（重慶市畜牧科學(xué)院，榮昌 402460）

酶解與包合技術(shù)制備水溶性花粉的比較研究（續(xù)）

劉佳霖 殷素會(huì) 高麗嬌 曹 蘭 羅文華 程 尚

（重慶市畜牧科學(xué)院，榮昌 402460）

（續(xù)《中國(guó)蜂業(yè)》2017年第10期）

2.4.5 纖維素酶+β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.2，加入纖維素酶0.750 g（酶添加量為1500 U/g），65℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質(zhì)量比為1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過(guò)濾。

2.4.6 果膠酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=4.0，加入果膠酶0.469 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.25 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過(guò)濾。

2.4.7 果膠酶+β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=4.0，加入果膠酶0.4688 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質(zhì)量比為1∶4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過(guò)濾。

2.4.8 脂酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶3.750 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過(guò)濾。

2.4.9 脂酶＋β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入脂酶3.750 g（酶添加量為1500 U/g），40℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質(zhì)量比為1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過(guò)濾。

2.4.10 β-葡萄糖苷酶+堿性蛋白酶：使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.189 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=9.0，加入堿性蛋白酶1.250 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，過(guò)濾。

2.4.11 β-葡萄糖苷酶+β-環(huán)糊精：使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉溶液pH=5.5，加入葡萄糖苷酶0.189 g（酶添加量為1500 U/g），50℃條件下攪拌反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后，于100℃下加熱5 min滅酶，冷卻。使用1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)蜂花粉水溶液pH=8.7，加入β-環(huán)糊精6.250 g（與蜂花粉質(zhì)量比為1:4），37℃下水浴磁力攪拌4 h，過(guò)濾。

2.5 蛋白質(zhì)及黃酮含量測(cè)定

2.5.1 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定：采用考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量試劑盒方法[21]，將0、40、80、120、160、200、240 μl牛血清蛋白BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入試管中，加入PBS補(bǔ)足600 μl（600、560、520、480、440、400、360 μl ），向各試管加入11.40 mL考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置5～10 min，分別在595 nm處記錄吸光值。

測(cè)定蜂花粉水溶液的蛋白質(zhì)含量：取50 ml產(chǎn)物溶液定容至500 ml，將適當(dāng)體積的樣品加入到試管中，并用PBS補(bǔ)足到600 μl，在向各試管加入11.4 ml考馬斯亮藍(lán)染液，混勻，室溫放置5～10 min，分別在595 nm處記錄吸光值。

按下列公式計(jì)算水溶性蜂花粉的蛋白質(zhì)提取率：

2.5.2 黃酮含量測(cè)定：標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作：精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 μg/ml）：0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml于10 ml比色管中，加5% NaNO2溶液0.3 ml，搖勻后放置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液0.3 ml，搖勻后靜置6 min，加入4%NaOH溶液4 ml在用乙醇或者水定容，搖勻，于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)所測(cè)得的數(shù)據(jù)采用直線(xiàn)回歸法計(jì)算產(chǎn)物黃酮含量

出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程，并以吸光度為橫坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[22]。

樣品的測(cè)定方法：精密吸取1 ml樣品溶液置于10 ml容量瓶中，加入乙醇（加入4 ml）至5 ml，加入NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系[22]，搖勻，以相應(yīng)試劑做空白，于510 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

按下列公式計(jì)算水溶性蜂花粉的黃酮提取率：

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，方差分析使用One-way ANOVA的LSD法，顯著水平P<0.05。

3 結(jié)果與分析

3.1 蛋白質(zhì)及黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以BSA（牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白）為橫坐標(biāo)x（μl），595 nm處吸光值為縱坐標(biāo)y作圖，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在0～240 μl BSA范圍內(nèi)符合方程y=0.0038x+0.0373，R2=0.996。

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)x（μg），510 nm處吸光值為縱坐標(biāo)y作圖，制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在0～500 μg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品范圍內(nèi)符合方程y=0.0011x-0.0083，R2=0.999。

3.2 酶解與包合技術(shù)制備水溶性花粉的比較

酶解與包合技術(shù)制備水溶性蜂花粉的結(jié)果如表1所示。單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉，水溶性蛋白質(zhì)及黃酮提取率最高的為堿性蛋白酶及環(huán)糊精2:1，水溶性蛋白質(zhì)提取率分別為84.55%和84.33%，黃酮提取率分別為19.51%和18.50%。采用酶解與包合復(fù)合技術(shù)制備水溶性花粉，水溶性蛋白質(zhì)提取率最高的為果膠酶+β-環(huán)糊精和纖維素酶+β-環(huán)糊精，水溶性蛋白質(zhì)提取率分別為95.40%和88.91%；水溶性黃酮提取率最高的為纖維素+堿性蛋白酶和纖維素酶+β-環(huán)糊精，黃酮提取率分別為35.93%和37.86%。綜合比較，采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率，與空白對(duì)照相比可提高水溶性蛋白質(zhì)提取率120.95%，提高水溶性黃酮提取率105.98%，顯著高于單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉的效果。

4 討論

蜂花粉是一種天然、綠色、安全的保健品[1,5,6]，水溶性、穩(wěn)定性及感官特性是限制其深加工及廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵難題。目前，蜂花粉的深加工通常采用真空冷凍干燥技術(shù)及超微粉碎技術(shù)制備高活性、低致敏的產(chǎn)品，但其理化性狀并沒(méi)有得到很大的改善，主要活性成分的提取仍處于發(fā)展階段。酶解改性技術(shù)是目前使用最廣泛的蛋白質(zhì)改性技術(shù)，通過(guò)多種酶的內(nèi)切或外切作用可以改變物料的理化特性和功能特性，該技術(shù)反應(yīng)速度快、條件溫和、無(wú)有毒有害物質(zhì)產(chǎn)生，能夠保證物料中的活性成分得到有效的保留[23,24]。本研究比較了多種蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、脂酶及葡萄糖苷酶制備水溶性花粉的效果，結(jié)果顯示，不同的酶制備水溶性蜂花粉的效果差異較大，堿性蛋白酶制備的水溶性蜂花粉蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率最高，分別為84.55%和19.51%。與前人的結(jié)果一致[7]，堿性蛋白質(zhì)制備水溶性蜂花粉的效果顯著高于其他酶。

包合技術(shù)是一種重要的蛋白質(zhì)物理改性技術(shù)，一般采用環(huán)糊精為輔料，包合物料中的多種小分子物質(zhì)，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)成分影響較小[25]。該技術(shù)在改善物料水溶性、穩(wěn)定性及感官特性等方面具有十分重要的作用，已廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥等多個(gè)產(chǎn)業(yè)[26,27]。本研究比較了不同環(huán)糊精添加量對(duì)制備水溶性蜂花粉的影響，結(jié)果顯示，環(huán)糊精添加量對(duì)包合技術(shù)制備水溶性蜂花粉的影響較?。≒<0.05）, 環(huán)糊精2:1制備的水溶性蜂花粉蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率最高，分別為84.33%和18.50%。包合技術(shù)和酶解改性技術(shù)制備水溶性蜂花粉的效果差異不顯著。

本研究在單一使用酶解與包合技術(shù)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步開(kāi)展蛋白酶+纖維素酶、果膠酶、脂酶、葡萄糖苷酶以及環(huán)糊精+纖維素酶、果膠酶、脂酶、葡萄糖苷酶的復(fù)合工藝制備水溶性蜂花粉的比較研究。綜合結(jié)果顯示，采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉的效果最好，其水溶性蛋白質(zhì)提取率為88.91%，水溶性黃酮提取率高達(dá)37.86%，顯著高于單一酶制劑或環(huán)糊精制備水溶性花粉的效果。由此，本研究認(rèn)為，多種工藝的復(fù)合使用有利于蜂花粉深加工產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，在改善蜂花粉理化性狀，分離、純化蜂花粉主要活性物質(zhì)方面具有十分廣闊的發(fā)展前景。

5 結(jié)論

采用纖維素酶+β-環(huán)糊精制備水溶性花粉能夠獲得較高的水溶性蛋白質(zhì)提取率和黃酮提取率，與空白對(duì)照相比可提高水溶性蛋白質(zhì)提取率120.95%，提高水溶性黃酮提取率105.98%，顯著高于單一酶制劑或包合材料制備水溶性花粉的效果。多種技術(shù)的復(fù)合使用，有助于蜂花粉深加工的進(jìn)一步發(fā)展。

[1] 劉建濤, 趙利, 蘇偉, 等. 蜂花粉生物活性物質(zhì)的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(12): 909-912.

[2] BRODSCHNEIDER R, CRAILSHEIM K. Nutrition and health in honey bees[J]. Apidologie, 2010, 41(3): 278-294.

[3] HUANG Z. Pollen nutrition affects honey bee stress resistance[J]. Terrestrial Arthropod Reviews. 2012, 5(2): 1-15.

[4] 董文濱, 馬蘭婷, 王穎, 等. 意大利蜜蜂春繁、產(chǎn)漿、越冬和發(fā)育階段營(yíng)養(yǎng)需要建議標(biāo)準(zhǔn)[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào), 2014, 26(2):342-347.

[5] 張金振, 吳黎明, 趙靜, 等. 13種植物源蜂花粉蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(01): 254-257.

[6] 程尚, 羅文華, 高麗嬌, 等. 酶解改性技術(shù)在蜂產(chǎn)品中的應(yīng)用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2016, (10上): 229-233.

[7] 朱曉麗, 孫麗萍, 董捷. 油菜蜂花粉蛋白酶解條件的研究[J].食品科學(xué), 2008, 29(4): 234-238.

[8] 高鯤, 張紅城, 董捷. 復(fù)合蛋白酶酶解油菜蜂花粉及其表征[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(20): 99-103.

[9] 李艷伏, 徐懷德, 陳金海, 等. 木瓜蛋白酶酶解核桃粕蛋白產(chǎn)物抗氧化活性研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2008, 8(5): 8-14.

[10] 張海生, 陳錦屏. 蜂蛹蛋白質(zhì)酶解工藝及其氨基酸口服液對(duì)小鼠的強(qiáng)壯作用[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007, 35(1): 100-105.

[11] 郭冬青, 紀(jì)付江, 高健, 等. 無(wú)花果蛋白酶的不同提取方法比較及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 50(6): 1258-1260.

[12] 張璟晶, 袁敏, 管遠(yuǎn)紅, 等. 不同溫度、pH和無(wú)機(jī)離子對(duì)黑曲霉A66菌株產(chǎn)柚苷酶活力影響的初步研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28(3): 449-452.

[13] 張偉光, 袁鵬, 尹志紅, 等. 胃-胰蛋白酶水解蜂王漿主蛋白制備血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽工藝的優(yōu)化[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2012, 38(4): 511-518.

[14] 馬宇翔, 楊國(guó)龍, 周瑞寶, 等. 菠蘿蛋白酶水解醇法大豆?jié)饪s蛋白的研究[J]. 河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2006,27(5): 43-46.

[15] 郭冬青, 紀(jì)付江, 高健, 等. 無(wú)花果蛋白酶的不同提取方法比較及酶學(xué)性質(zhì)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 50(6): 1258-1260.

[16] 王邕, 黎海彬, 白先放, 等. 酶解-溶劑法提取羅漢果中黃酮類(lèi)物質(zhì)的研究[J]. 食品科技, 2006, 31(7): 125-127.

[17] 張明春, 解軍波, 李婷, 等. 復(fù)合酶法提取酸棗仁黃酮研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(9): 174-177.

[18] 何新益, 符繩慧, 王磊. 水溶性蜂膠的酶解制備工藝優(yōu)化[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2009, 25(2): 280-284.

[19] 張紅城, 董捷, 李春陽(yáng), 等. β-葡萄糖苷酶酶解蜂膠黃酮苷的研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(11): 332-336.

[20] 戴繼榮, 唐力, 鄧玉林, 等. 生物活性環(huán)糊精衍生化蛋白質(zhì)的合成[J]. 北京理工大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 25(4): 369-371.

[21] BRAFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976,72: 248-254.

[22] 孫麗萍, 田文禮, 朱曉麗, 等. 蜂花粉總黃酮檢測(cè)方法的研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(1): 262-265.

[23] 郝曉霞, 羅明, 余淑嫻. 酶解技術(shù)及其應(yīng)用[J]. 江西科學(xué),2007, 25(3): 355-358.

[24] 許雄, 孫靈霞, 李苗云, 等. 酶解畜禽獸肉的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(9): 3677-3678, 3714.

[25] 谷福根, 高永良, 崔福德. 環(huán)糊精包合物研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2005, 14(6): 686-693.

[26]趙海霞，陳浩，田景振.環(huán)糊精包合技術(shù)[J]. 山東中醫(yī)雜志, 2000, 19(4): 241-243.

[27] JUN S W, KIM M S, KIM J S, et al. Preparation and characterization of simvastatin/hydroxypropyl-beta-cyclodextrin inclusion complex using supercritical antisolvent (SAS) process[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2007,66(3): 413-421.characterization of simvastatin/hydroxypropylbeta-cyclodextrin inclusion complex using supercritical antisolvent(SAS) process[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2007, 66(3): 413-421.

國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-45-SYZ15）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2015jcyjA80032）；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（16440）

劉佳霖（1988-），男，研究實(shí)習(xí)員，碩士，研究方向蜜蜂授粉行為學(xué)及蜂產(chǎn)品研究。E-mail: liujialin5164@163.com。

程尚（1981-），男，碩士，研究方向?yàn)槊鄯涫诜坌袨閷W(xué)及蜂產(chǎn)品研究。E-mail: chengshang3@126.com。