[摘 要] 原花青素具有很強(qiáng)的清除自由基能力、抗氧化能力和多種活性，現(xiàn)已在臨床醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。本文基于傳質(zhì)理論建立以纖維素酶解法結(jié)合醇提法提取原花青素的工藝，以及采用新型的大孔樹脂純化得到高純度的原花青素，為原花青素類產(chǎn)品的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 纖維素酶解；桉樹葉；桉樹皮；原花青素

[中圖分類號(hào)] TQ914 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-7909（2017）02-26-3

原花青素是由兒茶素、表兒茶素聚合成的一類廣泛存在于植物中的多酚類化合物。由于其在酸性溶液中加熱能產(chǎn)生紅色花青素而得名[1，2]。原花青素具有很強(qiáng)的清除自由基能力、抗氧化能力和多種活性，如抗HIV病毒、抗誘變、抗癌、抗炎癥等80種由自由基引起的疾病[3-5]，于1995年在事先未指定候選藥物的情況下，被美國公眾投票推選為最受歡迎的十大植物藥之一，現(xiàn)已在臨床醫(yī)學(xué)、化妝品等領(lǐng)域得到應(yīng)用。

目前，原花青素的提取方法有水提取、有機(jī)溶劑提取、超臨界流體提取等方法[6-9]。眾所周知，大部分植物的細(xì)胞壁是由纖維素構(gòu)成的，植物的有效成分往往包裹在細(xì)胞壁內(nèi)，纖維素酶是一組復(fù)合酶，能夠水解纖維素，破壞植物細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來，有利于對(duì)有效成分的提取，進(jìn)而提高物料的利用率[10]。

本試驗(yàn)基于傳質(zhì)理論建立以纖維素酶解法結(jié)合醇提法提取原花青素的工藝，以及采用新型的大孔樹脂純化得到高純度的原花青素，為原花青素類產(chǎn)品的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桉樹葉、桉樹皮采自保山學(xué)院后山；纖維素酶（BR，30 U/mg，上海博奧生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 含量測(cè)定。取1 mL待測(cè)液稀釋至合適濃度于10 mL比色管中，加入6 mL正丁醇/濃鹽酸（95/5，v/v）溶液、0.2 mL NH4Fe（SO4）2溶液，旋緊試管，于（95±5）℃水浴中加熱40 min，然后在冷水中冷卻15 min，于546 nm波長(zhǎng)下測(cè)溶液吸光值。

提取率（mg/g）=PC含量/原料質(zhì)量×100%

1.2.2 原花青素提取純化流程。原花青素的提取純化流程見圖1。

1.3 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)分別考查酶濃度（0.6%～1.4%）、溫度（30～70℃）、時(shí)間（30～110 min）和料液比（1∶20～1∶60）對(duì)原花青素提取率的影響。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)之后，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)確定桉樹原花青素酶解法提取的最佳條件，具體參數(shù)見表1。

表1 因素水平表

1.5 吸附解吸試驗(yàn)

稱取大孔樹脂2 g，分別置于100 mL燒杯中，倒入質(zhì)量濃度為4 mg/mL的桉樹原花青素樣品液30 mL，浸泡24 h后測(cè)溶液中原花青素含量。樹脂吸附量的計(jì)算公式為：

吸附量（mg/g）=（吸附前PC濃度-吸附后PC濃度）/2×100%

將上述已吸附PC的樹脂，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇靜態(tài)解吸24 h。其解吸量及解析率計(jì)算公式為：解析率=解析量/吸附量×100%。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶濃度對(duì)提取率的影響

分別稱取一定質(zhì)量的桉樹粉末，加入pH為5.5的緩沖溶液，水浴振蕩溫度為50 ℃，加入酶濃度為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%的酶溶液，水解90 min后迅速升溫至90～100 ℃滅活10 min，分離得到上清液。在下層濾渣中加入一定量的70%乙醇溶液，70 ℃回流提取30 min，合并上清液。重復(fù)提取一次，將所有上清液與室溫下過濾、濃縮，測(cè)定PC的含量，從中選擇纖維素酶的適宜濃度，結(jié)果如圖2所示。

纖維素酶催化細(xì)胞壁中的纖維素水解，使細(xì)胞壁出現(xiàn)破損，導(dǎo)致細(xì)胞膜因失去細(xì)胞壁的保護(hù)作用而發(fā)生變形或破裂，增加了膜的滲透性，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的溶出。由圖1可以看出，酶濃度在0.60%～1.00%時(shí)，隨著酶的增加，提取率不斷上升。當(dāng)酶濃度繼續(xù)增加時(shí)，原花青素提取率開始下降。主要是因?yàn)樵诘偷拿笣舛认?，酶與底物可以充分結(jié)合；隨著酶濃度的增加，底物濃度不能對(duì)酶達(dá)到飽和，酶的作用受到抑制。因此，酶的濃度選擇為1.0%。

2.2 酶解溫度對(duì)提取率的影響

按照2.1的方法，固定酶濃度、酶解時(shí)間和料液比，分別在30、40、50、60 ℃和70 ℃恒溫提取，測(cè)定粗提物的提取率，結(jié)果見圖3。

由圖2可知，最佳提取溫度是50～60 ℃。主要是因?yàn)闇囟韧瑫r(shí)影響著酶促反應(yīng)和分子擴(kuò)散。在溫度較低時(shí)，酶的活性較低，同時(shí)胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的分子運(yùn)動(dòng)也較慢，不利于其從細(xì)胞內(nèi)向溶液擴(kuò)散；當(dāng)溫度較高時(shí)，酶的三維結(jié)構(gòu)部分被破壞，纖維酶部分甚至全部失活。

2.3 酶解時(shí)間對(duì)提取率的影響

分別稱取一定量桉樹原料粉末5份，以70%乙醇溶液作為溶劑，料液比為1∶40，在50 ℃水浴中分別浸提30、50、70、90 min和110 min，測(cè)定粗產(chǎn)品提取率，結(jié)果見圖4。

從圖3可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，原花青素的提取率不斷增加，但當(dāng)提取時(shí)間超過90 min后，提取率增加不明顯。故基于降低成本和節(jié)約能源考慮提取時(shí)間為90 min。

2.4 料液比對(duì)提取率的影響

稱取一定質(zhì)量的桉樹粉末，固定酶濃度、提取溫度和提取時(shí)間，分別以料液比1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50和1∶60（w/v）提取原花青素，測(cè)定粗提物的提取率，結(jié)果見圖5。

從圖4可知，提取率料液比的增加而增加，當(dāng)料液比超過1∶40后，提取率基本不變。故料液比的因素水平選擇1∶20～1∶40。

2.5 正交結(jié)果

取樣品每份0.200 g，按照L9（34）分9組試驗(yàn)，得到的數(shù)據(jù)如表2所示。

由表2可知，RA>RC>RD>RB，4個(gè)影響多糖提取率的因素主次順序，分別是A>C>D>B，即酶濃度>酶解時(shí)間>料液比>酶解溫度。最佳的提取條件為A2B3C2D2，即以料液比1∶30，在1.0%的酶溶液溶液中，回流提取90 min，提取溫度定為60 ℃。按照最佳反應(yīng)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，提取率為3.30%，較最高6號(hào)樣3.26%高。

2.6 純化樹脂的選擇

原料粉末經(jīng)酶解乙醇提取后純度很低，先用石油醚萃取除去非極性物質(zhì)，得到紅色絮狀的原花青素，之后再用丙酮萃取，經(jīng)冷凍干燥的深紅色粉末，測(cè)其純度可達(dá)50%以上。然后，選用3種常用的大孔樹脂對(duì)有機(jī)溶劑精制的粉末進(jìn)行純化，靜態(tài)的吸附、解吸試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

由表3可以看出，AB-8型樹脂吸附、解吸能力較其他樹脂強(qiáng)，解吸率達(dá)71.02%；D-101型雖然吸附量比AB-8稍大，但解吸率??；H-100吸附量和解吸量都小。故選擇AB-8型大孔樹脂較為合適。

2.7 純化結(jié)果

從表4中可知，AB-8型大孔樹脂純化后的產(chǎn)品冷凍干燥后測(cè)得原花青素的純度約為25%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)分別通過單因素和正交試驗(yàn)得到了從桉樹皮中提取原花青素的最佳條件，接著用有機(jī)溶劑萃取除去一部分雜質(zhì)，最后由吸附解吸試驗(yàn)選擇了AB-8作為理想的純化樹脂，純化后原花青素的純度達(dá)25%。研究表明，桉樹中含有原花青素，豐富了原花青素的資源。

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