觀察多個關(guān)鍵分子事件將成為主流。但是，這些分子生物傳感器在組織、器官和活體的深層次應(yīng)用仍然面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。提高信噪比、避免生物物質(zhì)光吸收、允許長時示蹤都還是難題。亟待創(chuàng)造生物相容性好、亮度高、抗淬滅熒光探針，提出超高靈敏傳感新體系，改進(jìn)成像數(shù)據(jù)算法，也需要進(jìn)一步推動光學(xué)技術(shù)、成像工具的發(fā)展等。隨著技術(shù)進(jìn)步，分子生物傳感器將使我們前所未有地實(shí)時觀察獲取生命過程深層次信息，從而回答一系列重要的生命科學(xué)基本問題，并將拓展到臨床應(yīng)用，為人類健康服務(wù)。

1 Tyagi S, Kramer F R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology, 1996, 14: 303-308.

2 Tyagi S, Kramer F R. Molecular beacons in diagnostics. F1000 Medicine Reports, 2012, 4: 10.

3 Sokol D L, Zhang X, Lu P, et al. Real time detection of DNA·RNA hybridization in living cells. PNAS, 1998, 95: 11538-11543.

4 Bratu D P, Cha B J, Mhlanga M M, et al. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. PNAS, 2003,100: 13308-13313.

5 Vargas D Y, Raj A, Marras S A E, et al. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. PNAS, 2005, 102: 17008-17013.

6 Wang W, Cui Z Q, Han H, et al. Imaging and characterizing influenza A virus mRNA transport in living cells. Nucleic Acids Research, 2008, 36: 4913-4928.

7 Cui Z Q, Zhang Z P, Zhang X E, et al. Visualizing the dynamic behavior of poliovirus plus-strand RNA in living host cells.Nucleic Acids Research, 2005, 33: 3245-3252.

8 Yamamoto R, Baba T, Kumar P K R. Molecular beacon aptamer fluoresces in the presence of Tat protein of HIV-1. Genes to Cells,2010; 5: 389-396.

9 Liang Y, Zhang Z P, Wei H P, et al. Aptamer beacons for visualization of endogenous protein HIV-1 reverse transcriptase in living cells. Biosensors & Bioelectronics, 2011, 28: 270-276.

10 Zhang S S, Yan Y M, Bi S. Design of molecular beacons as signaling probes for adenosine triphosphate detection in cancer cells based on chemiluminescence resonance energy transfer.Analytical Chemistry, 2009, 81: 8695-8701.

11 Tan X H, Chen T, Xiong X L, et al. Semiquantification of ATP in live cells using nonspecific desorption of DNA from graphene oxide as the internal reference. Analytical Chemistry, 2012, 84: 8622-8627.

12 Liu Z B, Chen S S, Liu B W, et al. Intracellular detection of ATP using an aptamer beacon covalently linked to graphene oxide resisting nonspecific probe displacement. Analytical Chemistry,2014, 86: 12229-12235.

13 Li W M, Chan C M, Miller A L, et al. Dual functional roles of molecular beacon as a MicroRNA detector and inhibitor. Journal of Biological Chemistry, 2017, 292: 3568-3580.

14 Chen M M, Ma Z, Wu X T, et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports,2017, 7: 1550.

15 F?rster T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annals in Physics, 1948, 2: 55-75.

16 Wu P G, Brand L. Resonance energy transfer: methods and applications. Analytical Biochemistry, 1994, 218: 1-13.

17 Jares-Erijman E A, Jovin T M. FRET imaging. Nature Biotechnology, 2003, 21: 1387-1395.

18 Wouters F S, Verveer P J, Bastiaens P I H. Imaging biochemistry inside cells. Trends in Cell Biology, 2001, 11: 203-211.

19 Miyawaki A, Llopis J, Heim R, et al. Fluorescent indicators for Ca2+based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature,1997, 388: 882-887.

20 Zhang X L, Xiao Y, Qian X H. A Ratiometric fluorescent probe based on FRET for imaging Hg2+ions in living cells. Angewandte Chemie International Edition, 2008, 47: 8025-8029.

21 Modi S, Swetha M G, Goswami D, et al. A DNA nanomachine that maps spatial and temporal pH changes inside living cells. Nature Nanotechnology, 2009, 4: 325-330.

22 Imamura H, Nhat K P H, Togawa H, et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. PNAS, 2009, 106:15651-15656.

23 Dennis A M, Rhee W J, Sotto D, et al. Quantum dot-fluorescent protein FRET probes for sensing intracellular pH. ACS Nano,2012, 6: 2917-2924.

24 Park J S, Gamboni-Robertson F, He Q B, et al. High mobility group box 1 protein interacts with multiple Toll-like receptors.American Journal of Physiology - Cell Physiology, 2006, 290:C917-C924.

25 Sorkin A, McClure M, Huang F T, et al. Interaction of EGF receptor and Grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Current Biology,2000, 10: 1395-1398.

26 Liou J, Fivaz M, Inoue T, et al. Live-cell imaging reveals sequential oligomerization and local plasma membrane targeting of stromal interaction molecule 1 after Ca2+store depletion. PNAS,2007, 104: 9301-9306.

27 Santangelo P J, Nix B, Tsourkas A, et al. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research, 2004, 32.

28 He L, Lu D Q, Liang H, et al. Fluorescence resonance energy transfer-based DNA tetrahedron nanotweezer for highly reliable detection of tumor-related mRNA in living cells. ACS Nano, 2017,11: 4060-4066.

29 Ma Y Q, Pandzic E, Nicovich P R, et al. An intermolecular FRET sensor detects the dynamics of T cell receptor clustering. Nature Communications, 2017, 8: 15100.

30 Xu Y, Piston D W, Johnson C H. A bioluminescence resonance energy transfer (BRET) system: Application to interacting circadian clock proteins. PNAS, 1999, 96: 151-156.

31 Scott D, Dikici E, Ensor M, et al. Bioluminescence and its impact on bioanalysis. Annual Review of Analytical Chemistry, 2011, 4:297-319.

32 Pfleger K D G, Seeber R M, Eidne K A. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) for the real-time detection of protein-protein interactions. Nature Protocols, 2006, 1: 337-345.

33 Xia Z Y, Rao J H. Biosensing and imaging based on bioluminescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology, 2009, 20: 37-44.

34 den Hamer A, Dierickx P, Arts R, et al. Bright bioluminescent BRET sensor proteins for measuring intracellular caspase activity.ACS Sensors, 2017, 2: 729-734.

35 Yoshida T, Kakizuka A, Imamura H. BTeam, a novel BRET-based biosensor for the accurate quantification of ATP concentration within living cells. Scientific Reports, 2016, 6: 39618.

36 Dragulescu-Andrasi A, Chan C T, De A, et al. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects. PNAS, 2011,108: 12060-12065.

37 Ghosh I, And A D H, Regan L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: application to the green fluorescent protein.Journal of the American Chemical Society, 2000, 122: 5658-5659.38 Zhang X E, Cui Z, Wang D. Sensing of biomolecular interactions using fluorescence complementing systems in living cells. Biosens Bioelectron, 2016, 76: 243-250.

39 Tchekanda E, Sivanesan D, Michnick S W. An infrared reporter to detect spatiotemporal dynamics of protein-protein interactions.Nature Methods, 2014, 11: 641.

40 Outeiro T F, Putcha P, Tetzlaff J E, et al. Correction: formation of toxic oligomeric α-synuclein species in living cells. PLoS One,2008, 3: e1867.

41 Bosch D E, Siderovski D P. G protein signaling in the parasite Entamoeba histolytica. Experimental & Molecular Medicine,2013, 45: e15.

42 Overington J P, Al-Lazikani B, Hopkins A L. How many drug targets are there? Nature Reviews Drug Discovery, 5: 993-996.

43 Kosel D, Heiker J T, Juhl C, et al. Dimerization of adiponectin receptor 1 is inhibited by adiponectin. Journal of Cell Science, 2010, 123: 1320-1328.

44 Ejendal K F, Conley J M, Hu C D, et al. Bimolecular fluorescence complementation analysis of G protein-coupled receptor dimerization in living cells. Methods in Enzymology, 2013, 521:259-279.

45 Gandia J, Galino J, Amaral O B, et al. Detection of higher-order G protein-coupled receptor oligomers by a combined BRET-BiFC technique. FEBS Letters, 2008, 582: 2979-2984.

46 Vidi P A, Chemel B R, Hu C D, et al. Ligand-dependent oligomerization of dopamine D(2) and adenosine A(2A) receptors in living neuronal cells. Molecular Pharmacology, 2008, 74: 544.

47 Kilpatrick L E, Humphrys L J, Holliday N D. A G protein coupled receptor dimer imaging assay reveals selectively modified pharmacology of neuropeptide Y Y1/Y5 receptor heterodimers.Molecular Pharmacology, 2015, 87: 718-732.

48 Ciruela F, Vilardaga J P. Lighting up multiprotein complexes:lessons from GPCR oligomerization. Trends in Biotechnology,2010, 28: 407-415.

49 Hemerka J N, Wang D, Weng Y, et al. Detection and characterization of influenza A virus PA. Journal of Virology,2009, 83: 3944.

50 Talaty P, Emery A, Everly D N. Characterization of the latent membrane protein 1 signaling complex of Epstein-Barr virus in the membrane of mammalian cells with bimolecular fluorescence complementation. Virology Journal, 2011, 8: 1-15.

51 Dai J P, Zhao X F, Zeng J, et al. Drug screening for autophagy inhibitors based on the dissociation of Beclin1-Bcl2 complex using BiFC technique and mechanism of eugenol on anti-influenza A virus activity. PLoS One, 2013, 8: e61026.

52 Venkatachari N J, Walker L A, Tastan O, et al. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr: oligomerization is an essential feature for its incorporation into virus particles. Virology Journal,2010, 7: 1-11.

53 Weissleder R. A clearer vision for in vivo imaging. Nature Biotechnology, 2001, 19: 316.

54 Weissleder R, Ntziachristos V. Shedding light onto live molecular targets. Nature Medicine, 2003, 9: 123-128.

55 Han Y, Wang S, Zhang Z, et al. In vivo imaging of protein–protein and RNA-protein interactions using novel far-red fluorescence complementation systems. Nucleic Acids Research, 2014, 42:e103.

56 Fan J Y, Cui Z Q, Wei H P, et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 367: 47-53.

57 Chen M, Li W, Zhang Z, et al. Novel near-infrared BiFC systems from a bacterial phytochrome for imaging protein interactions and drug evaluation under physiological conditions. Biomaterials,2015, 48: 97.

58 Rackham O, Brown C M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs.The EMBO Journal, 2004, 23: 3346-3355.

59 Valencia-Burton M, McCullough R M, Cantor C R, et al. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nature Methods, 2007, 4: 421-427.

60 Milev M P, Brown C M, Mouland A J. Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1. Retrovirology, 2010, 7.

61 Ortega A D, Willers I M, Sala S, Cuezva J M. Human G3BP1 interacts with b-F1-ATPase mRNA and inhibits its translation.Journal of Cell Science, 2010, 123: 2685-2696.

62 Yin J, Zhu D H, Zhang Z P, et al. Imaging of mRNA-protein interactions in live cells using novel mCherry trimolecular fluorescence complementation systems. PLoS One, 2013, 8(11): e80851.

63 Chen M, Liu S, Li W, et al. Three-fragment fluorescence complementation coupled with photoactivated localization microscopy for nanoscale imaging of ternary complexes. ACS Nano, 2016, 10: 8482-8490.

64 Schmidt S, Adjobo-Hermans M J W, Wallbrecher R, et al. Detecting cytosolic peptide delivery with the GFP complementation assay in the low micromolar range. Angewandte Chemie International Edition, 2015, 54: 15105-15108.

65 Kamiyama D, Sekine S, Barsi-Rhyne B, et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications, 2016, 7: 11046.

66 Feng S Y, Sekine S, Pessino V, et al. Improved split fluorescent proteins for endogenous protein labeling. Nature Communications,2017, 8: 370.

Molecular Biosensors and Molecular Imaging in Cells

Wang Dianbing1Cui Zongqiang2Zhang Xian-En1
（1 National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;2 State Key Laboratory of Virology, Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China）

Molecular sensors are the biosensors made of macrobiomolecules. They are significant tools for real-time imaging of the molecular events in living cells and in vivo. Molecular beacons (MB), fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer sensors (FRET/BRET) and molecular fluorescence complementation systems (BiFC, TriFC, etc.) are major types of molecular biosensors for live cell imaging applications.In this paper, the principles and characteristics of the molecular biosensors are described. The biosensors show their unique role in study of biomolecular interactions, localization, movement, and kinetics in living cells. The restrains, challenges, and future prospects of the molecular biosensors are also discussed. Because “Seeing is believing”, the molecule biosensors enable us to see the biological process with super high spatio-temporal resolution, and thus to answer the fundamental biological questions.

molecular biosensor, cell imaging, molecular beacon (MB), fluorescence resonance energy transfer (FRET), bioluminescence resonance energy transfer (BRET), bimolecular fluorescence complementation

王殿冰 博士，中科院生物物理所副研究員，長期從事生物傳感和分析病原微生物相關(guān)研究。發(fā)表SCI收錄論文20余篇，擁有7項(xiàng)中國專利。主持和參與多項(xiàng)國家自然科學(xué)基金、“863”計(jì)劃和中科院項(xiàng)目，曾獲得湖北省自然科學(xué)獎一等獎。E-mail：wangdb@moon.ibp.ac.cn

Wang Dianbing Ph.D., associated professor in Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences (CAS). Her research interest focuses on biosensors and analytical pathogen microbiology. She has 7 patents and has published more than 20 papers in SCI indexed journals. She participated in a lot of important projects from National Natural Science Foundation of China, CAS, and was also awarded the First Prize of Natural Sciences in Hubei Province, China. E-mail: wangdb@moon.ibp.ac.cn

張先恩 男，中科院生物物理所研究員。1993年在中科院武漢病毒研究所晉升研究員，從事生物傳感器、納米生物學(xué)和分析微生物研究，發(fā)表論文 240 篇（SCI 收錄 200 篇），出版生物傳感和生物芯片專著 3 本。曾在科技部基礎(chǔ)研究司從事基礎(chǔ)研究宏觀管理。目前兼任中國生物工程學(xué)會副理事長，亞洲生物技術(shù)協(xié)會（AFOB）顧問和納米生物技術(shù)、生物傳感與生物芯片分會共同主席、APEC 首席科學(xué)顧問會議中國代表（2013，2015 和 2016年）、國家“973”計(jì)劃專家顧問組副組長。2015 年被加拿大Alberta大學(xué)授予名譽(yù)科學(xué)博士學(xué)位。E-mail：zhangxe@ibp.ac.cn

Zhang Xian-En Male, distinguished professor in the Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences (CAS). He became a full professor in the Institute of Virology, CAS, in 1993, specializing in biosensors, nanobiology, and analytical microbiology, and has published about 240 peer-reviewed papers and three books. He currently serves as the vice president of the Chinese Society of Biotechnology, co-chair of the Division of Nanobiotechnology, Biosensors and Biochips of the Asian Federation of Biotechnology (AFOB), executive chief editor of Chinese Journal of Biotechnology, editorial member or advisor for 6 other scientific journals. From 2002 to 2013, Dr. Zhang served as the director general of the Basic Research Department, Ministry of Science and Technology (MOST), dedicating himself to the macro management of science development in China. He has been serving as the Chinese representative of the APEC Meeting of Chief Science Advisors or Equivalents since 2013 (except for 2014) and deputy head of the Expert Advisory Group of the National “973” Program. In 2015, he was awarded an Honorary Doctor of Science Degree by the University of Alberta, Canada. E-mail: zhangxe@ibp.ac.cn

*資助項(xiàng)目：中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)B類培育項(xiàng)目（XDPB0305），國家自然科學(xué)基金委國家重大科研儀器研制項(xiàng)目（ 21527901）

**通訊作者

修改稿收到日期：2017年12月5日