馮勝, 袁斌, 王博雯

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湖泛發(fā)生過程中水體理化性質及細菌群落的變化

馮勝1,*, 袁斌1, 王博雯2

1. 常州大學環(huán)境與安全工程學院, 江蘇 常州 213164 2. 中國科學院南京地理與湖泊研究所, 湖泊與環(huán)境國家重點實驗室, 江蘇 南京 210008

運用分子生物學技術及多元統(tǒng)計分析的方法, 跟蹤湖泛爆發(fā)過程中細菌群落的動態(tài)及環(huán)境因子變化。結果表明: 湖泛爆發(fā)過程中水質明顯惡化, DO(溶解氧)、SD(透明度)、pH(酸堿度)顯著降低, 其中DO含量均低于0.51 mg·L-1, 水體中TN(總氮)、TP(總磷)等營養(yǎng)鹽的含量遠遠高于正常水體中的含量。細菌豐度和藻類數量明顯升高, 其中, 湖泛中心區(qū)的細菌豐度上升到107cells·L-1, 相比未發(fā)生湖泛的區(qū)域提高了一個數量級。運用高通量測序技術, 分析比較非湖泛區(qū)及不同程度湖泛區(qū)的細菌群落結構的差異。結果表明: 湖泛最嚴重的區(qū)域, α-、γ-變形菌綱(alpha-, gamma-Proteobacteria)分別由未發(fā)生湖泛時的4.10%和13.16%降至0.59%和1.91%; 放線菌門(Actinobacteria)所占比例由未發(fā)生湖泛區(qū)域的19.04%降至0.92%; 而擬桿菌門(Bacteriodetes)所占的比例則由1.12%增加至36.32%。此外, 還檢測到一些特殊生境的細菌類群, 如。通過對湖泛事件中細菌群落與關鍵環(huán)境因子的變化規(guī)律研究, 為湖泛問題的深入研究提供一定科學依據。

水環(huán)境因子; 細菌豐度; 細菌群落結構; 湖泛

1 前言

太湖是我國五大淡水湖之一, 自20世紀90年代起, 太湖湖西水域、梅梁湖、貢湖曾多次出現湖泛現象[1-2]。湖泛是藻類大量暴發(fā)、積聚和死亡后, 在適宜的氣象、水文條件下與底泥中的有機物發(fā)生生物、化學反應, 在缺氧或厭氧條件下釋放硫化物、甲烷和二甲基三硫等硫醚類物質, 從而在富營養(yǎng)化湖泊中形成伴有惡臭的褐黑色水團的現象[3]。繼大規(guī)模重度藍藻水華之后, “湖泛”問題已成為我國淡水富營養(yǎng)化淺水湖泊面臨的又一嚴峻生態(tài)災害[4]。目前針對湖泛的研究涉及湖泊水文[5]、氣象[6]、物理[7]、化學[8-9]、生物[10]等多個領域, 大量交叉研究的結果顯示: 藍藻和某些快速繁殖水生植物的堆積與污染有機質的輸入是湖泛發(fā)生的物質基礎, 適宜的氣象水文條件(強光照、高溫、低風速、水體垂直熱分層等)是湖泛的觸發(fā)因素, 而以厭氧條件下快速分解有機質的梭菌、硫酸鹽還原菌、產甲烷菌(古菌)以及甲烷氧化菌為標志的微生物是湖泛形成的生物機制。溶解氧作為聯系湖泊水文、理化和生物過程的關鍵因子, 成為誘導湖泛形成和消散的核心因素[11-12]。由此可見: 與湖泛發(fā)生時的環(huán)境特征(如低溶解氧, 低pH, 高有機質, 高總磷、總氮)相對應的是其簡化的食物網結構和特殊的微生物類群, 細菌作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈和食物網的重要組成部分, 驅動湖泊生態(tài)系統(tǒng)中絕大多數生物活性元素的形態(tài)轉化和地球化學循環(huán)[13], 在湖泛發(fā)生期間及后期的生態(tài)系統(tǒng)恢復等方面都具有關鍵作用。細菌是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的主要分解者, 在物質循環(huán)和能量流動中起著重要作用。其數量和群落結構的改變都會顯著影響整個微食物網的結構及系統(tǒng)中物質循環(huán)和能量流動, 對于細菌群落結構特征的研究受到了廣泛關注[14-15]。李玉華等[16]采用聚合酶鏈式反應－變性凝膠梯度電泳(PCR-DGGE)對松花湖水體中微生物群落結構的多樣性進行了研究; 沈燕等[17]選用針對α、β、γ變形菌門和擬桿菌門的幾類探針, 采用原位雜交的方法(FISH)研究了太湖中主要變形菌門細菌的優(yōu)勢類群、空間分布差異及其與營養(yǎng)鹽、Chl-a濃度等環(huán)境因素的相互影響。吳慶龍等[18]運用原位熒光雜交、變形梯度凝膠電泳(DGGE)和反向線點雜交(RLB)等多種分子生物學方法對青藏高原16個不同鹽度湖區(qū)進行了鹽度和緯度對細菌群落結構影響的研究。目前使用最多的分子生物學方法主要為DGGE和T-RFLP, 有些研究也會再結合Sanger測序得到一些特別的序列圖譜的堿基序列, 建立克隆文庫與數據庫進行對比[19-22]; 而高通量測序技術, 無需構建文庫, 避免了克隆的誤差, 能在數百萬個點上同時閱讀測序, 擁有較好的定量功能和性價比[23-24]。本研究應用高通量測序技術研究湖泛發(fā)生過程中細菌群落組成的動態(tài)變化, 以探尋湖泛事件過程中細菌群落的變化規(guī)律, 為湖泛問題的研究提供一定科學依據。

2 材料與方法

2.1 樣點布設

湖泛是一種因藻類和水草等大量聚積、死亡所引發(fā)的湖泊水體突發(fā)性黑臭現象。典型湖泛區(qū)會出現硫化氫、甲烷等氣體逸出水面, 大面積黑水、底泥上泛, 出現如藻華(algal bloom) 相似開放(bloom)的狀態(tài)。湖泛的生消過程大致可分為4個階段, 即(藻類或水草)生物聚積階段、(水體)耗氧缺氧階段、(湖泛)爆發(fā)成災階段, 以及(水體)復氧消退階段。根據太湖站2000年至2015年近16年的年報報道[25-28], 太湖主要發(fā)生湖泛的區(qū)域在: 貢湖灣北岸沿岸帶。根據常規(guī)監(jiān)測和現場情況, 在此區(qū)域設立5個采樣點(1#-5#), 見圖1。其中1#(N:120.286025; E:31.419991) 為未發(fā)生湖泛區(qū)域, 設為對照。其余點位坐標分別為: 2#(N:120.285939; E:31.423140)、3#(N:120.246714; E:31.412227)、4#(N:120.282677; E:31.420650)、5#(N: 120.278729; E:31.418672)。

2.2 樣品采集

用采水器采集每個點位表層水樣(約湖面以下50 cm), 置于預先用酸浸泡過的塑料桶中, 運回實驗室, 在12 h內完成理化參數測定。另取15 mL水樣裝入預先滅過菌的離心管中, 加入經濾膜(0.22 μm)過濾后的甲醛溶液, 使甲醛終濃度為2%(V/V)。隨后將樣品置于冰盒中, 帶回實驗室用于測定細菌的豐度群落結構。

圖1 采樣點位圖

2.3 水體理化參數的測定

水溫(T)、透明度(SD)、電導率(EC)、DO和pH值在現場用YSI6600多參數水質分析儀測定。總氮(TN)、溶解性總氮(DTN)、總磷(TP)、溶解性總磷(DTP)、Chl-a等參數的測定參考湖泊富營養(yǎng)化調查規(guī)范[29]。

2.4 細菌豐度、藻類生物量的測定

由于天然水環(huán)境中只有0.001％—3%的微生物可以被分離培養(yǎng)[30], 本研究利用熒光染料DAPI (4￠,6-diamidino-2-phenylindole)與表面熒光顯微鏡結合, 直接計數環(huán)境中細菌的方法(epifluores-cence direct counting method, FDC)[31-32]。浮游植物個體體積小, 直接稱重較困難, 且其細胞比重多接近于1。藻類生物量一般按體積來換算, 可用形態(tài)相近似的幾何體積公式計算細胞體積, 細胞體積的毫升數相當于細胞重量的克數, 這樣體積值(μm3)可直接換算為重量值(109μm3≈1 mg鮮藻重)。

2.5 DNA的提取、高通量測序

取200 mL原水經0.22 μm孔徑的聚碳酸酯膜(Millipore, Cork, Ireland)過濾后收集濾膜, 用事先滅過菌的剪刀剪碎, 放入滅菌后的2 mL離心管中, 置于-80 ℃的超低溫冰箱中保存至DNA提取。微生物樣品DNA采用試劑盒FastDNA SPIN Kit for Soil(MP Biomedicals)進行提取并于-20 ℃下保存, 高通量測序實驗委托上海派森諾生物科技有限公司完成。

3 結果與討論

3.1 理化參數與細菌豐度、藻類數量的對比

湖泛突發(fā)區(qū)域, 溶解氧(DO)、透明度(SD)、pH值與湖泛未發(fā)生區(qū)域1#點相比顯著降低。其中2#-5#區(qū)域DO濃度均低于0.51 mg·L-1, SD在湖泛最嚴重點位處僅為0.13 m。隨著采樣點位向湖泛中心靠近, Chl-a、電導率也都在不斷增加, 水溫也略微升高。其中, 湖泛最嚴重點位處(5#), Chl-a含量是未發(fā)生湖泛區(qū)域(1#)的近5倍(圖2)。這是由于湖泛形成過程中, 藻類大量腐敗, 水體透明度急劇下降, Chl-a升高[33]。由于水面以下缺乏光照, 水面下大量藻體細胞的呼吸作用、新陳代謝以及有機質的協(xié)同作用消耗了大量的氧氣, 短時間內溶解氧就降至接近于零, 藻類的大量分解使得湖泛區(qū)水溫升高、電導率增加并降低水體pH值[34-36]。

圖3中可以明顯的看到隨著湖泛的不斷加劇, 由湖泛外圍向中心, N、P等營養(yǎng)鹽的含量不斷增加。在湖泛最為嚴重的5#點TN含量達到14.09 mg·L-1, 是太湖正常水體TN含量的7倍左右; TP含量達到0.51 mg·L-1, 比對照點的TP含量高出0.40 mg·L-1左右, 且NH4+、溶解性總氮(DTN)、PO43-和DTP均高于正常值。這是由于水華藍藻在快速生長繁殖過程中, 群體內積聚了大量的營養(yǎng)鹽, 當“湖泛”發(fā)生時, 一方面, 由于大量藍藻的腐敗使其體內大量聚集的 N、P營養(yǎng)鹽被迅速釋放到水體中; 而另一方面, “湖泛”中的厭氧環(huán)境會促進NH4+-N、PO43?-P從沉積物表層向上覆水擴散[37]。因此, 這些氮、磷營養(yǎng)鹽的變化主要是由藻類劇烈分解導致形成水體厭氧環(huán)境及大量釋放有機物造成的[38-39]。

圖2 野外湖泛現場數據

圖 3 野外湖泛的理化參數

由圖4可以看出: 細菌豐度隨著湖泛程度的加劇也由106cells·L-1上升到107cells·L-1, 增加了一個數量級。藻類數量在湖泛區(qū)均明顯高于對照點, 但湖泛區(qū)的藻類數量并沒有隨著湖泛的加劇呈現不斷上升趨勢, 而是大致相等。

3.2 Miseq宏基因組測序結果及分析

5個樣品共得到40萬個序列, 經優(yōu)化分析后獲得了10127個operational taxonomic unit (OTUs), 樣品的覆蓋度達到了95.7%—98.45%, 根據數據繪制了用來表示樣本豐富度與均勻度的幾種多樣性指數圖(圖5)。

群落生態(tài)學中研究微生物多樣性, 通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性, 包括通過一系列統(tǒng)計學分析指數估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性[40]。Chao指數和Ace指數是計算菌群豐度的指數, Chao是用chao1算法估計樣品中所含OTU數目的指數, 在生態(tài)學中常用來估計物種總數, 由Chao[41]最早提出的, Ace也是由Chao提出的生態(tài)學中估計物種總數的常用指數之一[42]。Simpson由Edward Hugh Simpson[43]提出, 在生態(tài)學中常用來定量描述一個區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數值越大, 說明群落多樣性越低。Shannon與Simpson多樣性指數都常用于反映alpha多樣性指數, 而Shannon值越大, 則說明群落多樣性越高[44-45]。在圖5的多樣性指數中可以看出, 同樣是湖泛區(qū)的3#物種豐度低于其他點位, 多樣性也低于其它點位。同樣是湖泛區(qū), 不同區(qū)域之間的細菌群落結構也存在著差異。

圖4 野外湖泛各個點細菌豐度及藻類生物量對比圖

圖5 各個樣本的多樣性指數

高通量數據的分析結果顯示: 5個樣本中的序列主要為變形菌門(3367個OTUs)的α-、β-和γ-亞綱(α-,β-,and γ-subdivision of Proteobacteria), 擬桿菌門(Bacteriodetes)(996個OUTs), 放線菌門(Actinoba-cteria)(434個OTUs), 厚壁菌門(Firmicutes)(1379個OTUs)、OD1和一些未分類的門。除細菌外, 還有少量的古菌分別屬于泉古菌門、廣古菌門和一些未分類的門。進一步分析顯示, 屬于α-proteobacteria變形菌門的主要有短波單胞菌屬()和鞘氨醇單胞菌()等。屬于β-Proteo-bacteria的主要有食酸菌屬()、噬氫菌屬()等一些未分類的屬。屬于γ-Proteo-bacteria變形菌的主要有不動桿菌屬()、假單胞菌屬()等等。屬于放線菌門(Actinobacteria)下的優(yōu)勢種為微桿菌屬()、分支桿菌屬()、類諾卡氏菌屬()、和一些未分類的菌屬。屬于擬桿菌門(Bacteriodetes)的屬主要有擬桿菌()、理研科的未分類的一些屬和黃桿菌科下的一些屬。屬于厚壁菌門(Firmicutes)的主要有庫特氏菌屬()、球菌科的一些屬、微桿菌屬()、動性微菌屬()、乳桿菌屬()、梭菌屬()和醋桿菌屬()。

3.3 湖泛不同區(qū)域的細菌優(yōu)勢種的差異分析

由圖6可見: 1#點位處葉綠素最低, 相反湖泛最嚴重的5#葉綠素最高, 各個餅圖表示測序結果在門水平上的百分比。目前, 在湖泊水體中共發(fā)現21個典型的淡水細菌門類, 其中變形菌門(Proteoba-cteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroi-detes)、放線菌門(Actinobacteria)和疣微菌門(Verru-comicrobia)是最主要的5個門類[46]。在這次的高通量檢測結果主要有變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和OD1。各個樣品的群落結果呈現顯著差異(表1)。

從表1中可以看出, 變形菌門(Proteobacteria)里的α-變形菌綱(α-proteobacteria), γ-變形菌綱(γ-Pro-teo-bacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)在未發(fā)生湖泛的區(qū)域與發(fā)生湖泛的區(qū)域相比OTU數量在不斷減少, 而β-proteo-bacteria、擬桿菌門(Bacteroidetes)的OTU數量則在發(fā)生湖泛的區(qū)域呈現增加的趨勢。α-變形菌綱(α-Proteobacteria)所占比例由未發(fā)生湖泛時的4.10%降至湖泛最嚴重區(qū)域的0.59%, 進一步分析數據發(fā)現α-變形菌綱(α-Proteobacteria)下的短波單胞菌屬()和鞘氨醇單胞菌屬()明顯減少。其中, 鞘氨醇單胞菌()可以降解芳香化合物亦可將戊糖、己糖及二糖轉變成酸。但它屬于專性需氧型微生物, 所以可能是由于湖泛發(fā)生區(qū)域的厭氧環(huán)境特征使得這種菌種數量減少。

另外一個不同區(qū)域變化最為顯著的是放線菌門(Actinobacteria), 放線菌可以分解許多有機物, 包括芳香化合物、石蠟、橡膠、纖維素、木質等復雜化合物和一些氰等毒性強的化合物。在自然界物質循環(huán)中, 更在污水及有機固體廢物的生物處理中有積極的作用, 還能促使土壤形成團粒結構而改善土壤。在湖泛發(fā)生的區(qū)域放線菌的數量并沒有增加而是顯著的減少了, 未發(fā)生湖泛的對照點1#中放線菌的OTU比例為19.04%, 而在湖泛最為嚴重的5#點中僅為0.92%, 降低了近20倍, 造成原因可能是大多數放線菌是好氧的且放線菌最適生長pH一般為微堿性。而隨著湖泛的加重, 水體中溶氧極低且pH值也在減小。例如, 在這次發(fā)現的放線菌門(Actinobacteria)下的微桿菌屬()、桿菌屬()、節(jié)桿菌屬 ()和類諾卡氏菌()基本上都是好氧菌且不抗酸, 都隨著湖泛的發(fā)生加劇呈現減少的變化趨勢。

圖6 細菌群落組成與葉綠素的關系

表1 各個樣品中主要幾種淡水菌種的所占比例(%)

圖7、8中也列出了一些在湖泛發(fā)生的不同區(qū)域中變化較為顯著的菌種, 在湖泛發(fā)生的水體中增加的菌群大都是厭氧菌, 例如能夠分解多糖的擬桿菌門(Bacteroidetes)是大多是厭氧菌, 與未發(fā)生湖泛的水體中(1.12%)相比, 湖泛區(qū)水體中擬桿菌門(Bacte-roidetes)的OTU比例都不同程度地大幅增加, 最高的達到36.32%。厚壁菌門(Firmicutes)整體OTU的數量在湖泛發(fā)生區(qū)域水體中是下降的, 而屬于它的厭氧菌種韋榮氏球菌()和球菌消化鏈球菌屬()的OTU數量卻是增加的。其中球菌消化鏈球菌屬()在厭氧條件下能夠產酸, 但較適合偏堿性環(huán)境生長。這也就能解釋了該菌種在湖泛發(fā)生區(qū)域的最外圍湖泛不是特別嚴重的2#點中OTU數量最高, 但在湖泛最為嚴重的中心5#點OTU數量含量最少。因為隨著湖泛越嚴重其pH值越低, 相比之下, 還是同樣厭氧環(huán)境但偏堿性的2#點適合其生長。但隨著球菌消化鏈球菌屬()不斷的繁殖并分解產酸, 也直接改變了其所在的環(huán)境。從圖2對湖泛監(jiān)測的現場數據的分析中可以看出, 隨著湖泛的加劇, 水體中的電導率等指標都是增大的, 在高通量的數據分析中也發(fā)現, 在湖泛較為嚴重的5#點出現了一些在高鹽地帶出現的菌種, 例如屬于擬桿菌門(Ba-cteroidetes)的。

在對各個樣品中主要細菌種類的分析顯示, 5個樣品共發(fā)現放線菌門(Actinobacteria)的有434種菌屬, 在未發(fā)生湖泛的1#點占了395種, 而湖泛最為嚴重區(qū)域比例升高的菌種的5#僅發(fā)現72個屬, 同樣OTU數量在減少的α-變形菌綱(α-Proteoba-cteria), γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)在湖泛最嚴重的5#種類的多樣性也減少, 而擬桿菌門(Bacteroi-detes)和β-變形菌綱(β-Proteobacteria)在發(fā)生湖泛的區(qū)域水體中的種類的多樣性升高。但是對于主要的細菌種類的分析, 各個樣品即湖泛發(fā)生時不同區(qū)域都沒有達到在5個樣品所發(fā)現的主要幾種細菌種類的總數, 這說明湖泛的發(fā)生不僅僅是減少了一些細菌種類, 也出現了一些未發(fā)生湖泛區(qū)域水體中在不存在的細菌種類。

圖 7 湖泛區(qū)域比例降低的菌種

圖 8 湖泛區(qū)域比例升高的菌種

4 小結

本研究的主要目的是通過比較湖泛發(fā)生過程不同區(qū)域之間及其與未發(fā)生湖泛區(qū)域間水體中理化指標的改變、細菌群落結構的差異, 來了解湖泛對水體中原核微生物豐度及群落結構的影響。不同區(qū)域可以看作是湖泛發(fā)生的不同嚴重程度, 湖泛中心即是湖泛最為嚴重的區(qū)域。各個不同區(qū)域水體中細菌群落的組成可以看做是湖泛各個階段的群落演替過程。與未發(fā)生湖泛區(qū)域水體相比, 湖泛區(qū)主要有以下特點:

1) 水質明顯惡化, DO、透明度(SD)、pH值顯著降低, 其中DO含量均低于0.51 mg·L-1, 屬于厭氧環(huán)境。水體中TN、TP等營養(yǎng)鹽的含量分別是正常水體含量的7倍和5倍左右。

2) 細菌豐度和藻類數量都明顯升高, 其中, 湖泛中心的細菌豐度上升到107cells·L-1高出對照水體中細菌豐度一個數量級。

3) 變形菌門的α-、β-和γ-綱(α-,β-, and γ- Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteriodetes), 放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)等幾種太湖主要的淡水菌種的比例都發(fā)生了顯著變化。α-、γ-變形菌綱分別由未發(fā)生湖泛區(qū)的4.10%和13.16%降至0.59%和1.91%; 放線菌門(Actinobacteria)所占比例由未發(fā)生湖泛區(qū)域的19.04%降至0.92%; 而擬桿菌門(Bacteriodetes)所占的比例則由1.12%增加至36.32%。

4) 在湖泛區(qū)域水體中的厭氧環(huán)境下, 不再適合一些專性好氧菌, 而是出現了一些新的產生酸性代謝產物的厭氧菌,,在湖泛區(qū)的群落組成中發(fā)現。

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Changes in physical and chemical properties of water and bacterial community when black bloom occurs

FENGsheng1,*, YUANbin1, WANG bowen2

1. School of Environmental & safety Engineering, Changzhou University, Changzhou, Jiangsu 213164, China 2. State Key Laboratory of Lake Science and Environment, Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing, JiangSu 210008, China

Molecular biology techniques and multivariate statistical analysis method were used to evaluate relationships between bacterial abundance and environmental variables in the areas when black bloom happened regularly. We also investigated the changes of spatial bacterial community during black bloom happened. Results showed that: DO(dissolved oxygen), SD(secchi disk) and pH(potential of hydrogen) decreased significantly in the black bloom field, particularly, DO decreased as low as 0.51 mg·L-1, which indicated an anaerobic environment in the water column. In addition, black bloom increased nutrient concentrations (total nitrogen, total phosphorus), phytoplankton biomass and bacterial abundance. The bacterial abundance in the central of black booms area exceeded 107cells·L-1, which improved an order of magnitude higher than other areas without black bloom; bacterial community structures were significantly different among the areas: alpha-, beta-, and gamma-Proteobacteria, Bacteriodetes, Actinobacteria. Namely, along black bloom, α-, γ-proteobacteriadecreased from 4.10% and 13.16% to 0.59% and 1.91% respectively; anddeceased from 19.04% to 0.92%. In contrast, Bacteriodetes increased from 1.12% to 36.32%. In addition, some special habitats bacteria were also detected in our samples likeand. Through studying the change rules of bacterial community and key environmental factors when black bloom occurs, we can provide some scientific instruction for further research of black bloom.

aquatic environmental factor; bacterial abundance; bacterial community structure; black bloom

10.14108/j.cnki.1008-8873.2017.06.004

X524

A

1008-8873(2017)06-025-10

2016-07-19;

2016-09-15

國家自然科學基金(41371446); 國家自然科學基金(41271498)

馮勝(1974—), 男, 江蘇常州人, 博士, 副教授, 主要從事湖泊治理研究, E-mail: shfeng@cczu.edu.cn

E-mail: shfeng@cczu.edu.cn.