孫龍華，章淑芳，羅來(lái)恒，涂長(zhǎng)英，陳建建

(南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌 330003)

解毒扶正散對(duì)非小細(xì)胞肺癌免疫微環(huán)境的影響

孫龍華，章淑芳，羅來(lái)恒，涂長(zhǎng)英，陳建建

(南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科，南昌 330003)

目的探討非小細(xì)胞肺癌患者經(jīng)中醫(yī)方劑解毒扶正治療后腫瘤免疫微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞因子的變化，探索中醫(yī)藥治療非小細(xì)胞肺癌的作用機(jī)制。方法將60非小細(xì)胞肺癌患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對(duì)照組：治療組30例，采用化療+解毒扶正散治療；對(duì)照組30例，采用單純化療方案，共2個(gè)療程，每個(gè)療程28 d。采用ELISA檢測(cè)2組患者外周血中干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)的水平，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)2組患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。結(jié)果治療組和對(duì)照組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療組較對(duì)照組血漿中IFN-γ、IL-2水平提高，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例提高，TGF-β水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論解毒扶正散對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)具有一定的作用，可改善非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤免疫微環(huán)境，為今后開(kāi)展大樣本、前瞻性臨床研究提供了新的佐證。

解毒扶正散； 非小細(xì)胞肺癌； 腫瘤微環(huán)境

肺癌是我國(guó)癌癥發(fā)病率首位的惡性腫瘤死亡原因，發(fā)病率及死亡率仍然在繼續(xù)上升，在過(guò)去的30年內(nèi)，我國(guó)肺癌死亡率增長(zhǎng)迅速，分別增長(zhǎng)了465%，肺癌死亡人數(shù)占所有惡性腫瘤死亡人數(shù)的22.7%，在2008年肺癌已經(jīng)取代肝癌成為中國(guó)死亡人數(shù)最高的腫瘤[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌的發(fā)病機(jī)理是正氣虛損，陰陽(yáng)失調(diào)從而導(dǎo)致邪氣乘虛入肺及肺臟功能失調(diào)、肺氣壅塞、氣血瘀滯。影響津液輸布，導(dǎo)致痰濕內(nèi)蘊(yùn)、郁久化熱成毒，積于兩肺而成肺癌。因此，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療肺癌中多以扶正、活血化瘀、清熱、解毒等祛邪為主。肺癌的生長(zhǎng)不僅受到腫瘤自身遺傳學(xué)和生物學(xué)的調(diào)控，而且受到肺癌所處微環(huán)境的影響。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞和相鄰正常組織之間部位，是由細(xì)胞外基質(zhì)、可溶性分子和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞所組成。腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤增殖生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移以及新生血管的形成具有重要影響，研究腫瘤微環(huán)境已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤防治中的一大熱點(diǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年8月至2017年1月間南昌市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院呼吸內(nèi)科初診初治非小細(xì)胞肺癌患者60例，所有患者不合并自身免疫性疾病，均經(jīng)病理組織證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌。有吸煙史30例。將60例患者按隨機(jī)數(shù)字表法分為治療組和對(duì)照組，2組患者性別、年齡、病程比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者臨床特點(diǎn)

1.2 治療方法

所有入選患者均獲得知情同意。治療組治療方法是化療方案上加上解毒扶正散方劑，該方劑由解毒草、仙鶴草、青天葵、生龍骨、野菊花、白花舌蛇草、黃芪和白術(shù)組成，每日1劑，每劑藥煎成2袋，每袋120 mL，分早晚2次頓服，連續(xù)服用56 d。

1.3 主要儀器與試劑檢測(cè)方法

Bio-Rad550分光光度儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；FACS Calibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司)；淋巴細(xì)胞分離液(上海精誠(chéng)化學(xué)試劑有限公司)；TGF-β、IL-2、INF-γ的ELISA試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)。

1.4 標(biāo)本處理

采集肺癌患者空腹?fàn)顟B(tài)下的外周血約4 mL，每份2 mL。一份離心后取血清保存于-20 ℃冰箱中，用于檢測(cè)TGF-β、IL-2、INF-γ。另外一份用肝素抗凝，采用淋巴計(jì)數(shù)分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106～2×106以流式細(xì)胞檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例(%)

取100 μL人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞加入Ep管中,分別加入10 μL FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4、PE標(biāo)記的CD25抗體,避光孵育30 min后加入PBS洗滌2次，水平離心2000 r×5 min,棄上清,加入500 μL PBS重懸細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6 TGF-β、IL-2、IFN-γ檢測(cè)

分別取肺癌患者血清約100 μL加入待測(cè)孔，反應(yīng)板充分混勻后37 ℃下放置120 min，洗滌液洗滌反應(yīng)板4～6次后每孔加入第一抗體工作液50 μL，37 ℃下放置60 min,洗板后每孔加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，37 ℃下放置60 min，洗板后每孔加入底物工作液100 μL,37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min，每孔加1滴終止液混勻后于450 nm處吸光值。分別與TGF-β、IL-2和IFN-γ的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖上根據(jù)樣品的OD值查出相應(yīng)的TGF-β、IL-2和IFN-γ值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2組患者在治療結(jié)束后外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例

治療結(jié)束后治療組非小細(xì)胞肺癌患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性TCD4+T細(xì)胞比例為(48.00±14.67)%，而對(duì)照組治療結(jié)束后外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性TCD4+T細(xì)胞比例為(37.03±16.20)%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 2組治療后外周血中TGF-β、IL-2、IFN-γ檢測(cè)結(jié)果比較

治療結(jié)束之后治療組、對(duì)照組中非小細(xì)胞肺癌患者外周血中TGF-β水平分別為(47.03±10.80)pg·mL-1和(68.09±9.83)pg·mL-1,IL-2水平分別為(31.03±0.62)pg·mL-1和(18.00±0.42)pg·mL-1,IFN-γ水平分別為(33.93±1.89)pg·mL-1和(23.03±10.87)pg·mL-1。治療后2組患者外周血中TGF-β、IL-2、IFN-γ水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表2。

組別nCD4+CD25+T細(xì)胞比例/%IL-2ρ/(pg·mL-1)TGF-βρ/(pg·mL-1)IFN-γρ/(pg·mL-1)治療組3048．00±14．6731．03±0．6247．03±10．8033．93±1．89對(duì)照組3037．03±16．20#18．00±0．42#68．09±9．83#23．03±10．87#

#P<0.05與治療組相比。

3 討論

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及人口老齡化，惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸上升，癌癥已成為人類健康的第一殺手。2016年世界腫瘤頂級(jí)期刊(Cancer J Clin)發(fā)表了我國(guó)國(guó)家癌癥中心Chen等[2]的文章，數(shù)據(jù)顯示我國(guó)2015年共有429.2萬(wàn)新發(fā)腫瘤病例和281.4萬(wàn)癌癥死亡病例。其中肺癌的發(fā)病率最高，并且死亡率也是排在各種腫瘤之首。肺癌是所有癌癥死亡的首要因素，占所有癌癥的17%，肺癌死亡率較高，究其原因是大多數(shù)肺癌癌細(xì)胞很快對(duì)化療藥物出現(xiàn)耐藥，甚至對(duì)治療出現(xiàn)抵制作用，盡管近20年來(lái)隨著顯微外科、放療、免疫治療、化療及分子靶向藥物治療的顯著提高，肺癌的治療技術(shù)有著突飛猛進(jìn)的發(fā)展，即便如此發(fā)達(dá)國(guó)家肺癌的5年生存率也僅僅維持在11%～16%的水平[3]。

Hanahan等[4]在2000年基于腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號(hào)變化，提出生長(zhǎng)信號(hào)、凋亡信號(hào)、復(fù)制潛能、侵襲轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤六大特征，強(qiáng)調(diào)腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中處于核心地位。10年后，Hanahan等[5]又在Cell雜志發(fā)表文章，提出腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，而且及其以來(lái)腫瘤細(xì)胞生存的土壤也就是腫瘤微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境也是腫瘤的一個(gè)顯著特征。腫瘤微環(huán)境一旦形成，諸多免疫細(xì)胞及分子大量聚集共同促進(jìn)腫瘤免疫逃逸、腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。最近研究表明,腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫耐受是導(dǎo)致這種情況發(fā)生的最關(guān)鍵原因[6]。腫瘤微環(huán)境作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場(chǎng)所,其內(nèi)存在許多因素參與腫瘤組織與免疫系統(tǒng)的相互作用,包括局部效應(yīng)細(xì)胞功能障礙、抑制性免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Treg、細(xì)胞因子的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用、抑制性配體受體反應(yīng)以及腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞代謝活性的負(fù)調(diào)節(jié)等[7]。在腫瘤微環(huán)境免疫抑制網(wǎng)絡(luò)中TGF-β處于關(guān)鍵地位，腫瘤細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、髓系來(lái)源抑制細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞等均可分泌高水平的TGF-β，而TGF-β可促進(jìn)微環(huán)境中成纖維細(xì)胞的趨化和活化，激活免疫細(xì)胞與基質(zhì)上皮細(xì)胞的對(duì)話，促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型，并能誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的表達(dá)比如VEGF、金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9、負(fù)調(diào)控金屬蛋白酶抑制因子，促進(jìn)血管形成，最終導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境改變，使其有利于腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，血漿中增高的TGF-β水平常與腫瘤轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)[8]。CD4+CD25+T細(xì)胞(Treg)是一類免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞,由胸腺產(chǎn)生,表達(dá)L-10等免疫抑制因子,細(xì)胞表面表達(dá)L-2受體α鏈(CD25)，本身不產(chǎn)生L-2。Treg細(xì)胞主要是通過(guò)細(xì)胞-細(xì)胞接觸依賴方式發(fā)揮免疫抑制作用,在調(diào)控自身免疫性疾病的發(fā)生、炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[9]。研究結(jié)果顯示Treg細(xì)胞廣泛存在于多種腫瘤組織中,并且起到免疫抑制作用,而在腫瘤組織微環(huán)境中消除該類細(xì)胞，則在一定程度上可抑制腫瘤的發(fā)展[10]。本研究表明，解毒扶正散能夠降低腫瘤患者外周血中TGF-β水平，提高CD4+CD25+T細(xì)胞比例，也有類似研究表明中醫(yī)藥方能夠抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中TGF-β水平從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來(lái)調(diào)控肺癌轉(zhuǎn)移[11]。

中醫(yī)藥在腫瘤防治中有重要地位，具有改善癥狀、提高生活質(zhì)量、穩(wěn)定病灶等諸多作用。本院呼吸科根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典著作《素問(wèn)·刺法論》有云：“正氣存內(nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”，肺癌發(fā)病機(jī)理是全身的正氣不足，外邪入侵，同時(shí)又有局部的熱毒內(nèi)聚、痰凝氣滯、瘀阻脈絡(luò)，而我省地處南方，夏天濕熱氣候比較容易導(dǎo)致人體的陽(yáng)熱偏盛而發(fā)病。筆者提出在治療肺癌時(shí)應(yīng)在扶正的基礎(chǔ)上，重視對(duì)熱毒的清除，研制出肺癌治療的協(xié)定處方解毒扶正散(由解毒草、仙鶴草、青天葵、生龍骨、野菊花、白花舌蛇草、黃芪和白術(shù)組成)，該方具有益氣扶正、清熱解毒、化痰散結(jié)、祛瘀通絡(luò)的功效,方中解毒草、野菊花和仙鶴草均可清熱解毒，青天葵清肺止咳、散瘀消腫，黃芪補(bǔ)中益氣，生龍骨安神潛陽(yáng)、白花舌蛇草清熱、利濕、解毒和抗癌。更主要的是解毒草、仙鶴草、青天葵、生龍骨、野菊花、白花舌蛇草均具有寒涼收斂之性，而現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，清熱解毒可抑制腫瘤細(xì)胞增殖且能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫及細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮多途徑多靶點(diǎn)抗腫瘤作用[12]。中醫(yī)理論認(rèn)為清熱解毒藥物與腫瘤具有不受控制的向外生長(zhǎng)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的“陽(yáng)熱特性”相反。

筆者通過(guò)化療聯(lián)合解毒扶正散治療非小細(xì)胞肺癌，發(fā)現(xiàn)解毒扶正散能夠提高INF-γ、IL-2水平及CD4+CD25+T細(xì)胞比例，而降低TGF-β水平，說(shuō)明解毒扶正散可能具有干預(yù)微環(huán)境改善肺癌免疫抑制狀態(tài)的作用。本課題通過(guò)干預(yù)非小細(xì)胞肺癌的免疫微環(huán)境，尋求經(jīng)濟(jì)低廉、毒副作用小、療效好的免疫治療方法，以提高肺癌綜合治療的水平，為中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌提供新的思路。

[1] She J,Yang P,Hong Q,et al.Lung cancer in China:challenges and interventions[J].Chest,2013,143(4):1117-1126.

[2] Chen W,Zheng R,Peter D.Cancer statistics in China[J].CA Cancer J Clin,2016，66(2):115-132.

[3] Rafael R,Niki K.Lung cancer in 2014:optimizing lung cancer treatment approaches[J].Nat Rev Clin Oncol,2015,12(2):75-76.

[4] Hanahan D,Weinberg R A.The hallmarks of cancer[J].Cell,2000,100(1):57-70.

[5] Hanahan D,Robert W A.Hallmarks of cancer:the next generation[J].Cell,2011,144(5):646-674.

[6] Haratani K,Hayashi H,Tanaka T,et al.Tumor immune microenvironment and nivolumab efficacy in EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer based on T790M status after disease progression during EGFR-TKI treatment[J].Ann Oncol,2017,28(7):1532-1539.

[7] 胡多.腫瘤微環(huán)境中的免疫效應(yīng)抑制[J].國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志，2006,27(2):108-111.

[8] De la Fuente M,Thuwajit D.Chronic inflammation and cytokines in the tumor microenvironment[J].J Immunol Res,2014,2014:149185.

[9] Rudge G,Gleeson P A,van Driel I R.Control of immune responses by immunoregulatory T cells [J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2006,54(6):381-391

[10] Jaehong K,Jong Sup B.Metabolic regulation of macrophages in tumor microenvironment[J].Curr Opin Hematol,2017,24:1065-1251.

[11] He X R,Han S Y,Li X H,et al.Chinese medicine Bu-Fei decoction attenuates epithelial-mesenchymal transition of non-small cell lung cancer via inhibition of transforming growth factor β1 signaling pathway in vitro and in vivo[J].J Ethnopharmacol,2017,204:45-57.

[12] 熊露，田少霞.扶正培本治則方藥調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境免疫與血管正常化的思路研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2010,30(2)：201-204.

EffectofJieduFuzhengSanonTumorImmuneMicroenvironmentofNon-SmallCellLungCancer

SUNLong-hua，ZHANGShu-fang，LUOLai-heng，TUZhang-ying，CHENJian-jian

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanchangHospitalofIntegrativeTraditionalChineseandWesternMedicine,Nanchang330003,China)

ObjectiveTo investigate the changes in cytokines in tumor immune microenvironment of non-small cell lung cancer(NSCLC) after treatment with Jiedu Fuzheng San,and to explore the mechanism of action of traditional Chinese medicine for NSCLC.MethodsSixty NSCLC patients were randomly given chemotherapy alone(control group,n=30) or in combination with 2 courses of 28-day Jiedu Fuzheng San treatment(treatment group,n=30).The levels of interferon-γ(IFN-γ),interleukin-2(IL-2) and transforming growth factor-β(TGF-β) in peripheral blood were measured by ELISA.The proportion of CD4+CD25+T cells was analyzed by flow cytometry.ResultsThere were no significant differences in gender and age between the two groups(P>0.05).Compared with control group,the levels of IFN-γ and IL-2 and proportion of CD4+CD25+T cells increased but the levels of TGF-β decreased in treatment group(P<0.05).ConclusionJiedu Fuzheng San can regulate immune function and tumor microenvironment in patients with NSCLC.These results provide new evidence for prospective and controlled clinical trial.

Jiedu Fuzheng San; non-small cell lung cancer; tumor microenvironment

2017-08-18

江西省自然科學(xué)基金(20151BAB205036)；江西省衛(wèi)生計(jì)生委中醫(yī)藥科研課題(贛衛(wèi)中醫(yī)字【2015】21號(hào)2015A026；贛衛(wèi)科教字【2015】26號(hào)20167035)

孫龍華(1982—)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌、COPD研究。

R734.2

A

1009-8194(2017)10-0001-03

10.13764/j.cnki.lcsy.2017.10.001

劉大仁)