吳佳瑩，李岳澤，劉 紅，李 艷，潘靜華，趙宏艷，王少君，汪文來，張治國，鞠大宏△，劉梅潔△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

【實(shí)驗(yàn)研究】

“腎主骨”機(jī)理研究
——左歸丸對(duì)Hepcidin、Fpn1及OPG/RANKL mRNA表達(dá)的影響?

吳佳瑩1，李岳澤1，劉 紅2，李 艷2，潘靜華2，趙宏艷2，王少君2，汪文來1，張治國1，鞠大宏2△，劉梅潔2△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

目的： 從Hepcidin對(duì)其下游OPG/RANKL通路調(diào)節(jié)的角度，初步探討左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理，并為進(jìn)一步揭示“腎主骨”理論的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 60只雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只，造模組36只共3組，造模組大鼠實(shí)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)以制作骨質(zhì)疏松癥模型。造模結(jié)束后再將造模組大鼠隨機(jī)分為OVX組、E2組、左歸丸組，每組各12只，開始給予相應(yīng)藥物。給藥3個(gè)月后，檢測大鼠脛骨骨量(TBV%)、骨吸收(TRS%)和骨形成(TFS%、OSW、MAR、mAR)情況；采用原位雜交法檢測各組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA及脛骨骨髓中Fpn1、OPG及RANKL mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： OVX組大鼠脛骨TBV%較假手術(shù)組顯著降低，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR較假手術(shù)組均有顯著增高；與OVX組比較，左歸丸組的TBV%顯著增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR水平明顯低于OVX組。與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠肝臟中Hepcidin的mRNA表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低，大鼠脛骨骨髓中Fpn1和RANKL mRNA表達(dá)強(qiáng)度則明顯增強(qiáng)，OPG mRNA的表達(dá)強(qiáng)度明顯降低。與OVX組比較，左歸丸組的大鼠肝組織中Hepcidin mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，脛骨骨髓中OPG mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，F(xiàn)pn1和RANKL mRNA表達(dá)強(qiáng)度則明顯下調(diào)。結(jié)論： 左歸丸可通過提高Hepcidin水平，增加與受體Fpn1的結(jié)合，進(jìn)而對(duì)下游OPG/RANKL信號(hào)通路起到一定的調(diào)節(jié)作用，使OPG表達(dá)上調(diào)而下調(diào)RANKL的表達(dá)，從而降低破骨細(xì)胞活性，減少骨量丟失，這是其能夠治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理之一。

左歸丸；骨質(zhì)疏松癥；鐵調(diào)素；膜轉(zhuǎn)鐵蛋白；腎主骨

鐵調(diào)素(Hepcidin)是糾正體內(nèi)“鐵過載”的關(guān)鍵物質(zhì)。多項(xiàng)研究已證實(shí)，鐵過載是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的危險(xiǎn)因素。而Hepcidin與受體膜轉(zhuǎn)鐵蛋白(Fpn)結(jié)合，可調(diào)節(jié)鐵離子水平，維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而對(duì)骨代謝產(chǎn)生影響。OPG/RANKL則是非常重要的骨代謝調(diào)控通路，是體內(nèi)細(xì)胞因子發(fā)揮作用、調(diào)節(jié)骨代謝的最終環(huán)節(jié)。我們前期工作證實(shí)，左歸丸可以治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥。本研究在前期工作基礎(chǔ)上[1]，從Hepcidin對(duì)其下游OPG/RANKL通路調(diào)節(jié)的角度，初步探討左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理，為進(jìn)一步揭示“腎主骨”理論的科學(xué)內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

60只雌性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量(240±20) g，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證編號(hào)SCXK-(軍)2012-0004)，飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室許可證號(hào)SYXK(京)2010-0032)。

1.2 藥物

戊酸雌二醇片1 mg/片(批號(hào)175A)，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司產(chǎn)品，使用時(shí)用純凈水配制成混懸液，濃度為0.018 mg/ml。左歸丸藥液常規(guī)水煎制，含藥量為0.968 g生藥/ml。藥物組成：熟地24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，枸杞12 g，鹿角膠12 g，菟絲子12 g，龜甲膠12 g，川牛膝9 g。中藥材均經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所胡世林研究員鑒定。

1.3 試劑

戊巴比妥鈉：德國MERCK公司(批號(hào)20131206)，鹽酸四環(huán)素：北京索萊寶科技有限公司(批號(hào)1104B047)，Hepcidin原位雜交檢測試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)02161TW7032741507TEC)，F(xiàn)pn1原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)02162TW7032741807TEC)，OPG原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)011590223-259060FJ)，RANKL原位雜交試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)006381129-79060FJ)。

1.4 儀器

2040切片機(jī)：德國Reicheit-Jung公司， FINESSE ME+全自動(dòng)石蠟切片機(jī)：美國Thermo公司，CRYOTOME FSE冰凍切片機(jī)：美國Thermo公司，Qwin Pro V3.5.0圖像分析系統(tǒng)：德國Leica公司，DM6000B顯微鏡：德國Leica公司。

1.5 方法

1.5.1 動(dòng)物模型制作及分組給藥 60只SPF級(jí)雌性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為造模組36只，空白對(duì)照組12只，假手術(shù)組12只3組。對(duì)造模組大鼠施以雙側(cè)卵巢切除(OVX)手術(shù)，制作骨質(zhì)疏松癥模型。假手術(shù)組大鼠僅切除卵巢周圍脂肪組織，不摘除卵巢。造模完成后，將造模組大鼠隨機(jī)分成OVX組、E2組、左歸丸組。左歸丸組大鼠灌胃給予左歸丸水煎液，E2組大鼠灌胃給予戊酸雌二醇混懸液，空白對(duì)照組、假手術(shù)組和OVX組大鼠灌服等體積的純凈水，每日1次，每周給藥6 d，休息1 d，連續(xù)給藥3個(gè)月。

圖1 各組大鼠脛骨骨小梁分布情況 (甲苯胺藍(lán)染色)

各組大鼠于對(duì)骨組織進(jìn)行熒光標(biāo)記[2]：處死前16 d和前3 d分別腹腔注射鹽酸四環(huán)素30 mg/kg體質(zhì)量。給藥結(jié)束后，取左側(cè)脛骨制作不脫鈣骨切片，用于骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的檢測；制作肝組織石蠟切片，檢測肝臟Hepcidin mRNA；取右側(cè)脛骨脫鈣，制作冰凍切片，檢測大鼠脛骨骨髓中Fpn1、OPG、RANKL 的mRNA表達(dá)。

1.5.2 指標(biāo)檢測 (1)骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)檢測[3-6]：取大鼠左側(cè)脛骨進(jìn)行塑料包埋，使用2040切片機(jī)縱向切取5 μm不脫鈣骨切片制作2張，一張用甲苯胺藍(lán)染色，另一張直接進(jìn)行熒光觀察。采用Leica Qwin V3圖像分析系統(tǒng)，對(duì)不脫鈣骨切片進(jìn)行骨組織形態(tài)計(jì)量分析：①骨量檢測：測量骨小梁面積占被測骨髓腔總面積的百分比，即骨小梁面積百分比(TBV%)，這是衡量骨量水平的主要標(biāo)志；②骨吸收情況檢測：測量不規(guī)則、凹凸不平的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比，即骨小梁吸收表面百分比(TRS%)，據(jù)此判斷破骨細(xì)胞的活性；③骨形成情況檢測：骨小梁形成表面百分比(TFS%)：有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)表面占骨小梁表面的百分比；④類骨質(zhì)平均寬度(OSW)：皮質(zhì)內(nèi)表面有成骨細(xì)胞被覆的類骨質(zhì)平均寬度，反映皮質(zhì)骨的成骨細(xì)胞活性；⑤骨小梁礦化率(MAR)：指骨小梁表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離除以2次標(biāo)記相隔的天數(shù)，可反映骨小梁礦化速度；⑥骨皮質(zhì)礦化率(mAR)：皮質(zhì)內(nèi)表面熒光雙標(biāo)記帶的平均距離除以2次標(biāo)記相隔的天數(shù)，可反映皮質(zhì)骨礦化速度。

(2)Hepcidin、Fpn1、OPG及RANKL mRNA表達(dá)的檢測：采用原位雜交法分別檢測各組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA及脛骨骨髓中Fpn1、OPG及RANKL mRNA的表達(dá)。結(jié)果判斷，陽性反應(yīng)細(xì)胞呈棕黃色，用Leica-Qwin圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測。隨機(jī)檢測5個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的積分光密度(IOD)，求其平均值作為mRNA表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)的影響

2.1.1 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠脛骨TBV%的影響 圖1表1顯示，OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術(shù)組。E2組、左歸丸組大鼠脛骨TBV%較OVX組顯著增高，但仍顯著低于假手術(shù)組。

2.1.2 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠脛骨TRS %和TFS %的影響 表2顯示，與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠脛骨TRS %和TFS %均顯著增高。E2組和左歸丸組的大鼠脛骨TRS %和TFS %均顯著低于OVX組，且E2組大鼠脛骨TFS %與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但左歸丸組大鼠的脛骨TRS %和TFS %以及E2組大鼠的TRS %仍明顯高于假手術(shù)組。

表1 各組大鼠脛骨TBV%的變化

注：與假手術(shù)組比較：*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較：△P<0.05，△△P<0.01(下同)

表2 各組大鼠脛骨TRS %和TFS %的變化

2.1.3 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠脛骨OSW、MAR和mAR的影響 表3顯示，OVX組大鼠的脛骨OSW、MAR、mAR均顯著高于假手術(shù)組。與OVX組比較，E2組和左歸丸組的大鼠脛骨OSW、MAR、mAR均顯著降低；E2組的上述指標(biāo)與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但左歸丸組的OSW、MAR、mAR仍顯著高于假手術(shù)組。

表3 各組大鼠脛骨OSW、MAR、mAR的變化

2.2 Hepcidin、Fpn1、OPG及RANKL mRNA表達(dá)的檢測

2.2.1 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠肝組織中Hepcidin mRNA表達(dá)的影響 表4顯示，與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA表達(dá)IOD顯著降低；與OVX組比較，E2組和左歸丸組的肝組織中Hepcidin mRNA表達(dá)IOD則明顯升高，但仍顯著低于假手術(shù)組。

表4 各組大鼠肝組織中Hepcidin mRNA的變化

2.2.2 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達(dá)的影響 表5顯示，與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠的脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達(dá)IOD顯著增高；與OVX組比較，E2、左歸丸組的Fpn1 mRNA表達(dá)IOD顯著降低，但仍明顯高于假手術(shù)組。

表5 各組大鼠脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達(dá)的變化

2.2.3 左歸丸對(duì)卵巢切除所致骨質(zhì)疏松大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響 表6顯示，與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠的脛骨骨髓中OPG mRNA表達(dá)IOD顯著降低；與OVX組比較，E2組、左歸丸組的OPG mRNA表達(dá)陽性密度明顯增高，且E2組OPG mRNA表達(dá)IOD與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；左歸丸組OPG mRNA表達(dá)IOD仍明顯低于假手術(shù)組。

與假手術(shù)組比較，OVX組大鼠脛骨骨髓中RANKL mRNA表達(dá)IOD顯著增高；與OVX組比較，E2組、左歸丸組RANKL mRNA表達(dá)的IOD均顯著下降，但仍高于假手術(shù)組。

表6 各組大鼠脛骨骨髓中OPG、RANKL mRNA表達(dá)的變化

3 討論

腎藏精，精生髓，髓為骨之養(yǎng)，髓充則骨堅(jiān)有力，髓虛則骨脆易折?！端貑枴ち?jié)藏象論》云：“腎者……其充在骨?！庇纱丝芍?，骨骼中的骨量多少與“腎”的虛實(shí)狀態(tài)緊密相關(guān)。左歸丸是補(bǔ)精益腎的代表方劑。本研究結(jié)果顯示，OVX組大鼠脛骨TBV%顯著低于假手術(shù)組，而反映骨吸收情況的指標(biāo)TRS%、反映骨形成情況的指標(biāo)TFS%、OSW、MAR、mAR較假手術(shù)組均有顯著增高，說明卵巢切除可以導(dǎo)致大鼠骨量顯著降低，同時(shí)骨吸收與骨形成均明顯升高，即形成高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型；與OVX組比較，左歸丸組的TBV%顯著增高，而TRS%、TFS%、OSW、MAR、mAR水平明顯低于OVX組，表明經(jīng)左歸丸治療后可提高OVX大鼠的骨量，并降低過高的骨轉(zhuǎn)化率。這與我們以往的研究結(jié)果相一致[7-12]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)素是維持鐵穩(wěn)態(tài)、糾正 “鐵過載”的關(guān)鍵物質(zhì)，而鐵過載是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的危險(xiǎn)因素[13-15]。Hepcidin由肝細(xì)胞合成后，通過血液調(diào)控鐵的分布與小腸對(duì)鐵的吸收。鐵調(diào)素水平下降，不能誘導(dǎo)其受體-膜轉(zhuǎn)鐵蛋白(Fpn)內(nèi)陷降解，因此鐵離子不斷從細(xì)胞內(nèi)輸出，釋放入血的鐵不斷增加，最終造成鐵過載；由于體內(nèi)鐵水平的升高，成骨細(xì)胞分化受到抑制，功能降低，骨形成減少；同時(shí)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)、骨吸收增加、骨量減少，可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。本研究檢測各組大鼠肝臟組織中Hepcidin mRNA的表達(dá)，以及大鼠脛骨骨髓中Hepcidin受體Fpn1 mRNA的表達(dá)，研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較OVX組大鼠肝臟中Hepcidin的mRNA表達(dá)強(qiáng)度均明顯降低，大鼠脛骨骨髓中Fpn1 mRNA表達(dá)強(qiáng)度則明顯增強(qiáng)。與OVX組比較，左歸丸組的大鼠肝臟Hepcidin mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，骨髓中Fpn1表達(dá)強(qiáng)度則明顯下調(diào)，說明大鼠切除卵巢后，Hepcidin水平降低，其與受體Fpn1的結(jié)合受到抑制，而左歸丸可在一定程度上逆轉(zhuǎn)這一過程。

OPG/RANKL是非常重要的骨代謝調(diào)控通路，在破骨細(xì)胞生成、發(fā)育、激活等一系列過程中起至關(guān)重要的作用，是體內(nèi)細(xì)胞因子發(fā)揮作用、調(diào)節(jié)骨代謝的最終環(huán)節(jié)。RANKL主要參與破骨細(xì)胞的分化和激活，OPG是RANKL的天然阻滯受體，可抑制破骨細(xì)胞活化，保護(hù)骨組織。以往的研究表明[16-18]，左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠體內(nèi)OPG、RANKL有調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)有研究證實(shí)，鐵調(diào)素對(duì)OPG具有調(diào)節(jié)作用[19-20]。本研究結(jié)果顯示，OVX組大鼠脛骨OB和MSC中OPG mRNA的表達(dá)強(qiáng)度較假手術(shù)組明顯降低，RANKL mRNA的表達(dá)強(qiáng)度則明顯升高；與OVX組比較，左歸丸組的OPG mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯增高，RANKL mRNA的表達(dá)強(qiáng)度則明顯降低。這一結(jié)果說明，左歸丸對(duì)OPG/RANKL信號(hào)通路具有一定的調(diào)節(jié)作用，即上調(diào)OPG表達(dá)，同時(shí)下調(diào)RANKL的表達(dá)，最終使破骨細(xì)胞活性降低，骨吸收減少，以達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。這可能是左歸丸的直接作用，也可能是通過調(diào)節(jié)Hepcidin水平而實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，大鼠去卵巢3個(gè)月后可成功復(fù)制經(jīng)典的腎虛型骨質(zhì)疏松癥模型。在腎虛狀態(tài)下，Hepcidin水平降低，骨髓細(xì)胞上的Fpn1內(nèi)陷降解因而被抑制，使鐵離子過多轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，導(dǎo)致鐵過載，從而刺激破骨細(xì)胞的活性；其下游的OPG/RANKL信號(hào)通路亦被影響，其RANKL表達(dá)增加而OPG表達(dá)減少，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成、分化和激活，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞異常活躍，骨量丟失加劇。而左歸丸一方面可通過提高Hepcidin水平，改善卵巢切除所致的鐵過載，進(jìn)而對(duì)下游的OPG/RANKL信號(hào)通路起到一定的調(diào)節(jié)作用；另一方面，亦可直接作用于OPG/RANKL信號(hào)通路，上調(diào)OPG表達(dá)而下調(diào)RANKL的表達(dá)，最終使破骨細(xì)胞活性降低，減少骨量丟失，這是其能夠治療骨質(zhì)疏松癥的機(jī)理之一。

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[18] 李鴻泓，鞠大宏，滕靜如，等. 左歸丸對(duì)糖皮質(zhì)激素所致骨質(zhì)疏松大鼠血清中E2、PTH含量的影響[J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011,17(7)：744-745.

[19] 劉虎，徐又佳，張積森，等．鐵調(diào)素對(duì)MC3T3-E1 小鼠成骨細(xì)胞骨保護(hù)素和骨鈣素基因表達(dá)的影響[J]．中國骨質(zhì)疏松雜志，2010，16(1)：1-4．

[20] 張鵬，劉祿林，賈鵬，等．鐵調(diào)素干預(yù)成骨細(xì)胞(hFOB1.19)后細(xì)胞膜轉(zhuǎn)鐵蛋白1、鐵離子、礦化及成骨基因變化研究[J]．中國骨質(zhì)疏松雜志，2013，19(10)：1011-1017.

R285.5

B

1006-3250(2017)11-1548-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473551)

吳佳瑩(1992-)，山西運(yùn)城人，醫(yī)學(xué)碩士，從事中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者：鞠大宏(1963-)，遼寧鳳城人，研究員，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)痹癥的臨床與基礎(chǔ)研究，Tel:13641386362,E-mail:judahong@126.com。

2017-04-11