李桂林 王 穎 馬蘭婷 郭恒俊 胥保華 郭興啟

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

山東省各地市蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒抽樣檢測(cè)分析

李桂林1 王 穎2 馬蘭婷2 郭恒俊1 胥保華2 郭興啟1

（1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，泰安 271018）

蜜蜂黑蜂王臺(tái)病是由蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒（Black queen cell virus, BQCV）引起的蜜蜂疾病，目前在世界范圍內(nèi)均有分布。為檢測(cè)山東省蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒在蜂群中的攜帶情況，本研究對(duì)山東省17地市部分蜂場(chǎng)蜜蜂攜帶BQCV的情況進(jìn)行抽樣調(diào)查，并首次通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法初步對(duì)17地市的蜜蜂樣本進(jìn)行了快速病原學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，山東省17地市的62個(gè)蜂場(chǎng)中有來(lái)自7個(gè)地市的13個(gè)蜂場(chǎng)的蜂群攜帶BQCV，檢出率為4.769%。結(jié)合調(diào)研情況及鑒定結(jié)果，我們還提供了5條可能防御蜜蜂黑蜂王臺(tái)病發(fā)生的措施。希望本研究為有效預(yù)防山東省蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生提供參考。

蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒；RT-PCR；山東省

1 前言

蜜蜂作為自然界中最重要的授粉者[1]，極具社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，近年來(lái)由于受到各種不利環(huán)境脅迫及各種蜜蜂疾病的影響，全球范圍內(nèi)蜜蜂的數(shù)量正逐漸減少[2-4]。蜜蜂病毒病是一種特殊的蜜蜂疾病，不僅與弱勢(shì)蜂群的死亡相關(guān)，還影響蜜蜂的行為、生理及形態(tài)多個(gè)方面，其在多個(gè)國(guó)家都有分布，并在世界范圍內(nèi)快速擴(kuò)散，現(xiàn)已成為世界上引起蜂群損失的主要原因[5-7]。近年來(lái)，蜜蜂病毒病不僅成為養(yǎng)蜂行業(yè)的熱點(diǎn)話(huà)題，也成為養(yǎng)蜂研究的重要課題之一。

蜜蜂黑蜂王臺(tái)病是蜜蜂病毒病的一種，由蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒（Black queen cell virus，BQCV）引起。自2000年完成BQCV的南非株（GenBank:AF183905.1）全基因組測(cè)序以來(lái)，目前NCBI上已收藏7株BQCV的全基因組序列。近年來(lái)蜂產(chǎn)品貿(mào)易的全球化，使BQCV在世界范圍內(nèi)廣泛流行。在分類(lèi)上，BQCV屬于類(lèi)小核糖核酸病毒、雙順?lè)醋硬《究?、蟋蟀麻痹病毒屬[8-10]；在形態(tài)上，BQCV是呈球形的、無(wú)囊膜的、直徑為30 nm的病毒粒子。BQCV傳播廣泛，可感染蜜蜂（蜂王、工蜂、雄蜂）的卵、幼蟲(chóng)、蛹及成蜂，也可以感染不同蜂種甚至非膜翅類(lèi)昆蟲(chóng)。BQCV的傳播方式分為水平傳播及垂直傳播[11]。感染方式為隱性感染[12]，看似健康的蜂群里的蜜蜂可能攜帶BQCV，在各種不利環(huán)境條件下（高溫、低溫、營(yíng)養(yǎng)不良及外敵入侵等），蜜蜂體內(nèi)的BQCV可被激活并快速?gòu)?fù)制，最終導(dǎo)致蜂群大量死亡[3,13]。蜂群的大量死亡不僅給蜂農(nóng)帶來(lái)不可估量的損失，也將影響?zhàn)B蜂相關(guān)的產(chǎn)業(yè)。蜜蜂體內(nèi)攜帶BQCV并不可怕，可怕的是各種環(huán)境壓力導(dǎo)致蜜蜂體內(nèi)BQCV的激活，繼而導(dǎo)致BQCV被大量復(fù)制，最終導(dǎo)致蜂群崩潰。由于蜜蜂黑蜂王臺(tái)病給蜂群帶來(lái)嚴(yán)重危害，近年來(lái)針對(duì)BQCV的研究與日俱增[14-19]。

鑒于蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)病特點(diǎn)及流行性，提前檢測(cè)出蜂群中是否攜帶BQCV，做好預(yù)防措施，及時(shí)切斷BQCV的傳播途徑是必要的。本研究參照Benjeddou 等人設(shè)計(jì)的引物[20]，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR），對(duì)山東省17地市蜂群攜帶BQCV的狀況進(jìn)行調(diào)查，首次報(bào)道了山東省17地市部分蜂場(chǎng)蜜蜂攜帶BQCV的情況，為有效預(yù)防山東省蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生提供參考。

2 材料與方法

2.1 樣品的采集

2016年7 月至2016年11月，我們先后調(diào)研了山東省17個(gè)地市的62個(gè)蜂場(chǎng)，并從蜂場(chǎng)采集蜜蜂樣品，保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)備用。蜂種包括意大利蜜蜂（Apis mellifera）和中華蜜蜂 (Apis cerana cerana)，多數(shù)蜜蜂樣品是意大利蜜蜂，部分是中華蜜蜂。

2.2 試劑

RNAiso plus由TAKARA公司生產(chǎn)；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇由天津市凱通化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；5× All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)由ABM公司生產(chǎn)；EasyTaq?DNA Polymerase、pEASY?-T1 Simple Cloning Vector 及Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell由北京全式金生物生產(chǎn)；Plasmid Mini Kit I由上海拜力生物科技有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。10mm dNTP mixture由生工生物工程（上海）股份有限公司生產(chǎn)。

2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

在本研究中用到的擴(kuò)增BQCV的引物借鑒于Benjeddou 等人設(shè)計(jì)的引物，上游引物（BQCVup）為：5'-TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAA-3'，下游引物（BQCVdown）為：5'-TGGTCAGCTCCCACTAC CTTAAAC-3'[20]，該對(duì)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2.4 樣品 RNA的提取

利用Trizol法提取樣品總RNA。具體步驟如下：液氮研磨采集的蜜蜂樣品至粉末狀，稱(chēng)取0.05~0.1 g粉末至無(wú)RNA酶的1.5 ml離心管里（離心管里事先被分裝了1 ml的RNAiso plus），立即旋渦震蕩1 min，室溫放置5 min；12000 g，4℃離心10 min；取上清至新的1.5 ml離心管里，加入200 μl的氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置3 min用來(lái)沉淀蛋白；12000 g，4℃離心15 min；取上清至新的1.5 ml離心管里，加入500 μl異丙醇用來(lái)沉淀RNA，輕輕地顛倒混勻，室溫放置10 min；12000 g，4℃離心10 min；去上清，加入1 ml預(yù)冷的75%的無(wú)水乙醇，漂洗RNA；7500 g，4℃離心5 min；用真空泵抽去75%的無(wú)水乙醇，室溫放置3 min，使殘留的無(wú)水乙醇盡量揮發(fā)完；加入30 μl的無(wú)RNA酶的水，吸打數(shù)次，溶解RNA，稍離心，保存在-80℃超低溫冰箱內(nèi)備用。

2.5 cDNA第一鏈的合成

用 5× All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)合 成cDNA第 一 鏈。RNA模板加入2 μg，再加入AccuRT Reaction Mix(4X)至兩者的總體積為8 μl；42℃孵育2 min；分別加入 AccRT Rection Stopper (5X) 2 μl，5X All-In-One RT MasterMix 4 μl，Nuclease-free H2O 6 μl，吸打混勻，25℃孵育10 min，42℃孵育15 min，85℃孵育5 min；適當(dāng)離心后，放-20℃冰箱內(nèi)備用。

2.6 PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序

以合成的第一鏈cDNA為模板，建立以下25 μl的反應(yīng)體系：模板1 μl，上游引物1 μl，下游引物 1 μl，10XEasyTaq?Buffer 2.5 μl，10mm dNTP mixture 溶 液 1 μl，EasyTaq?DNA Polymerase 0.25 μl，雙蒸水18.25 μl。反應(yīng)條件為：94℃ 10 min；94℃ 40 s，48℃ 40 s，72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃后延伸10 min。獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備

采集山東農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖的中華蜜蜂，按上述方法提取RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一條鏈，以此為模板，以BQCVup、BQCVdown為引物進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)（產(chǎn)自北京賽智科技有限公司）成像，把含目的條帶的凝膠切下，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物連pEASY?-T1 Simple Cloning Vector。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell。次日挑選陽(yáng)性單克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。目的基因的測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行Nucleotide BLAST，以檢測(cè)目的基因擴(kuò)增的正確性。選取測(cè)序正確的陽(yáng)性單克隆菌的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板。

2.8 檢測(cè)采集的山東省17地市的蜜蜂樣本中BQCV的攜帶情況

首先對(duì)采集的蜜蜂樣本按上面提到的RNA提取方法進(jìn)行RNA的提取，并制備cDNA第一條鏈。用來(lái)檢測(cè)的各蜂場(chǎng)的每個(gè)樣品均由20只蜜蜂組成，用液氮研磨至粉末狀，稱(chēng)取0.05~0.1 g粉末用來(lái)提取RNA，剩余的粉末放-80℃超低溫冰箱備用。在進(jìn)行PCR檢測(cè)時(shí)，每個(gè)樣品做兩個(gè)平行。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，然后用全自動(dòng)凝膠成像儀拍照。陽(yáng)性對(duì)照中模板是質(zhì)粒（上面提到的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板），陰性對(duì)照的模板是雙蒸水，其他反應(yīng)體系及反應(yīng)條件不變。

3 結(jié)果與分析

3.1 體系調(diào)研的基本情況

本研究對(duì)山東省17個(gè)地市（濟(jì)南、青島、淄博、德州、煙臺(tái)、濰坊、日照、萊蕪、菏澤、濱州、濟(jì)寧、泰安、臨沂、聊城、威海、棗莊及東營(yíng)等）的蜂場(chǎng)進(jìn)行抽樣調(diào)查。調(diào)查發(fā)現(xiàn)蜂農(nóng)主要養(yǎng)殖意大利蜜蜂，大部分蜂場(chǎng)有爬蜂現(xiàn)象，多數(shù)蜂場(chǎng)的蜜蜂被感染蜂螨。采集的樣品被帶回實(shí)驗(yàn)室后，先用液氮冷凍，然后立即放入-80℃超低溫冰箱保存。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的獲得

首先將從疑似患有BQCV的蜜蜂中得到的cDNA作為PCR擴(kuò)增的模板，并采用Benjeddou 等人設(shè)計(jì)的引物[20]（該引物已在世界范圍內(nèi)被多人用來(lái)篩選BQCV[21-23]），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示，在選取的7個(gè)模板中，有六個(gè)模板可擴(kuò)出條帶，條帶大小與理論擴(kuò)增片段大小一致。1、3及7號(hào)目的條帶分別被用來(lái)切膠、膠回收，膠回收產(chǎn)物進(jìn)一步被用來(lái)做連接轉(zhuǎn)化，挑選陽(yáng)性單克隆菌測(cè)序。測(cè)序獲得的目的序列在NCBI上Blast，結(jié)果顯示與之同源的核苷酸序列全來(lái)自BQCV。以上結(jié)果表明，我們擴(kuò)出來(lái)的片段就是BQCV的序列。山東農(nóng)業(yè)大學(xué)飼養(yǎng)的中華蜜蜂蜂群購(gòu)自臨沂的某蜂場(chǎng)，在2016年9月份我們從這家蜂場(chǎng)采集的樣品中也檢測(cè)到了BQCV，初步說(shuō)明該蜂場(chǎng)的蜜蜂攜帶BQCV，也進(jìn)一步證實(shí)了我們擴(kuò)出的序列是BQCV的。選取1號(hào)樣品的菌進(jìn)行搖菌，用Plasmid Mini Kit I抽提質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒作為檢測(cè)山東省17地市BQCV存在情況的陽(yáng)性對(duì)照模板。

圖1 BQCV基因PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

3.3 山東省17地市蜂群攜帶BQCV的抽樣調(diào)查結(jié)果

采用RT-PCR初步檢測(cè)采集的蜜蜂樣品中是否含有BQCV。本研究共調(diào)研山東省17地市的62個(gè)蜂場(chǎng)，采集了128份樣品。在山東省17個(gè)地市的62個(gè)蜂場(chǎng)中，有7個(gè)地市（日照、泰安、臨沂、棗莊、濱州、威海和淄博），13個(gè)蜂場(chǎng)的蜂群初步被檢測(cè)到攜帶BQCV，檢出率為4.769%。其中3家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自日照，3家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自泰安，2家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自臨沂，2家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自棗莊，1家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自濱州，1家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自威海，1家蜂場(chǎng)的樣品來(lái)自淄博（表1）。

表1 山東省檢出BQCV的地市的情況

4 討論

蜜蜂黑蜂王臺(tái)病毒的感染方式為隱性感染，這種感染方式不易被觀(guān)察到，直到蜂王幼蟲(chóng)及蛹變黑，巢房房壁變黑時(shí)，才能呈現(xiàn)出可觀(guān)察的現(xiàn)象[19,24]。RT-PCR方法具有快速、特異性強(qiáng)、敏感性高等特點(diǎn)，可用于快速檢測(cè)BQCV的存在，也為快速診斷蜜蜂黑蜂王臺(tái)病提供一種新的途徑。本研究用分子生物學(xué)的手段，用RT-PCR方法初步檢測(cè)了BQCV在山東省17地市的蜂群中攜帶情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在山東省17地市，62個(gè)蜂場(chǎng)中，有來(lái)自泰安、淄博、日照、臨沂、棗莊、濱州、煙臺(tái)和威海等7個(gè)地市的13個(gè)蜂場(chǎng)的蜜蜂初步被檢測(cè)到攜帶BQCV（檢出率為4.769%），在青島、東營(yíng)、濰坊、德州、聊城、萊蕪、濟(jì)南、煙臺(tái)、菏澤及濟(jì)寧的蜂場(chǎng)未檢測(cè)到BQCV的存在。此結(jié)果初步說(shuō)明BQCV在山東省分布并不廣泛。通過(guò)本研究，可以通知被檢測(cè)出BQCV存在的蜂場(chǎng)的蜂農(nóng)加強(qiáng)防御BQCV增殖的意識(shí)，以免造成不必要的損失。值得提出的是，日照嵐山區(qū)部分蜂場(chǎng)的蜜蜂于2016年11月初出現(xiàn)大量死亡的現(xiàn)象，我們?cè)诋?dāng)?shù)厝曳鋱?chǎng)采集了?。ㄋ溃┓錁悠罚?jīng)RT-PCR鑒定顯示：三家蜂場(chǎng)的蜜蜂均攜帶BQCV，相對(duì)于本實(shí)驗(yàn)室所鑒定的其他蜜蜂病原，BQCV的含量還是較強(qiáng)的（數(shù)據(jù)未顯示）。經(jīng)調(diào)研這三家蜂場(chǎng)，發(fā)現(xiàn)蜂農(nóng)對(duì)蜂群飼養(yǎng)管理不規(guī)范，蜂群群勢(shì)弱。本地區(qū)蜜蜂突發(fā)性大量死亡可能原因之一是：這三家蜂場(chǎng)的蜂群本身就攜帶BQCV，只是BQCV的滴度低，不足以引起蜜蜂患病。在各種不利環(huán)境（寒流來(lái)襲及飼料不足等）的影響下，蜜蜂體內(nèi)的BQCV被激活，再加上與其他蜜蜂病原（蜂螨、慢性麻痹病毒、克什米爾病毒及殘翅病毒等）的混合感染，導(dǎo)致蜂群出現(xiàn)大規(guī)模病死現(xiàn)象。蜂群的大量死亡給蜂農(nóng)造成大量損失，也間接影響?zhàn)B蜂行業(yè)，通過(guò)這一事件，我們覺(jué)得有必要加強(qiáng)蜂農(nóng)防御蜜蜂病毒病的意識(shí)。

蜜蜂給我國(guó)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益，然而B(niǎo)QCV導(dǎo)致的蜜蜂急劇死亡也給國(guó)家造成極大經(jīng)濟(jì)損失。鑒于目前還沒(méi)有針對(duì)BQCV的徹底治療方法，因此保持蜂群健康，預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生顯得尤為重要。為減少蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生，以下防御措施可供參考：（1）有效治理狄斯瓦螨（這是保證蜂群健康的最有效的措施）。Chantawannakul等首次報(bào)道了瓦螨可攜帶BQCV[25]。瓦螨的刺吸行為可使寄生在瓦螨身上的病毒粒子進(jìn)入蜜蜂血淋巴，如果瓦螨寄生的是被病毒感染的蜜蜂，那么蜜蜂血淋巴里存在的病毒顆粒也可被瓦螨一塊吸取，繼而造成病毒在不同蜜蜂個(gè)體間傳播。此外，由于生物免疫抑制作用，隱藏在蜜蜂體內(nèi)潛在的病毒可被激活[26,27]。通過(guò)與多位蜂農(nóng)的交談發(fā)現(xiàn)，如果在養(yǎng)蜂的過(guò)程中對(duì)螨防治的好，基本上可以獲得強(qiáng)群，蜂群一般不會(huì)出現(xiàn)不明原因的死亡現(xiàn)象。目前針對(duì)瓦螨的防治已有比較成熟的辦法，因此，可以通過(guò)控制蜂群中的瓦螨來(lái)間接控制蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生。（2） 蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生可能與蜜蜂微孢子蟲(chóng)病有一定的聯(lián)系，當(dāng)與蜜蜂微孢子蟲(chóng)合并感染時(shí)導(dǎo)致極強(qiáng)的致病性，給養(yǎng)蜂業(yè)帶來(lái)巨大損失。蜜蜂微孢子蟲(chóng)病爆發(fā)的高峰期是春季和初夏，因此在春季及初夏可以通過(guò)嚴(yán)格控制蜜蜂微孢子蟲(chóng)病的發(fā)生來(lái)間接防治蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的爆發(fā)[23,28,29]。（3）及時(shí)切斷其他蜜蜂病毒的傳播途徑。由于蜜蜂病毒的多重感染對(duì)蜂群帶來(lái)的損失遠(yuǎn)高于單一感染，勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致弱勢(shì)蜂群的產(chǎn)生，再加上不利環(huán)境的刺激，勢(shì)必使蜜蜂病毒被激活并大量復(fù)制的概率增加[24,30,31]。因此，我們可以定期對(duì)蜂場(chǎng)及蜂場(chǎng)所使用的各種蜂具進(jìn)行消毒，減少各種病毒的增殖，進(jìn)而減少BQCV與其他蜜蜂病毒混合感染的機(jī)會(huì)。切斷各種蜜蜂病毒的傳播途徑，防止蜜蜂受到病毒的多重感染，減少弱勢(shì)蜂群的產(chǎn)生，有利于蜂群抵抗BQCV的侵染。（4）飼養(yǎng)強(qiáng)群，選用年輕的優(yōu)質(zhì)蜂王[4,11]。相比弱群，強(qiáng)群里的蜜蜂有較強(qiáng)的免疫力及抗病性[19,24,30]。在各種不利環(huán)境因子的應(yīng)激壓力下，強(qiáng)群的蜜蜂有更強(qiáng)的適應(yīng)性，潛伏在蜜蜂體內(nèi)的BQCV不易被激活。另外，因蜜蜂病毒可通過(guò)垂直傳播途徑傳給后代，因此選用健康的、不攜帶蜜蜂病毒及抗病能力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)蜂王來(lái)繁育后代，就減少了蜜蜂病毒通過(guò)垂直傳播途徑傳給后代的機(jī)會(huì)。（5）加快研究抗BQCV藥物的步伐。Aurori等提出月桂可做為潛在的治療受BQCV感染的蜂群的抗病毒藥物[16]，這當(dāng)然還要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，隨著科技的發(fā)展，可利用RNA干擾的原理及技術(shù)，制造抗BQCV的藥物用于防治蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生也是可行的。

總之，通過(guò)抽樣調(diào)查及RT-PCR方法，本研究發(fā)現(xiàn)山東省17地市蜂群攜帶BQCV的現(xiàn)象不普遍，此結(jié)果為下一步預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的發(fā)生提供了參考。另外，希望本研究根據(jù)調(diào)研情況及對(duì)查閱文獻(xiàn)的總結(jié)提出的可能預(yù)防蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的方法，能對(duì)蜂農(nóng)了解防治蜜蜂黑蜂王臺(tái)病的方法提供幫助。

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The sampling inspection analysis of black queen cell virus in various cities of Shandong province

Li Guilin1, Wang Ying2, Ma Lanting2, Guo Hengjun1, Xu Baohua2, Guo Xingqi1
(1 State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Taian 271018,China; 2 College of Animal Science and Technology, Shandong Agricultural University, Taian 271018, China)

Black queen cell disease is one of the honeybee diseases that is caused by black queen cell virus (BQCV),which is spread around the world at present. In this paper, some apiaries of seventeen cities in Shandong province was chosen to perform sampling inspection analysis to detect the carrying situation of BQCV in the honeybee of Shandong province, and the selected samples were carried out preliminary rapid pathogen detection by reverse transcription and polymerase chain reaction (RT-PCR) for the fi rst time. The results showed that the honeybee from thirteen apiaries of seven cities was detected carrying BQCV in sixty-two apiaries of seventeen cities in Shandong province. The detection rate was 4.769%. Furthermore, we provide five possible measures to prevent black queen cell disease in this study through combining investigation situation and detection result. We hope that the fi ndings in this paper can provide a reference for the effective prevention of black queen cell disease in Shandong province.

Black queen cell virus; RT-PCR; Shandong province

山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專(zhuān)項(xiàng)基金（No. SDAIT-24-04）

李桂林（1990-），女，碩士研究生，主要從事蜜蜂抗病抗逆分子生物學(xué)研究，E-mail: guilinli1@163.com

郭興啟（1963-），男，教授，博導(dǎo)，E-mail: xqguo@sdau.edu.cn