黃元坤 周志兵 周蕾蕾

AR與Mda9/syntenin在三陰性乳腺癌中的表達及其意義

黃元坤 周志兵 周蕾蕾

目的探討研究雄激素受體(AR)與黑色素瘤分化相關基因9/配體蛋白聚糖結合蛋白(Mda9/syntenin)在三陰性乳腺癌中的表達及其意義。方法80例三陰性乳腺癌組織，采用免疫組織化學法對其AR與syntenin的表達情況檢測，并探討二者與臨床病理特點的關系，采用 Kaplan-Meier生存曲線評價患者無病生存率，COX比例回歸模型進行多變量分析。結果AR陽性表達率為 37.50%，syntenin陽性表達率為98.75%；AR與組織學分級呈負相關性(γs=-0.236，P<0.05)，syntenin與淋巴結轉移狀態(tài)呈正相關性(γs=0.296，P<0.05)，與腫瘤大小呈正相關性(γs=0.370，P<0.05)，與組織學分級也呈現(xiàn)正相關性(γs=0.230，P<0.05)；無病生存者占77.5%(62/80)，AR陰性與AR陽性患者、不同程度AR表達程度與無病生存期(DFS)均無相關性(P>0.05)，而syntenin不同表達程度與DFS存在相關性(P<0.05)；單因素分析顯示：淋巴結轉移是影響DFS的重要因素(P<0.05)，多因素分析顯示淋巴結轉移、腫瘤>5 cm均是DFS危險因素(P<0.05)。結論AR與患者的組織學分級相關、syntenin與組織學分級、淋巴結轉移情況、腫瘤大小呈正相關性，syntenin表達與DFS存在明顯關聯(lián)。

雄激素受體；黑色素瘤分化相關基因9；配體蛋白聚糖結合蛋白；三陰性乳腺癌；臨床病理

近年來乳腺癌發(fā)病率逐年升高，已成為惡性腫瘤致女性死亡的主要因素，其高發(fā)病率和高死亡率已對女性生活質量造成極大威脅[1]。近年來相關研究證實[2]，雄激素受體(AR)與配體蛋白聚糖結合蛋白(syntenin)蛋白表達和三陰性乳腺癌臨床病理特點、臨床預后等均存在一定關聯(lián)，但尚需要深入探究。基于此，本研究特對80例三陰性乳腺癌組織中AR和syntenin表達情況進行檢測，觀察2種蛋白在不同臨床病理特點下表達水平，并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集自2004年12月至2009年12月四川省人民醫(yī)院乳腺外科行改良根治術或保乳手術的80例三陰性乳腺癌患者的石蠟包埋組織塊及臨床資料。納入標準：①經(jīng)乳腺外科行乳腺癌改良根治術或保乳手術并經(jīng)病理及免疫組化證實為三陰性乳腺癌；②病理類型為浸潤性導管癌；③術前未行新輔助化療，且術前未發(fā)現(xiàn)遠處轉移；④石蠟包埋組織塊完好，臨床資料完整。排除標準：①其它類型原發(fā)性惡性腫瘤，乳腺轉移者；②合并其它嚴重內科疾病或系統(tǒng)性疾病者；③存在既往乳房手術史者。所有患者均為女性，年齡31～80歲，平均(52.67±13.32)歲，腫瘤大?。?2 cm 29例、>2 cm且≤5 cm 50例、>5 cm 1例。參照2012年WHO浸潤性乳腺癌分級標準[3]，Ⅰ級5例，Ⅱ級31例，Ⅲ級44例。頸淋巴結未轉移54例，淋巴結無轉移者26例，其中轉移淋巴結≤3枚者13例，≥4且≤9枚者有7例，≥10枚者有6例。

1.2 方法

1.2.1 主要實驗試劑 AR鼠抗人單克隆抗體(AR441)購于中國上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司。兔抗多克隆syntenin抗體(ab19903)購于中國深圳晶美生物科技開發(fā)有限有限公司。EnVision試劑盒購于DAKO公司。

1.2.2 AR和syntenin表達檢測方法 采用免疫組化法對AR和syntenin蛋白表達情況進行檢測，具體如下：①使用福爾馬林(濃度為10%)液固定，常規(guī)切片；②采用Envision免疫組化二步法進行染色：于Poly-Lysine中將待測樣本浸泡5 min，取出后烤干待用，以4 μm厚度連續(xù)切片，完成后將其置于40 ℃恒溫器中，并分別平整粘附于兩張載玻片上；將載玻片置于60 ℃烤箱中120 min后取出，并分別置于二甲苯I和Ⅱ中10 min×2，取出后放入梯度酒精中(濃度分別為100%×2次，90%，80%)，4次×5 min；高壓修復抗原；③放入過氧化氫溶液(濃度為3%)中室溫孵育15 min，分別加入 100～150 μlAR鼠抗人單克隆抗體(一抗)，100～150 μl兔抗多克隆syntenin抗體(稀釋濃度為1∶150)，放入4 ℃冰箱中過夜；④PBS緩沖液沖洗3次×5 min，甩干后滴加100～150 μL即用型酶標二抗，室溫條件下孵化30 min。PBS緩沖液沖洗3次×5 min，甩干后滴加50～100 μlDAB顯色劑，室溫孵育并于適度時終止顯色；⑤蘇木精輕度復染，脫水,透明,封片處理后采用顯微鏡觀察。

1.2.3 結果判讀 ①AR染色結果判讀：以細胞核內呈現(xiàn)棕褐色顆粒沉積記為AR陽性。陽性對照：已知AR陽性切片，陰性對照：PBS代替一抗。隨機選擇5個視野(200倍)，計算陽性腫瘤細胞比率，<5%計為0分，5%～25%計為1分，25%～50%記為2分，≥50%記為3分；染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將陽性細胞比率和染色強度分值總和作為陽性判斷標準，其中0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(++)，3～4分為中等陽性(++)，4分以上為強陽性(+++)；②syntenin染色結果判讀：以胞質呈棕色為syntenin陽性染色。陽性對照：已知陽性的syntenin；陰性對照：PBS代替一抗。隨機選取5個高倍鏡視野(200倍)，染色強度(A)：不染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。染色細胞比率(B)：<5%計為0分，5%～25%計為1分，25%～50%記為2分，≥50%記為3分，將A與B相加再除以5作為評分標準。評分大于50分為syntenin陽性，最終評分0～50分為陰性(-)，51～100分為弱陽性(+)，101～200分為中等陽性(++)，201～300分為強陽性(+++)。

1.3 觀察指標

觀察AR與syntenin在三陰性乳腺癌中的表達情況；分析AR、syntenin與乳腺癌臨床病理特點的相關性；分析AR與syntenin表達情況與患者無病生存期(DFS)的關系；分析AR、syntenin及各個臨床參數(shù)與DFS的關系。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 20.0國際專用統(tǒng)計學軟件，采用spearman相關分析確定AR與syntenin表達情況和臨床病理特點的相關性，并利用Kaplan-Meier生存曲線評價無病生存率，另采用COX比例風險回歸模型行多因素分析。

2 結果

2.1 AR與syntenin在三陰性乳腺癌中的表達情況

在80例中30(37.50%)例AR 表達陽性。有79(98.75%)例syntenin表達陽性。

2.2 AR、syntenin表達與乳腺癌臨床病理特點的相關性

AR表達與組織學分級呈負相關性(γs=-0.236，P<0.05)，與淋巴結、年齡、組織學分級均無相關性(P>0.05)；syntenin與淋巴結轉移狀態(tài)呈正相關性(γs=0.296，P<0.05)，與腫瘤大小呈正相關性(γs=0.370，P<0.05)，與組織學分級也呈現(xiàn)正相關性(γs=0.230，P<0.05)，與年齡無相關性(P>0.05)，見表1。

表1 AR和sytenin蛋白表達與三陰性乳腺癌臨床病理特點的相關性/例

2.3 AR與syntenin表達與患者DFS的關系

80例患者均隨訪至2013年12月，隨訪率為100%，平均隨訪時間(57.26±10.21)個月，其中有18例患者出現(xiàn)復發(fā)或轉移：3例骨轉移，7例局部復發(fā)。9例死亡，死亡率為11.25%。無病生存者占77.5%(62/80)，AR陰性與AR陽性患者DFS的關系見圖1(χ2=0.480，P=0.489)；不同程度AR表達與DFS的關系見圖2(χ2=0.240，P=0.076)；syntenin不同表達程度與DFS的關系見圖3(χ2=4.825，P=0.027)。

2.4 單因素分析

淋巴結轉移是影響DFS的重要因素(χ2=27.358,P=0.0001)，而年齡、腫瘤大小、病理分級、AR表達、syntenin表達與DFS并無明顯相關性(P>0.05)，見表2。

2.5 多變量回歸分析

淋巴結轉移是獨立影響患者DFS的因素(P<0.05)， 且腫瘤直徑>5 cm為DFS的危險因素(P<0.05)，見表3。

3 討論

三陰性乳腺癌者具有特殊的病理特點及臨床表現(xiàn)，常有中央壞死及推擠性邊緣，且增殖活性較高。此類乳腺癌往往易復發(fā)、預后差。據(jù)報道，三陰性乳腺癌患者5年無轉移生存率約為70.9%，且三陰性乳腺癌手術切除后復發(fā)時間較其他類型乳腺癌明顯縮短[4-5]。目前針對三陰性乳腺癌尚缺乏有效的靶向治療，難以取得滿意療效。因此對三陰性乳腺癌病理研究可為臨床治療提供全新方案[6]。本研究對AR與syntenin和三陰性乳腺癌病理特點進行相關分析，同時研究二者表達情況對DFS的影響，以期為該病臨床治療提供全新思路和方向。

圖1 AR陰性與AR陽性患者DFS的關系

圖2 不同程度AR表達與DFS的關系

圖3 不同程度syntenin表達與DFS的關系

臨床病理特征DFS/%χ2P年齡0.5060.477 ≤50歲18.92 >5025.58腫瘤大小5.0560.080 ≤2cm13.79 >2cm,≤5cm26.00 >5cm100淋巴結轉移27.358<0.0001 無5.56 有57.69病理分級2.060.151 Ⅰ0.00 Ⅱ18.52 Ⅲ28.26AR10.4780.489 -80.00 +73.33AR20.0110.916 (-)、(+)77.27 (++)和(+++)78.57Syntenin10.2940.588 -100.00 +77.22Syntenin23.8240.051 (-)、(+)94.44 (++)和(+++)72.58

3.1 AR與乳腺癌的關系

AR在乳腺癌的發(fā)展過程中作用顯著，但是確切的機制并不清楚。目前關于AR在三陰性乳腺癌中表達及臨床意義尚未得出統(tǒng)一意見。Agoff等在ER陰性的乳腺癌中通過單變量分析發(fā)現(xiàn)[7]，AR是 DFS的重要預后因子，但是多變量分析中發(fā)現(xiàn)兩者無明顯關聯(lián)。Rakha等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在有淋巴結轉移的三陰性乳腺癌中，AR陰性表達者局部復發(fā)和遠處轉移率明顯較無淋巴結轉移者升高。Hu等發(fā)現(xiàn)[9]，在三陰性乳腺癌中AR陽性表達者死亡率增高，但在Ivana等研究中發(fā)現(xiàn)AR與DFS和(或)OS無關。本研究發(fā)現(xiàn)AR與組織學分級呈現(xiàn)負相關性，但AR與年齡、腫瘤大小、淋巴結情況并無關系。采用多因素分析發(fā)現(xiàn)AR表達情況與患者的DFS無相關性，此結果可能與本研究樣本量不多有關。

3.2 syntenin與乳腺癌的關系

黑色素瘤分化相關基因9(Mda-9)具有PDZ-1和 PDZ-2結構域，并被重新命名為syntenin[10]。Mda-9/syntenin在不同的細胞中過表達將誘導形成褶皺、中板偽足、擴展和軸突樣結構，對質膜結構和功能調整意義重大。通過促使MCF-7或Az-521中mda-9過表達后，可明顯增強侵襲和轉移的能力[11-12]。相關研究指出[13]，syntenin在多種惡性腫瘤組織中表達明顯上調，同時可能參與調節(jié)腫瘤侵襲和轉移能力，推測mda-9/syntenin可能對粘著斑激酶(FAK)磷酸化有重要促進作用，并且可激活P38絲裂原激活蛋白激酶(P38 MAPK)和c-JNK表達。國內有研究通過對160例乳腺癌組織采用免疫乳化法檢測SDCBP陽性表達，發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌組中syntenin表達明顯增強，且其表達水平與病理分級、腫瘤組織TNM分期呈正相關性，提示該蛋白表達水平和三陰性乳腺癌患者病理分級及腫瘤分期均存在一定關聯(lián)，可據(jù)此評估病情[14]。本研究結果中，syntenin陽性表達率為98.75%，且其表達水平和淋巴結轉移、腫瘤大小、組織學分級均存在緊密關聯(lián)。與前文研究結論一致，表明在三陰乳腺癌中syntenin高表達很可能預示著不良預后。此外，本研究發(fā)現(xiàn)不同syntenin表達和DFS存在明顯關聯(lián)，提示syntenin可能對于患者生存期具有重要決定作用。

綜上所述，syntenin與三陰性乳腺癌患者組織學分級、淋巴結轉移、腫瘤大小呈正相關性，推測syntenin高水平表達可能和與侵襲能力增強有關。AR與組織學分級相關，但和其它臨床特點均無明顯關聯(lián)。AR表達和DFS均無相關性，而syntenin表達和DFS存在明顯關聯(lián)，推測后者可能對患者生存期有重要影響，但尚需要進一步探討研究。

表3 多變量分析DFS的結果

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ExpressionandSignificanceofARandMda9/syntenininTripleNegativeBreastCancer

HUANGYuankun,ZHOUZhibing,ZHOULeilei.

ChengduFifthPeople'sHospital,Chengdu,611130

ObjectiveTo study the expression and significance of androgen receptor (AR) and ligand binding protein (Mda9/syntenin) in triple negative breast cancer.MethodsExpression of AR and Mda9/syntenin in 80 cases of triple negative breast cancer tissues were detected by immunohistochemical method,and the relationships with clinical pathological characteristics were analyzed.The Kaplan-Meier survival curve was used to evaluate the disease free survival rate of patients,and the COX proportional regression model were used to carry out multivariate analysis.ResultsThe positive expression rate of AR was 37.50%,and the positive expression rate of syntenin was 98.75%.The expression of AR was negatively related with histological grading (γs=-0.236,P<0.05),while the expression of syntenin was positively related with lymph node metastasis (γs=0.296,P<0.05),and positively related with tumor size (γs=0.370,P<0.05),as well as with histological grading (γs=0.230,P<0.05).The disease free survival accounted for 77.5%(62/80).There had no significant differences in disease free survival (DFS) between the AR negative and AR positive patients,and different degrees of AR expression (P>0.05),while the different degrees of syntenin expressions were significantly correlated with DFS (P<0.05).The single factor analysis showed that lymph node metastasis was an important factor affecting the DFS (P<0.05),and the multi-factor analysis showed that both lymph node metastasis and tumor larger than 5cm were risk factors affecting DFS (P<0.05).ConclusionThe expression of AR is related with histological grading,and the expression of syntenin is positively related with histological grading,lymph node metastasis and tumor size,which is obviously related with DFS.

Androgen receptor (AR);Melanoma differentiation associated gene 9(Mda9);Ligand binding protein(syntenin);Triple negative breast cancer;Clinical pathology

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1763～1767)

611130 成都市第五人民醫(yī)院(黃元坤)；330000 南昌市第三人民醫(yī)院(周志兵)；610072 四川省人民醫(yī)院(周蕾蕾)

周蕾蕾

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.11.007

R737.9

A

1001-5930(2017)11-1763-05

2016-10-09

2017-07-10)

(編輯：吳小紅)