宋 煒，陳芬芳，2，張鳳英，馬春艷，趙 明，馬凌波

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

西伯利亞鱘Sox17基因cDNA全長的克隆及其表達分析

宋 煒1，陳芬芳1，2，張鳳英1，馬春艷1，趙 明1，馬凌波1

（1.中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海與遠洋漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，上海 200090；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306）

采用RACE技術獲得西伯利亞鱘（Acipenser baerii）Sox17基因cDNA全長，序列分析表明，西伯利亞鱘Sox17基因cDNA全長2 671 bp，包括588 bp的5’端非翻譯區(qū)，901 bp的3’端非翻譯區(qū)和編碼393個氨基酸殘基的1 183 bp開放閱讀框。氨基酸序列比對顯示，該基因具較高的保守性，與塞內(nèi)加爾多鰭魚（Polypterus senegalus）的相似度最高為72%。系統(tǒng)進化分析表明，西伯利亞鱘與塞內(nèi)加爾多鰭魚聚為一支，且支持率為95%。以延伸因子efla（elongation factor 1-alpha）作為內(nèi)參基因，對Sox17基因在西伯利亞鱘各組織的相對表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)Sox17基因在不同組織中均有表達，但表達具有明顯的組織差異性。在腦中表達量最高，而在腎、血液、眼、腸和胸鰭5個組織中表達量均較低。同時，Sox17基因在西伯利亞鱘不同發(fā)育時期均有表達，但表達具有一定的時間差異性。在寬神經(jīng)板期的表達量高，相當于表達量最低點11日齡仔魚的167倍。本研究為量化西伯利亞鱘胚胎發(fā)育分化過程中相關基因提供了參照工具，同時可為今后深入研究西伯利亞鱘Sox17在胚胎發(fā)育過程中的作用提供基礎參考資料。

西伯利亞鱘；Sox17；cDNA全長；表達分析

鱘形目魚類是軟骨硬鱗下綱中現(xiàn)存的唯一一目，素有“活化石”之稱［1］。作為鱘形目魚類中重要的一種，西伯利亞鱘（Acipenser baerii）隸屬于輻鰭亞綱（Actinopterygii），軟骨硬鱗下綱（Chondrostei），鱘形目（Acipenseriformes），鱘科（Acipenseridae），鱘屬，主要分布于俄羅斯西部的鄂畢河至東部的科雷馬河之間的西伯利亞各河流中，是目前世界上最古老的也是起源最早的脊椎動物類群之一，因而具有極高的進化研究價值。隨著生物技術的迅速發(fā)展，人們對西伯利亞鱘的研究已向縱深方向展開，主要集中在分子進化［2］，胚胎和仔魚［3－4］及側線神經(jīng)發(fā)育等方面［5－6］。

Sox基因家族（Sry-related HMG-box）是一類由哺乳動物性別決定基因Sry（sex determin-ing region of Y chromosome）相關基因構成。該家族成員都含有一個保守的 HMG（high mobility group）盒，其編碼產(chǎn)物能特異性地識別和結合DNA序列，使DNA發(fā)生彎曲，是一類重要的轉錄調(diào)控因子［7］。Sox基因編碼一系列轉錄因子，參與了胚胎發(fā)育和細胞命運決定的調(diào)控。通過與其它蛋白形成復合體后作為轉錄調(diào)控子，廣泛參與早期胚胎發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軟骨及多種組織器官的形成、性別決定和分化等重要的生物學過程［8－9］。在胚胎發(fā)育過程中可在多種組織中表達，其表達具有時空特異性。同一種Sox基因在不同的組織中具有不同的功能，同時，不同的Sox基因在不同的組織中可以具有相似的功能，甚至可以相互替代［10－11］。根據(jù) HMG盒序列的系統(tǒng)發(fā)生分析、蛋白質(zhì)結構特征及功能不同，將Sox基因分成A-J 10個亞族。Sox17屬于Sox家族的F亞族，作為Sox轉錄因子超家族的一員，在進化過程中高度保守［12］。Sox17能夠調(diào)控內(nèi)胚層發(fā)育、精子發(fā)生和血管生成過程；在控制少突膠質(zhì)細胞的分化過程中具有重要作用，同時也是心臟中胚層發(fā)育的關鍵作用因子［13－18］。

目前關于鱘形目Sox17基因的研究尚未見報道，本研究采用 RACE法克隆出西伯利亞鱘Sox17基因cDNA全長，并對其進行序列分析，同時利用RT-PCR技術，對該基因在西伯利亞鱘不同組織以及胚胎發(fā)育不同時期的表達量進行研究，以期進一步探究該基因的功能及其在西伯利亞鱘胚胎發(fā)育與分化調(diào)控信號通路中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：西伯利亞鱘成魚和胚胎均采自浙江千島湖鱘龍科技有限公司養(yǎng)殖場，其中成魚100 ind（2齡，體長為 27.4～34.5 cm），胚胎1 000 ind，暫養(yǎng)于實驗室循環(huán)水系統(tǒng)中。

實驗試劑：總RNA抽提試劑RNApure total RNA Kit（艾德萊，北京），pMD19-T Vector試劑盒（TaKaRa，clontech，Japan），SMARTer?RACE 5’／3’Kit試劑盒 （TaKaRa，clontech，Japan）、SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit（TaKaRa，clontech，Japan），ReverTra Ace qPCR RT Kit，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa， Dalian， China） （TOYOBO，Japan）。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集與RNA提取

西伯利亞鱘活體解剖，取腸、腹鰭、肝臟、肌肉、腦、腎、鰓、胸鰭、血液、心臟、眼各組織于研磨器（RNAase free）中，同時參考西伯利亞鱘不同發(fā)育階段的分期方法［4］，取西伯利亞鱘胚胎大卵黃栓期、寬神經(jīng)板期、尾芽分離期，以及11日齡仔魚、64日齡魚電感受器神經(jīng)節(jié)于研磨器（RNAase free）中，加液氮研磨，使用RNApure total RNA Kit試劑盒提取RNA，具體步驟參照試劑盒說明書。提取的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，符合后續(xù)RACE擴增以及RT-PCR的要求。

1.2.2 Sox17基因 3’RACE擴增

利用轉錄組建庫獲得的Sox17部分cDNA片段，設計引物進行 3’RACE。按照 SMARTer?RACE 5’／3’Kit（TaKaRa，clontech，Japan）試劑盒的說明書進行。將3’端RACE擴增獲得的目的條帶連接至pMD-19T載體后送至上海杰李生物技術有限公司測序。測序所得序列先進行拼接、比對和分析，確定屬于Sox17基因的cDNA片段，然后把兩端序列和經(jīng)驗證后序列進行拼接，拼接完成的序列即為Sox17基因cDNA的全長，最后設計實驗驗證全長序列。

表1 實驗中所使用的引物Tab.1 Primers used for sequencing Sox17

1.2.3 生物信息學分析

應用NCBI中blastn和blastp程序對獲得的序列進行了同源性查找及比較（http：／／blast.ncbi.nlm.nih.gov／Blast.cgi），以確定是否為目的基因片段；應用ORFfinder程序進行開放閱讀框（ORF）（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）分析并將其推導為相應的氨基酸序列，分析CDS起始區(qū)域及氨基酸數(shù)量。應用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（Neighbour-joining）對同源蛋白質(zhì)進行系統(tǒng)進化樹構建，其中自展（Bootstrap）進行1 000次重復，其余參數(shù)為默認。蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、等電點及基本性質(zhì)分析用Prot Param （http／／www. expasy. ch／tools／protparam.html）進行預測。

表2 序列分析所用的Sox17蛋白質(zhì)序列來源和登錄號Tab.2 Origins and accession numbers of Sox17 gene sequence in this study

1.2.4 實時熒光定量 PCR

以西伯利亞鱘各個組織和不同發(fā)育時期的RNA轉錄得到的cDNA為模板，以efla作為內(nèi)參基因進行實時熒光定量PCR實驗，采用標準曲線法進行數(shù)據(jù)分析。RT-PCR反應體系為20μL，其中包括：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ10μL，Primer F／R（10 mM）1μL，ddH2O 6μL，cDNA2μL。反應條件如下：94℃預變性10 min，94℃變性15 s，引物退火溫度1 min，總共進行45個循環(huán)，72℃下10 min，最后采用溶解曲線法檢測引物是否特異。

2 結果與分析

2.1 西伯利亞鱘Sox17基因的cDNA序列分析

通過建庫克隆和RACE擴增拼接獲得了西伯利亞鱘Sox17基因的cDNA序列，比對結果顯示，西伯利亞鱘Sox17基因與其它物種的Sox17具有較高的相似性，綜合分析后命名為AbSox17（圖1）。AbSox17基因cDNA全長序列2 671 bp，已將該序列提交至 GenBank（登錄號：KY353513）。AbSox17序列包括588 bp的5’端非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）、可編碼393個氨基酸的1 182 bp的開放閱讀框（open reading frame，ORF）及包括大小為901 bp的3’端非翻譯區(qū)（UTR）。利用ProtParam tool平臺，對AbSox17的編碼區(qū)推導的蛋白質(zhì)的基本理化特征進行分析，推測該蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為4.41×104Da，等電點為 6.39，分子式為 C1896H2933N567O605S25。AbSox17蛋白包含兩個結構域，在蛋白質(zhì)序列63～133位置有一個HMG盒包含A、B兩個DNA作用結構域。而在蛋白質(zhì)序列276～392位置處有一個Sox羧基端結構域。

2.2 AbSox17蛋白的結構特征以及相似性

與其它物種蛋白質(zhì)氨基酸序列進行比對分析，結果表明，AbSox17與塞內(nèi)加爾多鰭魚（Polypterus senegalus）Sox17氨基酸序列相似性為72%，與香魚（Plecoglossus altivelis）、歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）、南極巖斑鱈（Notothenia coriiceps）Sox17氨基酸序列的相似性為67%，與小家鼠Sox17氨基酸序列相似性為50%。從13種魚氨基酸序列與西伯利亞鱘的比對結果可以得出，Sox17基因在魚類中相似度比較高，且存在保守區(qū)域，70～150 bp相似度最高，為HMG盒作用結構域。同樣，在序列的羧基端與氨基末端也非常保守（圖2）。

2.3 AbSox17蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進化分析

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫下載了23條其它物種Sox17蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 6.0軟件對AbSox17蛋白及多個物種Sox17蛋白的氨基酸序列進行了比對。另外，根據(jù)多重比對結果構建了 NJ系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復次數(shù)設為1 000次。從系統(tǒng)進化樹可以明顯看到2個完好的分支，西伯利亞鱘首先與塞內(nèi)加爾多鰭魚聚為一支，且支持率為95%。緊接著與其它魚類聚為一支。然后與其它哺乳類（如人類、黑猩猩、牛、小家鼠、猴等）聚為一支（圖3）。從圖3可以看出，西伯利亞鱘與塞內(nèi)加爾多鰭魚的Sox17基因相似度最高，且與已報道的其它魚類以及哺乳類在進化過程中發(fā)生了一定程度的分化。

圖1 西伯利亞鱘Sox17 cDNA核苷酸序列和氨基酸序列Fig.1 The cDNA and deduced am ino acid sequence of Sox17 gene of Siberian sturgeon注：圖中陰影大寫英文字母上面為核苷酸序列，下面為氨基酸序列，其中63～133 bp位置有一個Sox基因家族特有的HMG盒，276～392 bp位置處有一個Sox羧基端結構域都已用陰影標出，起始密碼子和終止密碼子用黑線框標出Note：Above the capital letters in the shaded part of the picture，is the nucleotide sequence，and below is the amino acid sequence.The shadow on the position of 63－133 bp is Sox gene family special HMG box，276－392 bp location has a Sox carboxyl end structure domain.The start codon and termination codon aremarked by black line box

圖2 西伯利亞鱘與其它物種Sox17氨基酸序列比對Fig.2 M ultiple alignments of the am ino acid sequence of Sox17 from other organisms注：“·”代表最大相似下的間隙，白底黑字表示非保守的氨基酸殘基；淺灰底黑字表示大塊兒的相似序列；灰底黑字表示保守區(qū)氨基酸；黑底白字表示完全相同的殘基。用來比對的魚為表2中的13種魚Note：Gaps（·）were introduced to maximize the alignment.The relationships between residues are indicated as follows：nonsimilar residues，black letters on awhite background；block of similarity，black letters on a lightgrey background；conserved residues，black letters on a dark gray background；identical residues，white letters on a black background.The fish used to sequence blasted is from Tab.2

圖3 MEGA 6.0構建的NJ系統(tǒng)進化樹Fig.3 Construction system tree by MEGA 6.0注：進化樹采用鄰接法，且所用序列的GenBank登錄號與表2中的相同Note：The tree is constructed by the neighbor-joining（NJ）algorithm.The GenBank number of the used sequences is the same as that in Tab.2

2.4 實時熒光定量PCR分析

運用實時熒光定量PCR技術，以efla作為內(nèi)參基因，分析AbSox17基因在西伯利亞鱘成體各組織中的相對表達情況，發(fā)現(xiàn)AbSox17基因雖在不同組織中均有表達，但表達具有明顯的組織差異性。其中，在腎臟、血液、眼3個組織中表達量均處于極低的水平，其次是在腸和胸鰭中表達也很低，在腹鰭的表達量為腸和胸鰭表達量的2.3倍，而在肝和心臟的表達量為腹鰭的2倍，在肌肉和鰓中的表達量大約為腸和胸鰭的10倍，在腦中的表達量最高，為肌肉的6倍（圖4）。在不同發(fā)育階段，在大卵黃栓期、寬神經(jīng)板期及尾芽分離期、11日齡仔魚和64日齡魚電感受器神經(jīng)節(jié)，AbSox17基因也均有表達（圖5），AbSox17基因的mRNA在寬神經(jīng)板期相對表達量最高，為表達量最低（11日齡仔魚）的167倍。

3 討論

本研究成功地采用RACE法從西伯利亞鱘中克隆出Sox17基因cDNA全長，該cDNA全長為2 671 bp，編碼393個氨基酸。序列分析及同源性分析表明，該基因與其它動物有較高相似度，特別是與其它大多數(shù)魚類的相似性均在60%以上，且存在保守區(qū)域。另外，在脊椎動物中，同一亞族中的同一Sox基因不僅在HMG基序區(qū)存在同源性，而且在其它區(qū)域也存在較大相似性。并且在某些亞族中，HMG基序的兩側序列也是十分保守的，例如，B亞族中保守區(qū)位于HMG基序的羧基端，而C、E亞族中的保守區(qū)則位于HMG基序的氨基端。AbSox17基因核苷酸序列中70～150 bp相似度最高，可預測為Sox基因特有的HMG盒作用結構域。同樣，在序列的羧基端與氨基末端也非常保守［19］，說明該基因具有較強的保守性，同時也預示該基因在脊椎動物生命活動中發(fā)揮著重要作用。

圖4 不同組織中西伯利亞鱘Sox17的相對表達量（以efla為內(nèi)參基因）Fig.4 Relative expression levels of Sox17 gene in various tissues detected by quantitative real-time PCR andnormalized to the efla transcript level

圖5 不同發(fā)育時期西伯利亞鱘Sox17的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of Sox17 during different development stages of A.baerii注：從左到右依次為：T1，大卵黃栓期；T2，寬神經(jīng)板期；T5，尾芽分離期；T17，11日齡仔魚；T22，64日齡魚電感受器神經(jīng)節(jié)Note：From left to right in turn is：T1，big yolk plug stage；T2，wide neural plate formation；T5，separation of tail bud stage；T17，11 days old larvae；T22：64 days old sturgeon with electric sensors ganglion

多個物種的Sox17氨基酸蛋白序列分析表明其多樣性分化與分類學上的分化一致。系統(tǒng)進化樹可以明顯看到2個完好的分支，其中哺乳動物聚為一支，魚類聚為一支。Ab Sox17基因與塞內(nèi)加爾多鰭魚的親緣關系最近，其次與其它魚類如香魚、歐洲舌齒鱸、青鳉（Oryzias latipes）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、黃鱔（Monopterus albus）的親緣關系也不遠，但與哺乳動物如人類、黑猩猩、小家鼠等可以從系統(tǒng)進化樹上看到明顯的分支。

在對人類Sox17基因的研究中發(fā)現(xiàn)，Sox17基因廣泛表達，包括在成人的心臟、肺、脾、睪丸、卵巢、胎盤、胃腸道、胎兒的肺以及肝臟中［20］。而西伯利亞鱘Sox17基因表達也很廣泛，在腸、肝臟、心臟、眼、腎、鰓和肌肉等組織中均有表達。在對黃鱔Sox17基因的研究中表明，Sox17基因主要在在睪丸與卵巢中表達，在腦和脾中也有表達，但在心臟與肝臟中的表達比較微弱［21］，在本實驗對西伯利亞鱘研究中發(fā)現(xiàn)，Sox17基因在腦中表達量最高，在肝臟與心臟中也有表達但表達量不高。

另外，Sox17基因的表達不局限于某一特定時期或某種特定的組織。有研究者通過Northern Blots檢測出Sox17基因存在兩種不同的mRNA亞型，并在小鼠的精子發(fā)生時有不同表達，一種在精原細胞中表達，且隨著早期粗線型細胞的發(fā)育而表達下降，另一種亞型在粗線型精原細胞時開始表達，并隨著精子發(fā)育過程其表達量不斷積累而上升［13］。本實驗發(fā)現(xiàn)Sox17基因在西伯利亞鱘發(fā)育的不同時期的表達量也不同，在寬神經(jīng)板時表達量最高，可推測Sox17基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育相關，而神經(jīng)系統(tǒng)主要是由外胚層發(fā)育形成的，可間接得到Sox17基因與外胚層發(fā)育之間可能存在關系。而之前的研究主要集中在Sox17基因與內(nèi)胚層的發(fā)育中的的調(diào)控作用。如通過對爪蛙（Xenopus laevis）、斑馬魚（Brachydanio rerio）和小鼠等的研究，Sox17作為必不可少的下游調(diào)控因子與其它基因一起調(diào)控內(nèi)胚層的發(fā)育［22］；在爪蟾（Xenopus tropicalis）中，Sox17和 B-catenin協(xié)同作用調(diào)節(jié)內(nèi)胚層基因的表達［23］。在對文昌魚（Branchiastoma）的研究同樣發(fā)現(xiàn)，Sox17基因對內(nèi)胚層的發(fā)育調(diào)控起作用［24］。本實驗中得到Sox17基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育相關，這一發(fā)現(xiàn)將為Sox17基因參與外胚層的發(fā)育研究提供新的線索。

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Cloning，analysis and expression detection of full-length cDNA of Sox17 from Acipenser baerii

SONGWei1，CHEN Fen-fang1，2，ZHANG Feng-ying1，MA Chun-yan1，ZHAO Ming1，MA Ling-bo1
（1.Key Laboratory of East China Sea and Oceanic Fishery Resources Exploitation，Ministry of Agriculture，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China；2.College of Fisheries and Life Sciences，ShanghaiOcean University，Shanghai 201306，China）

In this study，the full-length cDNA of Sox17 gene from Siberian sturgeon（Acipense baerii）was obtained using RACE techniques.The full-length of Sox17 gene cDNA was 2 671 bp in length，including a 1 183 bp open reading frame（ORF）encoded 393 amino acids，a 588 bp 5 untranslated region（5’UTR）and a 901 bp 3 untranslated region（3’UTR）.Multiple alignment analyses showed Siberian sturgeon was highly conservative to other fishes.It had high similarity with Ploypterus senegalus of 72%support rating.Phylogenetic analysis showd that Siberian sturgeon first clustered together with Ploypterus senegalus with the approval rating of95%.And then efla（elongation factor1-alpha，efla）genewas used as a internal reference on detecting the expression of Sox17 gene in various tissues of Siberian sturgeon by real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed Sox17 gene expressed in diferent tissues and the expression level of Sox17 was relatively low in kidney，blood，eye，intestine and pelvic fin.However，in brain，the expression level of Sox17 was the highest in all of these tissues.At the same time，Sox17 gene also expressed in different development periods，but expressed with a certain amount of time difference.In wide neural plate，the expression level of Sox17 was the highest，reached 167 times thatof the quantity of11 days old larvae period.This study provides a reference to quantify the Siberian sturgeon differentiation genes involved in the process of embryonic development.At the same time，it provides the basic reference for the future study of the Siberian sturgeon Sox17 role in the process of embryonic development.

Acipenser baerii；Sox17 gene；full length of cDNA cloning；expression analysis

Q 959.468

A

1004－2490（2017）06－0629－11

2017－05－22

國家自然科學基金項目（31302161）

宋 煒（1983－），男，副研究員，主要從事魚類發(fā)育生物學研究。E-mail：swift83＠sina.com

馬凌波，研究員。E-mail：malingbo＠vip.sina.com