劉國(guó)鋒

（1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500）

大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

劉國(guó)鋒1，2

（1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500）

該試驗(yàn)對(duì)木聚糖酶工業(yè)大生產(chǎn)條件下的接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、誘導(dǎo)時(shí)間、比生長(zhǎng)速率進(jìn)行了單因素優(yōu)化試驗(yàn)。在此單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)酶活影響較大的比生長(zhǎng)速率、溶氧和pH 3個(gè)因素進(jìn)行了正交試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為接種量10%，發(fā)酵過程中溶氧值30%，生長(zhǎng)期控制pH值為7.0，生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度37℃，生長(zhǎng)期比生長(zhǎng)速率為0.12 h-1，誘導(dǎo)期pH值為6.8，誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為35℃，誘導(dǎo)期比生長(zhǎng)速率為0.14 h-1，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD600nm=30）時(shí)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。優(yōu)化后，放罐木聚糖酶活力最高可達(dá)149 000 IU/mL。該研究提升了大生產(chǎn)條件下的木聚糖酶活力，為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了指導(dǎo)。

大腸桿菌；木聚糖酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

木聚糖水解酶是一種復(fù)雜的復(fù)合酶系統(tǒng)，廣泛分布于自然界的細(xì)菌和真菌中。報(bào)道的木聚糖酶的來源主要有細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母、藻類以及動(dòng)物瘤胃中的細(xì)菌[1]。國(guó)內(nèi)研究產(chǎn)木聚糖酶最多的菌株是木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）等。 目前，已從20余種細(xì)菌、16種真菌、3種酵母以及8種放線菌中分離出相應(yīng)的木聚糖酶[2]。木聚糖的酶法降解在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、制藥工業(yè)等眾多行業(yè)中有著十分誘人的應(yīng)用前景，尤其是近兩年在造紙工業(yè)中成功運(yùn)用木聚糖酶進(jìn)行預(yù)漂白處理，使得木聚糖酶的廠家成為了一個(gè)熱點(diǎn)，并取得了一系列重要的進(jìn)展。

高密度發(fā)酵技術(shù)能提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量），不僅可以增加放罐體積、強(qiáng)化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高產(chǎn)品在市場(chǎng)上的競(jìng)爭(zhēng)力。這一目的的實(shí)現(xiàn)，除了重組菌本身的表達(dá)性質(zhì)外，還必須給㈣重組菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)的最適環(huán)境條件，包括適宜的培養(yǎng)基組成、合適的培養(yǎng)溫度、pH、比生長(zhǎng)速率、適宜的溶解氧以及營(yíng)養(yǎng)物的合理流加等。

目前，國(guó)內(nèi)外的研究主要側(cè)重于木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)、木聚糖酶生產(chǎn)菌株構(gòu)建、木聚糖酶應(yīng)用等方面的研究。KHANDEPARKER R等[3]通過分子改造構(gòu)建雙功能木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)同時(shí)具備木聚糖酶和纖維素酶活性的木聚糖酶應(yīng)用前景巨大。SHEI J C等[4]從黑曲霉中分離出了一種內(nèi)切木聚糖酶，該酶對(duì)纖維素、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)等都有水解作用。木聚糖酶為誘導(dǎo)酶，除了受基因工程菌的構(gòu)建特性因素影響外，影響木聚糖酶發(fā)酵的因素通常有碳源、氮源、pH、溫度和通氣量等[5-6]，但是關(guān)于木聚糖酶規(guī)模化應(yīng)用方面的研究較少。此外木聚糖酶產(chǎn)生菌分泌的代謝酶，包括蛋白酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶類，都會(huì)影響到木聚糖酶的產(chǎn)率，在確立木聚糖酶培養(yǎng)時(shí)間時(shí)必須要考慮到存在于培養(yǎng)基中的這些酶類的影響[7]。

為了解決木聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)中的實(shí)際問題，本研究采用碳氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，著重研究大生產(chǎn)中接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、誘導(dǎo)時(shí)間、比生長(zhǎng)速率等培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)及木聚糖酶酶活的影響，以期為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

生產(chǎn)菌株[8]：重組大腸桿菌（Escherichia coli）：尤特爾生化有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖：河北健民淀粉糖業(yè)有限公司；乳糖、甘油：武漢萊恩化工有限責(zé)任公司；硫酸銨：中國(guó)石油化工股份有限公司巴陵分公司；磷酸二氫鉀：武漢無機(jī)鹽化工有限公司；氯化鈉：湖南省湘衡鹽化有限責(zé)任公司；蛋白胨：山東梁山蛋白胨生物制品有限公司；無水磷酸氫二鈉：云南昆陽磷肥廠有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸膏10.0 g/L、NaCl 5.0g/L；聚丙二醇（polypropyleneglycol，PPG）-20000.01mL，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖18.0 g/L、酵母浸膏3.0 g/L、檸檬酸3.0 g/L、硫酸銨3.5 g/L、PPG-2000 0.05 mL、MgSO4·7H2O 1 g/L、磷酸二氫鉀12.0 g/L、氯化鈣0.2 g/L和微量鹽貯液，pH值自然，121℃滅菌30 min。微量鹽貯液組成如下：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）8.4 mg/L，檸檬酸鐵100.0 mg/L，Zn（CH3COO）2·2H2O 13.0 mg/L，CoCl2·6H2O 2.5 mg/L，MnCl2·4H2O 15.0 mg/L，CuCl2·2H2O 1.5 mg/L，硼酸 3.0 mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.5 mg/L。培養(yǎng)基滅菌條件為：115℃滅菌20 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基：甘油500.0 g/L、MgSO4·7H2O 10.0 g/L、氯化鈣1.0 g/L，pH值自然，121℃滅菌30 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：甘油100.0g/L、MgSO4·7H2O2.0g/L、乳糖240.0 g/L、氯化鈣0.2g/L，pH值自然，121℃滅菌30min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；2 m3304不銹鋼種子罐、20 m3304不銹鋼發(fā)酵罐：岳陽龍輝檢修安裝有限公司；755S紫外可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；Phs-3CP pH儀：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

小罐種子培養(yǎng)采用2 m3種子罐，初始培養(yǎng)基體積1 m3，接種搖瓶種子3 000 mL，接種時(shí)加入維生素B1和卡那霉素，培養(yǎng)溫度37℃，通氣量1.2 m3/min，罐壓0.03 MPa，待空氣量加足后開啟攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)8 h，將其作為種子液。

發(fā)酵采用20 m3發(fā)酵罐，初始培養(yǎng)基體積10 m3，調(diào)整好培養(yǎng)溫度后接種小罐種子，接種前通過小罐接種口加入維生素B1和卡那霉素，通入空氣，待空氣量加足后開啟攪拌，用20%氨水調(diào)節(jié)pH值。待還原糖降至0.3 g/100 mL，指數(shù)流加生長(zhǎng)培養(yǎng)基。至一定OD600nm值時(shí)，指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。至OD600nm值比最高時(shí)下降5～10個(gè)單位后停止發(fā)酵。

1.3.2 分析檢測(cè)

細(xì)胞密度的測(cè)定：取適量菌液，用分光光度計(jì)測(cè)定適當(dāng)稀釋至吸光度值0.2～0.4后，其波長(zhǎng)在600 nm處的吸光度值（OD600nm）。

木聚糖酶酶活的定義：在50℃，pH 6.50中性條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為5 mg/mL的燕麥木聚糖溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)活力單位（IU/mL）。采用高效液相色譜法測(cè)定木糖含量，色譜條件如下：Aglient HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器（refractiveindexdetector，RID）溫度控制在55℃；柱溫65℃；流動(dòng)相5mmol/L硫酸溶液；流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

接種量的確定：分別以3%、6%、8%、10%、12%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，通入空氣培養(yǎng)8 h，定時(shí)取樣測(cè)OD600nm值和酶活。

溶氧量的確定：發(fā)酵過程中，分別將溶氧控制在10%、15%、20%、25%、30%，37℃培養(yǎng)，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測(cè)OD600nm值和酶活。

誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的確定：分別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的前期、中期及后期指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基（具體優(yōu)化方法見結(jié)果討論），37℃，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52 h測(cè)OD600nm值和酶活。

pH值的確定：在OD600nm值至30時(shí)指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)期分別將pH值控制在6.4、6.6、6.8、7.0，37 ℃培養(yǎng)，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測(cè)OD600nm值和酶活。

比生長(zhǎng)速率的確定：根據(jù)前期試驗(yàn)摸索，生長(zhǎng)期細(xì)胞比生長(zhǎng)速率為0.12 h-1有利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物積累，而誘導(dǎo)期的比生長(zhǎng)速率需要進(jìn)行優(yōu)化。誘導(dǎo)時(shí)設(shè)定不同的細(xì)胞比生長(zhǎng)速率補(bǔ)料進(jìn)行優(yōu)化，37℃培養(yǎng)，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52h后測(cè)OD600nm值和酶活。

因發(fā)酵設(shè)備的限制，無法連續(xù)改變補(bǔ)料體積，故采用每1 h改變補(bǔ)料體積的階梯式的補(bǔ)料方式。設(shè)定比生長(zhǎng)速率（μset），根據(jù)下列公式計(jì)算流加率：

式中：F為流加率，L/h；X（t0）為補(bǔ)料開始前細(xì)胞干質(zhì)量，g/L；V（t0）為補(bǔ)料開始前發(fā)酵液體積，L；SF為補(bǔ)料培養(yǎng)基葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；m為保持系數(shù)0.025，（g·g/h）[9]；Yx/s為產(chǎn)出系數(shù)，即每克葡萄糖產(chǎn)生細(xì)胞干質(zhì)量，g/g。

每克葡萄糖產(chǎn)生細(xì)胞干質(zhì)量計(jì)算公式如下：

式中：ODb為補(bǔ)料開始前的發(fā)酵液的OD600nm值；OD0為發(fā)酵開始時(shí)的OD600nm值；0.54為1 OD600nm值相當(dāng)于1 L發(fā)酵液中含有的細(xì)胞干質(zhì)量為0.573 g；Vm為發(fā)酵合成培養(yǎng)基的初始體積，L；Vi為發(fā)酵種子液的體積，L；Vs為取樣體積，L；S為合成培養(yǎng)基中含有的葡萄糖的總量，g。

溫度優(yōu)化：在OD600nm值至30時(shí)指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)期分別將培養(yǎng)溫度控制在34℃、35℃、36℃、37℃、38℃，其他條件不變發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測(cè)OD600nm和酶活。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)為3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

接種量的大小決定菌種在發(fā)酵罐中的生長(zhǎng)速度。采用低接種量，會(huì)使菌種生長(zhǎng)緩慢，發(fā)酵周期延長(zhǎng)。接種量大，有利于對(duì)基質(zhì)的利用，縮短生長(zhǎng)延滯期，并使生長(zhǎng)菌迅速占領(lǐng)整個(gè)培養(yǎng)環(huán)境，但過度接種量會(huì)使菌體生長(zhǎng)過快，影響后期的生長(zhǎng)，在一定范圍內(nèi)增加接種量有利于菌體生長(zhǎng)。不同接種量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同的接種量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.1 Effects of different inoculum on xylanase production by E.colifermentation

由圖1可知，除3%和6%的接種量外，其余接種量菌體濃度差距不大。接種量為10%時(shí)木聚糖酶酶活最高，3%接種量酶活最低?？紤]到在大規(guī)模發(fā)酵過程中，接種量過小菌體增值緩慢和接種量過大對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶轉(zhuǎn)化得率會(huì)產(chǎn)生一定抑制作用[10]，并出于種子罐和發(fā)酵罐消毒滅菌時(shí)操作方便及生產(chǎn)成本考慮，確定10%為最佳接種量。

2.2 溶氧對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

在微生物培養(yǎng)時(shí)，必須不斷地向培養(yǎng)液提供足夠的氧，以滿足微生物生長(zhǎng)代謝的需要。由于微生物的新陳代謝與氧氣呼吸有關(guān)，調(diào)節(jié)通氣和攪拌可影響發(fā)酵周期時(shí)間的長(zhǎng)短和代謝產(chǎn)物生成的高低。

大腸桿菌菌體在高密度培養(yǎng)時(shí)，耗氧劇增，發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平逐漸下降。當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)的溶解度降低到臨界濃度以下，此時(shí)再加大補(bǔ)料速度，將會(huì)導(dǎo)致菌體呼吸停止或厭氧發(fā)酵，并可能造成菌體自溶。在其他工藝參數(shù)不變的基礎(chǔ)上，考察不同水平的溶氧對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測(cè)酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的溶氧量對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effects of different dissolved oxygen contents on xylanase production byE.colifermentation

由圖2可知，生產(chǎn)中溶氧＜20%時(shí)，菌體生長(zhǎng)明顯受到抑制，酶活水平降低，溶氧＞25%酶活增長(zhǎng)不顯著。在高密度發(fā)酵末期，發(fā)酵罐的溶氧成為限制菌體生長(zhǎng)的制約因素[11-12]。受設(shè)備⒉件因素制約，發(fā)酵后期溶氧最大只能達(dá)到31%，未能繼續(xù)通過提高溶氧值來研究對(duì)發(fā)酵的影響。從生產(chǎn)成本上考慮，過度增加溶氧會(huì)增大生長(zhǎng)能耗，提高了生產(chǎn)成本。因此，選用25%溶氧對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)有利。

2.3 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

對(duì)于許多帶有誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的重組微生物，只有將生長(zhǎng)期和產(chǎn)物形成期分開才能獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養(yǎng)中，這兩段時(shí)期的分離可以通過延遲誘導(dǎo)直至細(xì)胞生長(zhǎng)已達(dá)到高密度來實(shí)現(xiàn)。提早誘導(dǎo)造成菌體密度和中性木聚糖酶酶活降低，同時(shí)增加了染菌的機(jī)會(huì)，而誘導(dǎo)較晚，雖可能獲得高菌體密度，但細(xì)胞表達(dá)時(shí)間減少，導(dǎo)致木聚糖酶酶活降低。20m3發(fā)酵罐水平大腸桿菌生長(zhǎng)曲線見圖3，不同誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖4。

圖3 20 m3發(fā)酵罐水平大腸桿菌生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve ofE.coliin the 20 m3fermenter

由圖3可知，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期的OD600nm值為21，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期OD600nm值為30，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期OD600nm值為40，分別在上述3個(gè)生長(zhǎng)期流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

圖4 不同的誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.4 Effects of different induction period on xylanase production byE.colifermentation

由圖4可知，生長(zhǎng)期時(shí)間越長(zhǎng)，誘導(dǎo)期時(shí)間越短，雖然菌體密度越大，但酶活水平相對(duì)不高。生長(zhǎng)期時(shí)間越短，誘導(dǎo)期時(shí)間越長(zhǎng)，菌體密度相對(duì)較小，酶活水平也不高。因此，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（發(fā)酵至第13～15小時(shí)，OD600nm值=30）時(shí)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基較好。

2.4 pH值對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

大腸桿菌生長(zhǎng)的最適pH值為7.0～7.2，降低pH對(duì)控制較低的比生長(zhǎng)速率有利，但會(huì)延長(zhǎng)發(fā)酵周期。在發(fā)酵罐生長(zhǎng)期pH控制在7.0，誘導(dǎo)期采用不同pH值進(jìn)行培養(yǎng)，不同pH值對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同的誘導(dǎo)期pH對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.5 Effects of different pH value during induction period on xylanase production byE.colifermentation

由圖5可知，同周期條件下誘導(dǎo)期pH值越高，菌體濃度越高，但pH＞6.8后，盡管菌體濃度提高，酶活反而下降。pH值為7.0時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度快，但過快的生長(zhǎng)導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，從而影響酶活水平。pH值6.8時(shí)，有利于產(chǎn)物表達(dá)。采用pH梯度法，即生長(zhǎng)期控制pH為7.0，誘導(dǎo)期pH為6.8，能較好地解決這一問題。

2.5 誘導(dǎo)期比生長(zhǎng)速率對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

比生長(zhǎng)速率是每小時(shí)單位體積的菌體所增加的菌體量，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成均有重要作用。在發(fā)酵的補(bǔ)料分批發(fā)酵中使用指數(shù)流加補(bǔ)料培養(yǎng)策略被認(rèn)為是避免產(chǎn)生有毒代謝物和增加細(xì)胞密度的最有效的方法。在同周期條件下，每隔1 h取樣測(cè)定OD600nm值，計(jì)算菌體的比生長(zhǎng)速率，考察在誘導(dǎo)期通過調(diào)整補(bǔ)料速度來控制不同比生長(zhǎng)速率，進(jìn)而影響發(fā)酵的酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 不同的比生長(zhǎng)速率對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.6 Effects of different specific growth rate on xylanase production byE.colifermentation

由圖6可知，比生長(zhǎng)速率在0.14 h-1以下時(shí)，酶活隨比生長(zhǎng)速率加快而增加，比生長(zhǎng)速率在0.20 h-1以上時(shí)，酶活隨比生長(zhǎng)速率加快導(dǎo)致質(zhì)粒被丟失而下降，比生長(zhǎng)速率在0.30h-1以上時(shí)，菌體生長(zhǎng)被抑制。本試驗(yàn)采取指數(shù)補(bǔ)料流加策略進(jìn)行高密度發(fā)酵，設(shè)定補(bǔ)料的比生長(zhǎng)速率為0.14 h-1，低于產(chǎn)生乙酸的比生長(zhǎng)速率，細(xì)胞密度呈指數(shù)的增長(zhǎng)，能有效避免代謝副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生。因此，發(fā)酵生產(chǎn)中將比生長(zhǎng)速率控制在0.14～0.20h-1較為合適。有時(shí)細(xì)胞在低比生長(zhǎng)速率下最終獲得重組蛋白的量反而要比高比生長(zhǎng)速率的細(xì)胞高一些[13]。本研究的試驗(yàn)結(jié)果也證明了上述觀點(diǎn)。

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

大腸桿菌發(fā)酵最適生長(zhǎng)溫度是37℃，但最適木聚糖酶生產(chǎn)溫度需要進(jìn)一步優(yōu)化。在重組大腸桿菌的發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段采用不同溫度，在前期可將溫度調(diào)至最適菌體生長(zhǎng)的溫度，到誘導(dǎo)階段將溫度調(diào)至最適木聚糖酶生產(chǎn)的溫度。本研究在生長(zhǎng)期采用37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)期采用不同培養(yǎng)溫度，考察不同的培養(yǎng)溫度對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，誘導(dǎo)期溫度升高增加菌體密度，但超過35℃菌體密度增加不明顯，且酶活逐漸下降。一些大腸桿菌重組蛋白在溫和啟動(dòng)子下的表達(dá)量高于強(qiáng)啟動(dòng)子[14]，低溫誘導(dǎo)的表達(dá)量高于高溫誘導(dǎo)[15]就證實(shí)了這一觀點(diǎn)。培養(yǎng)溫度升高加快了菌體的生長(zhǎng)速率，有可能導(dǎo)致質(zhì)粒被丟失。大腸桿菌生長(zhǎng)速率降低，有利于工藝控制，同時(shí)乙酸及其它抑制性副產(chǎn)物的形成也隨之減少。生長(zhǎng)期采用37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)期采用35℃培養(yǎng)，有利于中性木聚糖酶的表達(dá)。

圖7 不同的誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度對(duì)大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.7 Effects of different culture temperature during induction period on xylanase production byE.colifermentation

2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，以木聚糖酶活為考察指標(biāo)，選擇對(duì)酶活影響較大的比生長(zhǎng)速率、溶氧和pH，進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其結(jié)果與分析見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表1可知，各因素對(duì)木聚糖酶活力的影響大小為溶氧＞比生長(zhǎng)速率＞pH，最優(yōu)的發(fā)酵條件組成為A2B2C3。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為接種量為10%，發(fā)酵過程中溶氧值為30%，生長(zhǎng)期控制pH值為7.0、生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為37℃、生長(zhǎng)期比生長(zhǎng)速率為0.12 h-1，誘導(dǎo)期pH值為6.8、誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為35℃、誘導(dǎo)期比生長(zhǎng)速率為0.14 h-1，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD600nm值=30）時(shí)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在此發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，酶活力可達(dá)149 000 IU/mL。一般認(rèn)為菌體密度高于50 g/L即為高密度發(fā)酵，根據(jù)材料方法1.3.3的計(jì)算方法，獲得的菌體濃度可達(dá)65.90 g/L，達(dá)到高密度發(fā)酵水平。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了大生產(chǎn)中接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、誘導(dǎo)時(shí)間、比生長(zhǎng)速率等培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)及木聚糖酶酶活的影響，并在此基礎(chǔ)上選擇比生長(zhǎng)速率、溶氧和pH，進(jìn)行了正交試驗(yàn)。優(yōu)化后的發(fā)酵條件如下：接種量為10%，發(fā)酵過程中溶氧值為30%，生長(zhǎng)期控制pH值為7.0、生長(zhǎng)期培養(yǎng)溫度為37℃、生長(zhǎng)期比生長(zhǎng)速率為0.12 h-1，誘導(dǎo)期pH為6.8、誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為35℃、誘導(dǎo)期比生長(zhǎng)速率為0.14 h-1，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期（OD600nm值=30）時(shí)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。優(yōu)化后，放罐酶活力可達(dá)149 000 IU/mL。本研究為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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Optimization of high density fermentation conditions ofEscherichia colifor xylanase production

LIU Guofeng1,2
（1.Hunan Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Yueyang 414000,China;2.Shandong Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Zoucheng 273500,China）

The fermentation conditions,such as,inoculum,pH value,culture temperature,dissolved oxygen,induction time and specific growth rate in the production of xylanase industry were optimized by single factor experiments.On the basis of the single factor experiments,the specific growth rate,dissolved oxygen and pH were optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum fermentation conditions were inoculum 10%,dissolved oxygen 30%during fermentation,growing period pH value 7.0,growing period culture temperature 37℃,growing period specific growth rate 0.12 h-1,induction period pH value 6.8,induction period culture temperature 35℃and induction period specific growth rate 0.14 h-1.The induction medium was added in the middle of logarithmic phase （OD600nm=30）.After optimization,the highest xylanase activity could be up to 149 000 IU/ml.The study improved the xylanase activity under the conditions of mass production,which provided guidance for the industrial production of xylanase.

Escherichia coli;xylanase;fermentation conditions;optimization

TS201.3

0254-5071（2017）12-0063-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.013

2017-08-20

科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（14C26213701984）

劉國(guó)峰（1980-），男，工程師，碩士，研究方向?yàn)槊腹こ獭?/p>