孫龍華，章淑芳，羅來恒，涂長英，陳建建

(南昌市中西醫(yī)結合醫(yī)院呼吸內科，南昌 330003)

解毒扶正散對非小細胞肺癌免疫微環(huán)境的影響

孫龍華，章淑芳，羅來恒，涂長英，陳建建

(南昌市中西醫(yī)結合醫(yī)院呼吸內科，南昌 330003)

目的探討非小細胞肺癌患者經中醫(yī)方劑解毒扶正治療后腫瘤免疫微環(huán)境相關細胞因子的變化，探索中醫(yī)藥治療非小細胞肺癌的作用機制。方法將60非小細胞肺癌患者按隨機數字表法分為治療組和對照組：治療組30例，采用化療+解毒扶正散治療；對照組30例，采用單純化療方案，共2個療程，每個療程28 d。采用ELISA檢測2組患者外周血中干擾素(IFN-γ)、白細胞介素2(IL-2)、轉化生長因子-β(TGF-β)的水平，采用流式細胞儀檢測2組患者CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的比例。結果治療組和對照組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療組較對照組血漿中IFN-γ、IL-2水平提高，CD4+CD25+調節(jié)性T細胞比例提高，TGF-β水平降低，差異均有統計學意義(均P<0.05)。結論解毒扶正散對非小細胞肺癌患者機體免疫功能調節(jié)具有一定的作用，可改善非小細胞肺癌患者腫瘤免疫微環(huán)境，為今后開展大樣本、前瞻性臨床研究提供了新的佐證。

解毒扶正散； 非小細胞肺癌； 腫瘤微環(huán)境

肺癌是我國癌癥發(fā)病率首位的惡性腫瘤死亡原因，發(fā)病率及死亡率仍然在繼續(xù)上升，在過去的30年內，我國肺癌死亡率增長迅速，分別增長了465%，肺癌死亡人數占所有惡性腫瘤死亡人數的22.7%，在2008年肺癌已經取代肝癌成為中國死亡人數最高的腫瘤[1]。傳統中醫(yī)學認為肺癌的發(fā)病機理是正氣虛損，陰陽失調從而導致邪氣乘虛入肺及肺臟功能失調、肺氣壅塞、氣血瘀滯。影響津液輸布，導致痰濕內蘊、郁久化熱成毒，積于兩肺而成肺癌。因此，傳統中醫(yī)藥在治療肺癌中多以扶正、活血化瘀、清熱、解毒等祛邪為主。肺癌的生長不僅受到腫瘤自身遺傳學和生物學的調控，而且受到肺癌所處微環(huán)境的影響。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞和相鄰正常組織之間部位，是由細胞外基質、可溶性分子和腫瘤基質細胞所組成。腫瘤微環(huán)境對腫瘤增殖生長、侵襲、轉移以及新生血管的形成具有重要影響，研究腫瘤微環(huán)境已經成為當今腫瘤防治中的一大熱點。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2014年8月至2017年1月間南昌市中西醫(yī)結合醫(yī)院呼吸內科初診初治非小細胞肺癌患者60例，所有患者不合并自身免疫性疾病，均經病理組織證實為非小細胞肺癌。有吸煙史30例。將60例患者按隨機數字表法分為治療組和對照組，2組患者性別、年齡、病程比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 非小細胞肺癌患者臨床特點

1.2 治療方法

所有入選患者均獲得知情同意。治療組治療方法是化療方案上加上解毒扶正散方劑，該方劑由解毒草、仙鶴草、青天葵、生龍骨、野菊花、白花舌蛇草、黃芪和白術組成，每日1劑，每劑藥煎成2袋，每袋120 mL，分早晚2次頓服，連續(xù)服用56 d。

1.3 主要儀器與試劑檢測方法

Bio-Rad550分光光度儀(美國Bio-Rad公司)；FACS Calibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司)；淋巴細胞分離液(上海精誠化學試劑有限公司)；TGF-β、IL-2、INF-γ的ELISA試劑盒(北京天根生物技術公司)。

1.4 標本處理

采集肺癌患者空腹狀態(tài)下的外周血約4 mL，每份2 mL。一份離心后取血清保存于-20 ℃冰箱中，用于檢測TGF-β、IL-2、INF-γ。另外一份用肝素抗凝，采用淋巴計數分離液分離外周血單個核細胞，計數細胞后調整細胞濃度至1×106～2×106以流式細胞檢測CD4+CD25+調節(jié)性T細胞。

1.5 流式細胞儀檢測CD4+CD25+調節(jié)性T細胞的比例(%)

取100 μL人外周血單個核淋巴細胞加入Ep管中,分別加入10 μL FITC標記的鼠抗人CD4、PE標記的CD25抗體,避光孵育30 min后加入PBS洗滌2次，水平離心2000 r×5 min,棄上清,加入500 μL PBS重懸細胞后用流式細胞儀檢測。

1.6 TGF-β、IL-2、IFN-γ檢測

分別取肺癌患者血清約100 μL加入待測孔，反應板充分混勻后37 ℃下放置120 min，洗滌液洗滌反應板4～6次后每孔加入第一抗體工作液50 μL，37 ℃下放置60 min,洗板后每孔加入酶標抗體工作液100 μL，37 ℃下放置60 min，洗板后每孔加入底物工作液100 μL,37 ℃暗處反應5～10 min，每孔加1滴終止液混勻后于450 nm處吸光值。分別與TGF-β、IL-2和IFN-γ的標準曲線圖上根據樣品的OD值查出相應的TGF-β、IL-2和IFN-γ值。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 2組患者在治療結束后外周血中CD4+CD25+調節(jié)性T細胞比例

治療結束后治療組非小細胞肺癌患者外周血CD4+CD25+調節(jié)性TCD4+T細胞比例為(48.00±14.67)%，而對照組治療結束后外周血CD4+CD25+調節(jié)性TCD4+T細胞比例為(37.03±16.20)%，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

2.2 2組治療后外周血中TGF-β、IL-2、IFN-γ檢測結果比較

治療結束之后治療組、對照組中非小細胞肺癌患者外周血中TGF-β水平分別為(47.03±10.80)pg·mL-1和(68.09±9.83)pg·mL-1,IL-2水平分別為(31.03±0.62)pg·mL-1和(18.00±0.42)pg·mL-1,IFN-γ水平分別為(33.93±1.89)pg·mL-1和(23.03±10.87)pg·mL-1。治療后2組患者外周血中TGF-β、IL-2、IFN-γ水平比較差異均有統計學意義(均P<0.05)，見表2。

組別nCD4+CD25+T細胞比例/%IL-2ρ/(pg·mL-1)TGF-βρ/(pg·mL-1)IFN-γρ/(pg·mL-1)治療組3048．00±14．6731．03±0．6247．03±10．8033．93±1．89對照組3037．03±16．20#18．00±0．42#68．09±9．83#23．03±10．87#

#P<0.05與治療組相比。

3 討論

隨著我國社會經濟的發(fā)展以及人口老齡化，惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸上升，癌癥已成為人類健康的第一殺手。2016年世界腫瘤頂級期刊(Cancer J Clin)發(fā)表了我國國家癌癥中心Chen等[2]的文章，數據顯示我國2015年共有429.2萬新發(fā)腫瘤病例和281.4萬癌癥死亡病例。其中肺癌的發(fā)病率最高，并且死亡率也是排在各種腫瘤之首。肺癌是所有癌癥死亡的首要因素，占所有癌癥的17%，肺癌死亡率較高，究其原因是大多數肺癌癌細胞很快對化療藥物出現耐藥，甚至對治療出現抵制作用，盡管近20年來隨著顯微外科、放療、免疫治療、化療及分子靶向藥物治療的顯著提高，肺癌的治療技術有著突飛猛進的發(fā)展，即便如此發(fā)達國家肺癌的5年生存率也僅僅維持在11%～16%的水平[3]。

Hanahan等[4]在2000年基于腫瘤細胞內信號變化，提出生長信號、凋亡信號、復制潛能、侵襲轉移等惡性腫瘤六大特征，強調腫瘤細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中處于核心地位。10年后，Hanahan等[5]又在Cell雜志發(fā)表文章，提出腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅取決于腫瘤細胞本身，而且及其以來腫瘤細胞生存的土壤也就是腫瘤微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境也是腫瘤的一個顯著特征。腫瘤微環(huán)境一旦形成，諸多免疫細胞及分子大量聚集共同促進腫瘤免疫逃逸、腫瘤生長及轉移。最近研究表明,腫瘤微環(huán)境內的免疫耐受是導致這種情況發(fā)生的最關鍵原因[6]。腫瘤微環(huán)境作為腫瘤免疫效應階段的執(zhí)行場所,其內存在許多因素參與腫瘤組織與免疫系統的相互作用,包括局部效應細胞功能障礙、抑制性免疫調節(jié)細胞Treg、細胞因子的免疫負調節(jié)作用、抑制性配體受體反應以及腫瘤微環(huán)境中T細胞代謝活性的負調節(jié)等[7]。在腫瘤微環(huán)境免疫抑制網絡中TGF-β處于關鍵地位，腫瘤細胞、肌成纖維細胞、髓系來源抑制細胞、腫瘤相關巨噬細胞以及調節(jié)性T細胞等均可分泌高水平的TGF-β，而TGF-β可促進微環(huán)境中成纖維細胞的趨化和活化，激活免疫細胞與基質上皮細胞的對話，促進上皮-間質轉型，并能誘導多種細胞因子的表達比如VEGF、金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、負調控金屬蛋白酶抑制因子，促進血管形成，最終導致腫瘤微環(huán)境改變，使其有利于腫瘤的浸潤轉移，血漿中增高的TGF-β水平常與腫瘤轉移及不良預后相關[8]。CD4+CD25+T細胞(Treg)是一類免疫調節(jié)細胞,由胸腺產生,表達L-10等免疫抑制因子,細胞表面表達L-2受體α鏈(CD25)，本身不產生L-2。Treg細胞主要是通過細胞-細胞接觸依賴方式發(fā)揮免疫抑制作用,在調控自身免疫性疾病的發(fā)生、炎癥反應和T細胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[9]。研究結果顯示Treg細胞廣泛存在于多種腫瘤組織中,并且起到免疫抑制作用,而在腫瘤組織微環(huán)境中消除該類細胞，則在一定程度上可抑制腫瘤的發(fā)展[10]。本研究表明，解毒扶正散能夠降低腫瘤患者外周血中TGF-β水平，提高CD4+CD25+T細胞比例，也有類似研究表明中醫(yī)藥方能夠抑制非小細胞肺癌細胞中TGF-β水平從而抑制上皮間質轉化來調控肺癌轉移[11]。

中醫(yī)藥在腫瘤防治中有重要地位，具有改善癥狀、提高生活質量、穩(wěn)定病灶等諸多作用。本院呼吸科根據中醫(yī)經典著作《素問·刺法論》有云：“正氣存內，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”，肺癌發(fā)病機理是全身的正氣不足，外邪入侵，同時又有局部的熱毒內聚、痰凝氣滯、瘀阻脈絡，而我省地處南方，夏天濕熱氣候比較容易導致人體的陽熱偏盛而發(fā)病。筆者提出在治療肺癌時應在扶正的基礎上，重視對熱毒的清除，研制出肺癌治療的協定處方解毒扶正散(由解毒草、仙鶴草、青天葵、生龍骨、野菊花、白花舌蛇草、黃芪和白術組成)，該方具有益氣扶正、清熱解毒、化痰散結、祛瘀通絡的功效,方中解毒草、野菊花和仙鶴草均可清熱解毒，青天葵清肺止咳、散瘀消腫，黃芪補中益氣，生龍骨安神潛陽、白花舌蛇草清熱、利濕、解毒和抗癌。更主要的是解毒草、仙鶴草、青天葵、生龍骨、野菊花、白花舌蛇草均具有寒涼收斂之性，而現代藥理研究發(fā)現，清熱解毒可抑制腫瘤細胞增殖且能夠誘導腫瘤細胞凋亡、調節(jié)免疫及細胞信號通路發(fā)揮多途徑多靶點抗腫瘤作用[12]。中醫(yī)理論認為清熱解毒藥物與腫瘤具有不受控制的向外生長浸潤和轉移的“陽熱特性”相反。

筆者通過化療聯合解毒扶正散治療非小細胞肺癌，發(fā)現解毒扶正散能夠提高INF-γ、IL-2水平及CD4+CD25+T細胞比例，而降低TGF-β水平，說明解毒扶正散可能具有干預微環(huán)境改善肺癌免疫抑制狀態(tài)的作用。本課題通過干預非小細胞肺癌的免疫微環(huán)境，尋求經濟低廉、毒副作用小、療效好的免疫治療方法，以提高肺癌綜合治療的水平，為中西醫(yī)結合治療肺癌提供新的思路。

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EffectofJieduFuzhengSanonTumorImmuneMicroenvironmentofNon-SmallCellLungCancer

SUNLong-hua，ZHANGShu-fang，LUOLai-heng，TUZhang-ying，CHENJian-jian

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchangHospitalofIntegrativeTraditionalChineseandWesternMedicine,Nanchang330003,China)

ObjectiveTo investigate the changes in cytokines in tumor immune microenvironment of non-small cell lung cancer(NSCLC) after treatment with Jiedu Fuzheng San,and to explore the mechanism of action of traditional Chinese medicine for NSCLC.MethodsSixty NSCLC patients were randomly given chemotherapy alone(control group,n=30) or in combination with 2 courses of 28-day Jiedu Fuzheng San treatment(treatment group,n=30).The levels of interferon-γ(IFN-γ),interleukin-2(IL-2) and transforming growth factor-β(TGF-β) in peripheral blood were measured by ELISA.The proportion of CD4+CD25+T cells was analyzed by flow cytometry.ResultsThere were no significant differences in gender and age between the two groups(P>0.05).Compared with control group,the levels of IFN-γ and IL-2 and proportion of CD4+CD25+T cells increased but the levels of TGF-β decreased in treatment group(P<0.05).ConclusionJiedu Fuzheng San can regulate immune function and tumor microenvironment in patients with NSCLC.These results provide new evidence for prospective and controlled clinical trial.

Jiedu Fuzheng San; non-small cell lung cancer; tumor microenvironment

2017-08-18

江西省自然科學基金(20151BAB205036)；江西省衛(wèi)生計生委中醫(yī)藥科研課題(贛衛(wèi)中醫(yī)字【2015】21號2015A026；贛衛(wèi)科教字【2015】26號20167035)

孫龍華(1982—)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌、COPD研究。

R734.2

A

1009-8194(2017)10-0001-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.10.001

劉大仁)