張玉琴，王志剛

（1.信陽市羅山縣工商管理和質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 檢驗(yàn)測試中心，河南 信陽 464200；2.漢川市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 漢川 431600）

葛根纖維渣中黃酮提取工藝優(yōu)化及中試試驗(yàn)研究

張玉琴1，王志剛2

（1.信陽市羅山縣工商管理和質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局 檢驗(yàn)測試中心，河南 信陽 464200；2.漢川市公共檢驗(yàn)檢測中心，湖北 漢川 431600）

葛根在提取葛粉后形成的纖維渣含有一定量的活性成分黃酮，該研究以葛根纖維渣為原料，采用乙醇提取黃酮，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，考察液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度對黃酮提取率的影響，得到最優(yōu)黃酮提取工藝條件為液料比8.3∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)42%、提取時(shí)間3.7 h、提取溫度69℃，在此條件下葛根纖維渣黃酮提取率達(dá)到7.85%，并通過中試驗(yàn)證可得到黃酮含量達(dá)到13.1%的葛根提取物。

葛根纖維渣；黃酮；響應(yīng)面；提取工藝

葛根是國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)的藥食兩用的植物，素有亞洲人參之美稱。野生葛中富含異黃酮類、多糖類、氨基酸、微量元素等物質(zhì)，具有重要的藥理功能和藥用價(jià)值[1-3]。葛根主要用于提取葛根淀粉用于食品原料或提取葛根黃酮用于生物醫(yī)藥和化工工業(yè)的重要原料[4]。國內(nèi)葛根生產(chǎn)企業(yè)在葛根提取完淀粉后多將其丟棄，這樣既污染了環(huán)境，又浪費(fèi)了資源。而目前國內(nèi)、外對提取葛根淀粉后的葛根纖維渣的開發(fā)利用主要集中在制備天然葛根纖維[5-8]或制備功能性纖維低聚糖方面[9]，而利用其提取葛根黃酮的報(bào)道非常少。葛根纖維渣中含有豐富的葛根黃酮，對其的開發(fā)利用將有益于提高葛根的附加值[10-13]。本試驗(yàn)擬以乙醇為浸提劑，以野葛根纖維為原料，以黃酮提取率為考察對象，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化葛根纖維渣的提取工藝條件，為葛根纖維的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生葛根纖維渣：由湖北昌禾農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供；葛根素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%）：上海億思科技公司產(chǎn)品；無水乙醇（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（食品級(jí)）：河南天冠集團(tuán)公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent8453紫外可見分光光度計(jì)：美國Agilent科學(xué)儀器公司；AL204型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)：湖南湘儀集團(tuán)；RE-5210A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SP-1500實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)：上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；5 t生物提取罐：溫州雨潤機(jī)械科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葛根纖維渣黃酮提取工藝

葛根纖維渣→乙醇加熱浸提→過濾→濾過液→離心分離→上清液→真空濃縮→噴霧干燥→葛根提取物

操作要點(diǎn)：

1）提?。喝「稍锏母鸶w維渣20 g，置于500 mL圓底燒瓶中，按不同液料比加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液于70℃水浴提取3 h左右；

2）分離：提取結(jié)束后物料用120目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液再以3 000 r/min離心分離10 min取上清液；

3）濃縮：將上清液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮至初始體積的1/3，即為濃縮液；

4）干燥：將濃縮液以20 mL/min的速度泵入噴霧干燥機(jī)中進(jìn)行噴霧干燥，控制進(jìn)風(fēng)溫度185～195℃，出風(fēng)溫度85～90℃，干燥物即為葛根提取物。

1.3.2 葛根提取物中黃酮含量的測定

精密稱取0.1 g葛根提取物置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，并于波長249 nm處測定吸光度值，根據(jù)葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線求得葛根提取物中黃酮的含量。

1.3.3 葛根黃酮提取率[14]

精密稱取20 g干燥的葛根纖維渣置于500 mL圓底燒瓶中，用體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液于70℃提取3 h，過濾，測定提取液中的黃酮含量，黃酮提取率計(jì)算公式如下：

1.3.4 葛根纖維渣黃酮提取單因素試驗(yàn)

在葛根纖維渣黃酮提取中，分別稱取20 g干燥的葛根纖維渣置于500mL圓底燒瓶中依次分別就液料比（4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL∶g））、乙醇體積分?jǐn)?shù)（20%、30%、40%、50%、60%、70%）、提取時(shí)間（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）、提取溫度（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，測定各實(shí)驗(yàn)中葛根黃酮的提取率，以考察各因素對黃酮提取率的影響。

1.3.5 葛根黃酮提取工藝優(yōu)化試驗(yàn)

表1 黃酮提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for flavonoids extraction conditions optimization

1.3.6 葛根纖維黃酮提取中試試驗(yàn)

向5 t生物提取罐中投入0.5 t干葛根纖維渣，按液料比8.3∶1的比例投入體積分?jǐn)?shù)42%的乙醇溶液4.2 t，在69℃條件下提取3.7 h，提取液經(jīng)過濾、濃縮，噴霧干燥后得葛根提取物粉。

2 結(jié)果與分析

2.1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線[14-15]

精密稱取干燥的葛根素標(biāo)準(zhǔn)品20 mg于100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻放置于4℃冰箱保藏備用。分別吸取上述葛根素標(biāo)樣溶液0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL放置于10 mL容量瓶中，并各加無水乙醇1.0 mL，再加純水稀釋至刻度，搖勻。取1.0 mL無水乙醇，加水稀釋至10 mL，作空白對照，在波長249 nm處測吸光度值，以葛根素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of puerarin

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對葛根黃酮提取率的影響

分別按照2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1（mL∶g）的液料比加入體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇溶液，在70℃條件下提取4 h，測定葛根黃酮提取率，結(jié)果見圖2。

當(dāng)年被當(dāng)代人譽(yù)為“最偉大的牛津人”的神學(xué)家路易斯在他的著作《痛苦的奧秘》中寫道：“剛上大學(xué)的時(shí)候，我連一個(gè)男孩應(yīng)該具備的起碼的道德良知都沒有。我只對殘忍和吝嗇有一點(diǎn)模糊的厭惡，這便是我最大的成就，而我對仁慈、誠實(shí)和自我犧牲的認(rèn)識(shí)，就像狒狒對古典音樂的認(rèn)識(shí)一樣貧乏。”這樣一個(gè)多年以后把仁愛變成文字使我們得以洗滌魂魄的天才，他的本然情感同樣也是貧乏的，是不斷接受著吸吮著來自仁者的教養(yǎng)，才逐漸清洗掉自己的“罪性”，活成了一個(gè)尊貴的人。

圖2 液料比對黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on flavonoids extraction ratio

由圖2可知，在液料比小于8∶1（mL∶g）時(shí)，葛根黃酮的提取率隨著液料比的升高而提高，當(dāng)液料比達(dá)到8∶1（mL∶g）后黃酮的提取率升高緩慢，這是因?yàn)樵诠桃禾崛≈校崛∷俾适且欢ǖ?，?dāng)提取液用量增加時(shí)，提取率也隨之增加，而在一定提取時(shí)間內(nèi)，當(dāng)提取達(dá)到平衡時(shí)，其提取率就不會(huì)再提高了。因此，生產(chǎn)中從提取液的回收及成本上考慮，初步確定葛根黃酮提取的液料比為8∶1（mL∶g）。

2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對葛根黃酮得率的影響

以8∶1的液料比加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，在70℃水浴提取3 h，測定葛根黃酮提取率，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＜40%時(shí)，葛根黃酮的提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)葛根黃酮的提取率達(dá)到最大，之后以后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高提取率又逐步下降，這是葛根黃酮中甙元成分不溶于水，而糖易溶于水，當(dāng)乙醇與水的比例達(dá)到一定值時(shí)可獲得較高的提取率。從生產(chǎn)的角度考慮初步確定葛根黃酮提取用乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on flavonoids extraction ratio

2.2.3 提取時(shí)間對葛根黃酮得率的影響

以8∶1的液料比加入體積分?jǐn)?shù)40%的乙醇溶液，在70℃水浴提取不同的時(shí)間，測定葛根黃酮提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on flavonoids extraction ratio

由圖4可知，葛根黃酮的提取率在4 h之前隨著時(shí)間的延長而不斷增加，在提取時(shí)間4 h時(shí)達(dá)到最大值，4 h后黃酮的提取率基本上維持恒定，其原因可能是黃酮在高溫條件下自身易被氧化破壞，使得黃酮提取率有所減少[14]。因此，從生產(chǎn)成本考慮初步確定葛根黃酮提取時(shí)間4h較為合適。

2.2.4 提取溫度對葛根黃酮得率的影響

以8∶1的液料比加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液，在不同溫度條件下水浴提取4 h，測定葛根黃酮提取率，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，當(dāng)提取溫度低于70℃時(shí)，葛根黃酮的提取率隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)葛根黃酮的提取率達(dá)到最大值，提取溫度高于70℃后，葛根黃酮的提取率則隨溫度的升高而降低，說明溫度的升高對植物組織的浸潤和對有效成分的溶解也有促進(jìn)作用，有利于黃酮的提取，但溫度太高也會(huì)使黃酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，使其提取率降低[14]。因此，從生產(chǎn)成本考慮初步確定70℃為葛根黃酮的提取溫度。

圖5 提取溫度對黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on flavonoids extraction ratio

2.3 葛根黃酮提取工藝優(yōu)化[16-19]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度為評(píng)價(jià)因素，葛根黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)，結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 黃酮提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology for flavonoids extraction conditions optimization

應(yīng)用Design Expert7.5軟件，對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可得到液料比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、提取時(shí)間（X3）、提取溫度（X4）與黃酮的提取率（Y）之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

對回歸方程進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

該模型回歸顯著（P＜0.000 1），方程的X1、X2、X3、X4、X1X4、X12、X22、X32、X42都是顯著的（P＜0.05），該模型的R2=0.980 0、R2Adj=0.960 1，說明該方程與實(shí)際情況擬和較好，能夠較好反⒊液料比（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）、提取時(shí)間（X3）、提取溫度（X4）等因素與黃酮的提取率（Y）之間的關(guān)系，可以用該回歸方程對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析預(yù)測，各因素交互作用對于響應(yīng)值的響應(yīng)面分析見圖6。

對回歸方程求導(dǎo)數(shù)，當(dāng)響應(yīng)值Y最大時(shí)可得各因素的值：X1=0.16、X2=0.23、X3=-0.33、X4=-0.08，經(jīng)轉(zhuǎn)換后，得到葛根黃酮提取的最佳工藝條件：液料比8.32∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)42.3%、浸提時(shí)間3.67 h、提取溫度69.2℃，預(yù)測葛根黃酮提取率為7.85%。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments results

圖6 液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度交互作用對黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig．6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between liquid-solid ratio，ethanol concentration，extraction time and temperature on the flavonoids extraction ratio

為方便實(shí)際操作，在液料比8.3∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)42%、浸提時(shí)間3.7 h、提取溫度69℃的條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到葛根黃酮提取率為7.54%，與預(yù)測值相符。

2.4 葛根纖維黃酮提取中試試驗(yàn)

在葛根黃酮提取的最佳工藝條件下，0.5 t葛根纖維黃酮提取中試試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可見，在0.5 t規(guī)模的葛根纖維黃酮提取試驗(yàn)中，葛根黃酮的平均提取率為7.44%，基本符合預(yù)期，葛根纖維渣中的黃酮得到了較好的回收[11，20]。

表4 0.5 t葛根纖維渣黃酮提取試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of flavonoids extraction from 0.5 t kudzu root fiber residue

3 小結(jié)

該研究以葛根纖維為原料，以乙醇為介質(zhì)提取葛根黃酮，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)，對影響黃酮提取率的液料比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度等因素進(jìn)行了優(yōu)化，并構(gòu)建了葛根黃酮提取的數(shù)學(xué)模型，并通過響應(yīng)面分析，確定了葛根黃酮提取的最佳工藝條件：液料比8.3∶1（mL∶g）、乙醇體積分?jǐn)?shù)42%、浸提時(shí)間3.7 h、提取溫度69℃，在此條件下，葛根黃酮提取率可達(dá)到7.85%。通過0.5 t規(guī)模的葛根纖維黃酮提取中試試驗(yàn)，證明在優(yōu)化條件下葛根黃酮的平均提取率可達(dá)7.44%，葛根提取物中黃酮平均含量為13.1%。

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Extraction process optimization and pilot scale extraction of flavonoids in kudzu root fiber

ZHANG Yuqin1,WANG Zhigang2
（1.Center of Inspection and Testing,Xinyang Luoshan Business Administration and Quality Technical Supervision,Xinyang 464200,China;2.Hanchuan Public Inspection and Testing Center,Hanchuan 431600,China）

There are active ingredients flavonoids in kudzu root fiber residue after kudzu powder extraction.Using kudzu root fiber residue as raw material,flavonoids were extracted by ethanol.The effects of liquid to solid ratio,ethanol concentration,extraction time and temperature on flavnoid extraction ratio were investigated by single factor experiments and response surface experiments.The optimal flavonoid extraction conditions were liquid-solid ratio 8.3∶1 （ml∶g）,ethanol concentration 42%,extraction time 3.7 h,temperature 69 ℃.Under the conditions,the flavonoid extraction ratio of kudzu root fiber residue reached 7.85%,and the flavonoid content of kudzu root extracts was 13.1%by pilot scale tests.

kudzu root fiber;flavonoids;response surface methodology;extraction process

TQ461

0254-5071（2017）12-0134-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.028

2017-08-01

張玉琴（1978-），工程師，本科，主要從事檢驗(yàn)檢測工作。